Métodos para el descubrimiento de nuevos compuestos modular un Receptor del ácido Gamma - Aminobutírico tipo una neurotransmisión
16 de agosto de 2018
Aquí, presentamos protocolos para descubrir compuestos activos en los receptores GABAA , de la Unión a la fisiología y la farmacología.
El objetivo general de este vídeo es ilustrar una cascada de cribado que permita el descubrimiento de nuevos ligandos del receptor GABA-A. La ventaja de utilizar la unión a radioligandos, el registro electrofisiológico en ovocitos de xenopus y en cortes de cerebro de roedores de manera literaria es que se puede mejorar el perfil del compuesto. En última instancia, se identifican compuestos de subtipo potentes, selectivos y eficaces.
Esta demostración será realizada por Kumico Kambara y Jenna Tognaccini, así como por Sonia y Daniel Bertrand de HiQScreen y Marie Claire Pflimlin de Roche. Inyecte de 10 a 50 nanolitros de la solución que contiene plásmido utilizando una aguja de microinyección de vidrio con un diámetro de punta de hasta 100 micrómetros montada en un micromanipulador equipado con un sistema de expulsión de presión o con un sistema de inyección automatizado. Para comenzar este procedimiento, mantenga los ovocitos a 17 grados centígrados para evitar la expresión de proteínas de choque térmico.
Guarde la microplaca en un área de almacenamiento con control térmico. A continuación, disuelva los compuestos de prueba, que dieron positivo en el ensayo de unión en OR2, a 0,1 y 1000 micromolares para registros electrofisiológicos y deséchelos en una placa de polipropileno de fondo plano de 96 pocillos. Para realizar el registro de pinzas de voltaje de dos electrodos, coloque una placa que contenga los ovocitos en el sistema automatizado.
Programe el sistema de registro automatizado utilizando la interfaz basada en iconos con este esquema para la determinación adecuada de la relación entre la actividad de concentración. Para el ajuste de la curva, utilizando la curva de activación de concentración ilustrada, trace la amplitud de la corriente en función del logaritmo de la concentración del agonista. Para el registro electrofisiológico, mantenga el cerebro en una solución de dACSF burbujeada con carbógeno a temperatura ambiente.
Luego, disecciona la formación del hipocampo izquierdo con una espátula fina. Posteriormente, se seccionan portaobjetos transversales de 400 micrómetros de espesor desde la parte media del hipocampo con un picador de tejidos. Con un pincel para pintar, transfiera las rodajas a la cámara de grabación y manténgalas a temperatura ambiente durante 45 minutos.
A continuación, perfundir las rodajas con rACSF burbujeado con carbógeno a 35 grados centígrados y a una velocidad de 1,5 mililitros por minuto. Para registrar un solo pico poblacional, coloque un trozo de cerebro en la cámara montada en el microscopio. Perfundir la rebanada con rACSF a una velocidad de tres mililitros por minuto.
Con el extractor de pipetas, extraiga una micropipeta de vidrio de borosilicato con una resistencia de unos dos megaohmios. Llene la micropipeta con una solución que contenga dos molares de cloruro de sodio y colóquela en el soporte de la pipeta. Coloque la micropipeta de registro en el estrato piramidal en la región CA1 del corte del hipocampo utilizando el micromanipulador adecuado.
A continuación, coloque un electrodo bipolar de platino iridio aislado en el soporte del micromanipulador izquierdo. Coloque el electrodo de estimulación en los colaterales de Schaffer en la región CA1 del corte del hipocampo utilizando el micromanipulador izquierdo. Usando el generador de estímulos, administre un pulso de corriente al electrodo de estimulación cada 30 segundos y aumente gradualmente la fuerza de la estimulación hasta que aparezca un pico de población.
Ajuste la fuerza del estímulo para evocar un pico de población correspondiente al 45% de la amplitud máxima que se puede obtener. Para realizar la inhibición de pulso emparejada, administre dos pulsos de corriente al electrodo de estimulación cada 30 segundos utilizando el generador de estímulos. Establezca la intensidad del estímulo para evocar un pico de población correspondiente al 45% de la amplitud máxima.
Para probar los compuestos, haga diluciones de los compuestos que se van a probar en ACSF de modo que la concentración final de DMSO no sea superior al 0,1%Agregue DMSO a la solución de control a la misma concentración que la de la solución compuesta. Registre un pico de población de pulso único o emparejado evocado por las estimulaciones colaterales de Schaffer cada 30 segundos durante al menos 30 minutos. La forma del pico poblacional debe ser estable durante este período de referencia.
A continuación, prepare un vaso de precipitados con rACSF carbogenado que contenga una concentración fija del compuesto que se va a analizar y perfunda el corte del hipocampo con la solución durante el registro de los picos de población de pulsos simples o pareados. Además, evalúe la recuperación del efecto compuesto mediante la perfusión del corte con rACSF carbogenado sin el compuesto. Aquí se muestra una representación esquemática de una rebanada de hipocampo de rata, las colaterales de Schaffer se originan en los axones de las células piramidales CA3 que se proyectan sobre la arborización dendrítica de las neuronas piramidales CA1.
Se colocaron micropipetas en el estrato piramidal para registrar los picos de población y en el estrato radiado para el registro dendrítico de los potenciales postsinápticos excitatorios de campo. El electrodo de estimulación se colocó dentro de las colaterales Schaffer. Esta figura muestra los picos de población evocados por los estímulos emparejados aplicados a través del mismo electrodo estimulante en un intervalo de 20 milisegundos.
La respuesta de la población al segundo estímulo es de menor amplitud que la de la respuesta al primer estímulo. Se registraron picos poblacionales en ausencia y presencia de beta CCM, un NAM no selectivo del receptor GABA A. Beta CCM mejoró la amplitud del segundo pico poblacional al bloquear parcialmente cualquier inhibición gabaérgica de realimentación.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la farmacocinética, la ocupación del receptor y la eficacia in vivo y la farmacología de seguridad para responder a preguntas adicionales como el potencial de desarrollo clínico de los compuestos identificados.
Resumen
Este estudio presenta protocolos para el descubrimiento de compuestos que interactúan con los receptores GABA A, utilizando una cascada de cribado que combina técnicas de unión con radioligandos y electrofisiológicas. El enfoque tiene como objetivo identificar compuestos selectivos y eficaces mediante pruebas iterativas en ovocitos de Xenopus y cortes cerebrales de roedores.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Farmacología
- Electrofisiología
Antecedentes
- Comprender la actividad de los receptores GABA A es fundamental para aplicaciones farmacológicas.
- Los compuestos que interactúan con estos receptores pueden tener efectos terapéuticos sobre trastornos neurológicos.
- Los registros electrofisiológicos proporcionan información sobre el impacto fisiológico de estos compuestos.
- La selección iterativa mejora la optimización del perfil de los compuestos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un enfoque sistemático para descubrir nuevos ligandos para los receptores GABA A.
- Mejorar las capacidades de los ensayos de unión y los análisis electrofisiológicos.
- Facilitar la identificación de compuestos con posible relevancia clínica.
Métodos Utilizados
- La investigación emplea preparaciones de cortes cerebrales ex vivo y ovocitos de Xenopus para la prueba de compuestos.
- Se realizan grabaciones electrofisiológicas para medir las respuestas en cortes cerebrales y ovocitos, evaluando la actividad de los ligandos.
- El estudio describe cronogramas específicos para procedimientos como el mantenimiento de ovocitos y la perfusión de compuestos.
- Se describen técnicas detalladas de inyección para la entrega de plásmidos en ovocitos y configuraciones de grabación para las preparaciones de cortes.
Resultados principales
- El estudio describe la identificación exitosa de compuestos que modular selectivamente la actividad del receptor GABA A.
- Grabaciones electrofisiológicas demostraron cambios en las amplitudes del potencial de población en respuesta a la aplicación del ligando.
- Se obtuvieron conocimientos sobre los roles mecanicistas de la inhibición del receptor GABA A y los efectos de la dosis del compuesto.
- Validación de los resultados mediante métodos estadísticos rigurosos para establecer la fiabilidad de los hallazgos.
Conclusiones
- Este estudio permite la identificación de ligandos selectivos del receptor GABA A con usos terapéuticos potenciales.
- Destaca la importancia de combinar ensayos de unión con grabaciones fisiológicas para la evaluación de compuestos.
- Los hallazgos contribuyen a una mejor comprensión de las interacciones ligando-receptor y sus implicaciones para el desarrollo de fármacos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta cascada de cribado permite la evaluación iterativa de ligandos del receptor GABAA en sistemas recombinantes y nativos, apoyando la validación del blanco y la optimización de compuestos iniciales en el descubrimiento de fármacos para el sistema nervioso central. Al integrar la unión con radioligandos, la electrofisiología en ovocitos y las grabaciones en cortes cerebrales, el método aumenta la confianza predictiva sobre la selectividad y eficacia de los compuestos. El flujo de trabajo facilita la eliminación temprana de riesgos asociados a hipótesis mecanicistas e informa la priorización de carteras para terapéuticas dirigidas al receptor GABAA.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Evalúa hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de la unión del compuesto y la actividad funcional en subtipos del receptor GABAA.
- Valor operativo: Permite el perfilado de selectividad por subtipos mediante la unión de radioligandos en membranas recombinantes que expresan los principales subtipos del receptor GABAA.
- Valor predictivo: Facilita la identificación de compuestos prometedores al relacionar la afinidad de unión con la modulación funcional en sistemas de expresión heterólogos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (por ejemplo, amplitud de la corriente, amplitud del potencial de población) para la caracterización de la relación dosis-respuesta.
- Valor operativo: Estandariza las condiciones del ensayo en ovocitos de Xenopus y cortes cerebrales de roedores para la evaluación reproducible de compuestos.
- Escalabilidad: Facilita la preparación para cribados mediante sistemas de registro automatizados y formatos de placas de 96 pocillos para el perfilado electrofisiológico.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los datos de receptores recombinantes con la fisiología de receptores nativos en cortes de hipocampo de roedor, apoyando la validación del sistema en contextos relacionados con enfermedades.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Clarifica los efectos del compuesto sobre la excitabilidad neuronal mediante ensayos de inhibición por pares de pulsos y recuperación del potencial de espiga poblacional.
- Alineación con Modelos Preclínicos: Utiliza registros extracelulares en circuitos neuronales definidos para evaluar la actividad del compuesto en un contexto fisiológicamente relevante.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método sitúa el cribado de compuestos dentro del continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica, permitiendo la refinación iterativa de los perfiles de ligandos.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de variables (por ejemplo, subtipo de receptor, concentración del compuesto) para aclarar las relaciones estructura-actividad.
- Selección: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante protocolos estandarizados de perfusión, registro y aplicación de compuestos en ovocitos y cortes.
- Análisis: Genera curvas de concentración-respuesta y métricas de recuperación que permiten la comparación entre condiciones y el modelado de relaciones estructura-actividad.
- Investigación Traductiva: Conecta hallazgos in vitro con respuestas en tejidos nativos, apoyando decisiones de avance con ajuste de riesgo.
- Reutilización Empresarial: Establece una cascada de selección reutilizable, adaptable a otros objetivos de canales iónicos además de los receptores GABAA.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en el blanco al correlacionar datos de unión con resultados funcionales en múltiples sistemas experimentales.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante el control del almacenamiento de ovocitos, las tasas de perfusión y los parámetros de estimulación.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al identificar compuestos potentes, selectivos por subtipos y eficaces en las primeras etapas de la cascada.
- Impacto en la cartera: Permite una priorización ajustada al riesgo al filtrar compuestos según su afinidad de unión, potencia electrofisiológica y actividad en receptores nativos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular (aislamiento de ARNm, microinyección), electrofisiología (clampaje de voltaje con dos electrodos, grabaciones de campo) y preparación de tejidos (mantenimiento de cortes de hipocampo).
- Depende de instrumentación que incluye micromanipuladores, sistemas automatizados de grabación, generadores de estímulos y sistemas de perfusión para ovocitos y cortes cerebrales.
- Necesita una estandarización entre equipos en la dilución de compuestos, controles con DMSO y el cronograma de perfusión para garantizar la consistencia de los datos entre laboratorios.
- Implica consideraciones de adaptación al transferir protocolos desde ovocitos de Xenopus a células HEK 293 u otros sistemas de expresión.
- Las limitaciones prácticas incluyen la habilidad técnica necesaria para la microinyección, el mantenimiento de la viabilidad de los cortes y la obtención de grabaciones estables antes de la aplicación del compuesto.
