Determinación de la membrana plasmática particionado en proteínas asociadas periféricamente

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, incluido el desentrañamiento de las vías de señalización celular. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es que en realidad no requiere ningún enfoque microscópico sofisticado. También es muy rápido y, por lo tanto, utilizable para la observación en tiempo real de la distribución de proteínas en las células.

La evaluación y cuantificación de la partición de la membrana de la proteína asociada periféricamente es complicada debido a la difracción de la luz que provoca una mezcla de la membrana plasmática y la fluorescencia citoplasmática bajo el microscopio. Comience este procedimiento con la preparación del material biológico como se describe en el protocolo de texto. Teñir el material preparado con el colorante FM 4-64 aplicando un protocolo de tinción que sea apropiado para el material estudiado.

Para las células BY-2 de tabaco, tiñir 200 microlitros de suspensión celular con 0,2 microlitros de solución FM 4-64 de 10 milimolares en dimetilsulfóxido. Para capturar una sección confocal ecuatorial por célula, configure un escaneo secuencial de dos canales para el cromóforo utilizado como etiqueta de proteína y para FM 4-64. También establece una resolución óptica más alta.

Un ejemplo de configuración es un objetivo de inmersión en aceite de 63 veces con una apertura numérica de 1,3 y un tamaño de imagen de 1.024 por 1.024 píxeles. Instale Fiji ImageJ Distribution y el periférico macro necesario. En Fiji, seleccione complementos, luego macros, luego instale en el menú principal y especifique la ruta al archivo descargado con el periférico de macros ImageJ.

Instale el software R Project y los paquetes necesarios. Ejecute la interfaz gráfica de usuario de R, seleccione paquetes, luego instale paquetes en el menú principal y especifique el repositorio más cercano, así como el paquete ggplot2 para la instalación. Descargue el periférico del paquete R.

Instálelos seleccionando paquetes y, a continuación, instale los paquetes desde archivos locales. Procesar las imágenes confocales del marcador citoplasmático. Para ello, importe las imágenes a Fiyi utilizando plugins, luego bioformatos, luego importador de bioformatos desde el menú de Fiyi con la configuración predeterminada.

Ejecute la macro de opciones de importación para una configuración de análisis. Active la macro seleccionando el mismo elemento después de hacer clic en la herramienta de menú menú de proteínas periféricas. Defina el valor adecuado en el campo radio de desenfoque gaussiano píxel.

Esto influye en el suavizado de la imagen y la reducción de ruido. Un valor bajo es suficiente y no causa ninguna pérdida de información de la imagen. Ahora establezca un valor en el píxel de ancho de línea de perfil de campo.

Una línea más gruesa provoca un mayor suavizado de las curvas del perfil. Se recomienda un valor predeterminado de 10 píxeles. Establezca un título de imagen, analizando por la definición de delimitadores de muestra y elementos exportados.

Haga clic en Aceptar. Compruebe el análisis del título en la siguiente ventana de diálogo y haga clic en Aceptar o Atrás para restablecer. A continuación, realice una selección lineal a través de la región de la membrana plasmática en las imágenes procesadas y mida los perfiles de fluorescencia. Para ello, seleccione la línea recta de la herramienta Fiyi en la barra de herramientas Fiyi.

Haga clic en la imagen y arrastre una línea a través de la región de la membrana plasmática. La línea debe comenzar en el espacio extracelular y debe ser perpendicular a la membrana plasmática. Elija regiones con una capa más gruesa y homogénea de citoplasma cortical.

La longitud óptima de la selección lineal es de cinco a 10 micras. Ejecute la macro de perfil de toma haciendo clic en la herramienta de perfil de toma de la barra de herramientas Fiji. Se realizará la medición automática de los perfiles de fluorescencia en ambos canales y los datos se mostrarán en la ventana de resultados.

De acuerdo con la variabilidad de la señal individual, tome números representativos de los perfiles para cada celda. Ejecute la macro de datos de perfil de trazado para la visualización gráfica de los perfiles medidos. Establezca el parámetro en la ventana de diálogo de la macro invocada.

Mantenga la casilla de verificación usar filtrado para datos de entrada sin seleccionar. Especifique si el trazado debe crearse a partir de datos recientes en la ventana de resultados de un solo archivo CSV o de todos los archivos CSV de un directorio especificado haciendo clic en el botón de opción correspondiente. Especifique los factores de agrupación que se utilizarán para el trazado seleccionando las casillas de verificación adecuadas.

Seleccione el factor I si todos los perfiles deben visualizarse en trazados únicos. Mantenga las casillas de verificación sin seleccionar si todos los datos se deben trazar en una sola gráfica. Haga clic en Aceptar. Especifique la ruta y el nombre del archivo para guardar los resultados o para la importación de datos final en la siguiente ventana de diálogo.

Confirme el análisis haciendo clic en Aceptar en las ventanas de diálogo, que muestran el código R realizado. Ejecute la macro de configuración de filtrado de perfiles si algunos perfiles trazados tienen señales excesivas en el espacio extracelular o intracelular. A continuación, configure los parámetros en la ventana de diálogo de la macro invocada.

Para cada canal, establezca el umbral de intensidad adecuado en el archivo, elimine las mediciones con una señal extracelular o intracelular excesiva. Especifique la región en la que se aplicará el umbral de intensidad en el campo en coordenadas X inferiores o mayores que y, a continuación, haga clic en Aceptar. Vuelva a ejecutar la macro de datos de perfil de trazado con la casilla de verificación Usar filtrado para la entrada de datos seleccionada. Ahora agregue los datos del archivo guardado anteriormente.

Asegúrese de que todos los perfiles aberrantes se hayan eliminado correctamente, de lo contrario, mejore los parámetros de filtrado. Ejecute la macro create model para crear un modelo de la membrana plasmática y la distribución de fluorescencia del citoplasma en función de los datos de calibración. Después de configurar los parámetros en la ventana de diálogo de la macro invocada como se detalla en el protocolo de texto, haga clic en Aceptar. Especifique la ruta y el nombre del archivo de entrada en las siguientes ventanas de diálogo y confirme el análisis haciendo clic en Aceptar en la ventana de diálogo que muestra el código R realizado.

A continuación, procese las imágenes de las células que expresan la proteína de interés. Importe las imágenes y configure el análisis como antes. El suavizado y el ancho de línea deben ser idénticos.

Proceda a medir los perfiles. Compruebe la precisión de los perfiles mediante el trazado y establezca el filtrado si lo desea como se ha descrito anteriormente. Ejecute la macro calcular distribución para el cálculo de una partición de proteínas entre la membrana plasmática y en el citoplasma.

Especifique los datos de entrada y los orígenes del modelo y, finalmente, establezca un filtrado de datos. Mantenga activada la casilla de verificación para eliminar resultados con una variabilidad residual mayor que si se desea un filtrado de resultados. Especifique el umbral de la variabilidad residual máxima permitida que puede explicarse sin explicación por la descomposición de la señal de la medición de perfil individual.

Seleccione factores de agrupación de muestra, que se pueden utilizar para crear un diagrama de caja. Haga clic en Aceptar, especifique las rutas de entrada o salida y confirme el análisis haciendo clic en Aceptar en la ventana de diálogo que muestra el código R realizado. Aquí se muestra una imagen de una célula teñida con FM 4-64 que expresa una proteína vegetal, que está asociada con la membrana plasmática a través de la N-miristoilación y la interacción electrostática con los fosfoinositidos.

Estas interacciones fueron perturbadas experimentalmente por la wortmannina. La importancia de la N-miristoilación se probó mediante la mutación en glicina en la segunda posición del aminoácido que sirve como sitio de N-miristoilación. El efecto de la eliminación de ambas capacidades de unión a la membrana plasmática se probó mediante el truncamiento del dominio N-terminal de la proteína.

El diagrama de caja resultante muestra una disminución de la afinidad de la membrana plasmática después de la mutación del sitio de N-miristoilación y después del tratamiento con fármaco. Su efecto mutuo es comparable al efecto de eliminar el dominio N-terminal. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo llevar a cabo los pasos principales del análisis en un orden adecuado y cómo configurar sus parámetros.

Después de este análisis, se puede realizar un método estadístico como el ANOVA para la evaluación estadística de los datos obtenidos. Aunque este método se desarrolló para células de suspensión de plantas, también se puede aplicar a otras células o tejidos con membranas plasmáticas lisas y claramente distinguibles.