Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente
7 de septiembre de 2018
En este artículo se describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipo de inmunoglobulina (Ig) T dependientes y T independientes en ratones usando ELISA. Este método se usa solo o en combinación con el flujo cytometry permitirá a los investigadores identificar las diferencias en las respuestas de isotipo de Ig mediada por células B en ratones después de la inmunización de antígenos T dependientes y T independientes.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre las respuestas de anticuerpos dependientes e independientes inducidas por la inmunización con antígenos, así como la activación de las células B y las reacciones del centro germinal. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona mediciones fiables y cuantitativas de la respuesta del isotipo Ig con una comparación directa de la activación de las células B y la inmunidad humoral en ratones. Para la inmunización con polisacáridos TNP, cargue una jeringa de insulina de mililitros por ratón con 100 microlitros de solución de antígeno recién preparada e inserte la aguja en el cuadrante inferior derecho de cada animal en un ángulo de aproximadamente 30 grados para evitar la inyección en el órgano inferior.
Cuando todos los ratones hayan sido inyectados, devuelva a los animales a sus jaulas para que los alojen en una instalación específica libre de patógenos. En los puntos de tiempo experimentales apropiados, se recogen de 150 a 200 microlitros de sangre de cada animal inmunizado mediante sangrado retroorbitario y se permite que las muestras se coagulen a temperatura ambiente durante una o dos horas. Al final de la incubación, centrifugar las muestras de sangre coaguladas y transferir el suero transparente de la parte superior de cada coágulo de sangre a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros.
Después de una segunda centrifugación para eliminar cualquier coágulo de sangre residual, transfiera 50 microlitros de suero a tubos de microcentrífuga estériles individuales de 1,5 mililitros para almacenarlos a menos 80 grados centígrados. Antes de la siembra, recubra las inmunoplacas individuales de 96 pocillos con la concentración adecuada de anticuerpos capturadores específicos del isotipo Ig de ratón para el isotipo de Ig sérico total TNP-38BSA antígeno para el isotipo de Ig específico de TNP o antígeno TNP-3BSA para el isotipo de Ig específico de TNP de alta afinidad e incube las placas recubiertas durante la noche a cuatro grados Celsius. A la mañana siguiente, lave las placas dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado por pocillo.
Desechar el tampón de lavado y secar las placas con palmaditas en una pila de toallas de papel después de cada lavado. A continuación, bloquee las placas con 200 microlitros de tampón de bloqueo por pocillo para una incubación de una hora a temperatura ambiente. Mientras se bloquean las placas, prepare las diluciones estándar y séricas apropiadas y el tampón de bloqueo en una placa separada de 96 pocillos sin tratar a 150 microlitros por pocillo, según se indique.
A continuación, lave la placa ELISA con tampón de lavado, como se ha demostrado, y añada 100 microlitros de cada patrón de isotipo de Ig diluido y muestra de suero a los pocillos apropiados de la placa ELISA. Después de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados, lave las placas como se ha demostrado y agregue 100 microlitros de un anticuerpo específico de isotipo conjugado con fosfatasa alcalina apropiada diluido en tampón de bloqueo a cada pocillo para una incubación de una a dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las placas y agregue 100 microlitros de solución de sustrato recién preparada a cada pocillo.
Monitorear la reacción a medida que se desarrolla durante los próximos minutos a temperatura ambiente. Cuando la reacción sea lo suficientemente robusta como para analizarla, coloque la placa en un lector de microplacas y haga clic en la configuración para establecer la longitud de onda en 405 nanómetros. Haga clic en Aceptar y, a continuación, haga clic en plantilla para asignar los pozos en blanco, estándar y desconocidos apropiados de acuerdo con la configuración de la placa de 96 pocillos.
Luego, cuando el estándar más concentrado alcance una densidad óptica de aproximadamente uno, 1,5, dos y 2,5, haga clic en leer para leer la placa y guardar el archivo de datos resultante después de cada análisis. En ausencia de inmunización, se observa un aumento en los niveles séricos basales de IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA en ratones asociados al receptor de TNF específico de células B o B-TRAF3 knockout, en comparación con los animales de control B-TRAF3 del mismo sexo y edad. Siete días después de la inmunización con polisacárido TNP o TNP-KLH, como se acaba de demostrar, el análisis de las respuestas del isotipo Ig independiente del timo a la inmunización revela niveles significativamente más altos de IgG3 específicos de TNP independientes del timo, así como niveles elevados de IgG2b específicos de TNP dependientes del timo en ratones knockout TRAF3 específicos de células mieloides en comparación con los controles de compañero de camada.
Además, la evaluación de las respuestas primarias y de memoria de los ratones dependientes del timo a la inmunización con TNP-KLH indica la presencia de respuestas primarias de IgM dependientes del timo parcialmente disminuidas y respuestas primarias y de memoria de IgG1 defectuosas en ratones knockout TRAF3 específicos de células T. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que ELISA tiene límites de detección que generalmente están definidos por el rango lineal de las curvas estándar y, por lo tanto, es posible que se requieran múltiples diluciones de su muestra. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos complementarios como la citometría de flujo o el punto L para obtener una comprensión completa de las respuestas de anticuerpos en un entorno experimental determinado.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipos de inmunoglobulina (Ig) dependientes e independientes de linfocitos T en ratones mediante ELISA. El método permite a los investigadores identificar diferencias en las respuestas de isotipos de Ig mediadas por linfocitos B tras la inmunización con antígeno.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Respuestas de anticuerpos
- Activación de linfocitos B
Antecedentes
- Comprender las respuestas de anticuerpos dependientes e independientes de linfocitos T es fundamental en inmunología.
- La caracterización de las respuestas de isotipos de inmunoglobulinas ayuda a estudiar la inmunidad humoral.
- La citometría de flujo puede complementar al ELISA para un análisis detallado.
- Mediciones confiables de las respuestas de isotipos de inmunoglobulinas son esenciales para la investigación.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo para medir las respuestas de isotipos de Ig en ratones.
- Comparar la activación de linfocitos B en respuesta a diferentes antígenos.
- Mejorar la comprensión de las respuestas inmunitarias en diversos contextos.
Métodos Utilizados
- ELISA para cuantificar las respuestas de isotipos de Ig.
- Citometría de flujo para analizar la activación de células B.
- Inyección de solución de antígeno en ratones para inmunización.
- Recolección de muestras de sangre para análisis de suero.
Resultados principales
- Se lograron mediciones cuantitativas de las respuestas de isotipo de Ig.
- Se observaron diferencias en la activación de linfocitos B según el tipo de antígeno.
- El método resultó confiable para el estudio de la inmunidad humoral.
- Se obtuvieron muestras de suero claras para análisis posteriores.
Conclusiones
- El protocolo es eficaz para caracterizar las respuestas de anticuerpos.
- Proporciona información sobre la inmunidad mediada por linfocitos B.
- Este método puede aplicarse a diversos estudios inmunológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite a los investigadores de biofármacos analizar cuantitativamente las respuestas de isotipos de inmunoglobulinas dependientes e independientes del timo en modelos murinos, proporcionando una comprensión mecanicista de la activación de linfocitos B y la inmunidad humoral. Al ofrecer mediciones de ELISA fiables y específicas para cada isotipo, apoya la validación de objetivos y la reducción predictiva de riesgos en el desarrollo de vacunas e inmunomoduladores. El método mejora la continuidad traslacional cuando se combina con ensayos complementarios como la citometría de flujo, aportando información para decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de respuestas de IgM específica para antígeno y de isotipos cambiados como IgG/IgA/IgE frente a estímulos dependientes e independientes del timo.
- Valor operativo: Proporciona mediciones estandarizadas y reproducibles de anticuerpos en suero que aclaran el compromiso funcional del objetivo y la actividad biológica de candidatos inmunomoduladores.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al distinguir clases mecanicistas de inmunógenos según los patrones de cambio de isotipo y la cinética de la respuesta de memoria.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Genera sistemas biológicos validados (sueros de ratón) con resultados cuantitativos de isotipos de Ig adecuados para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Reproducibilidad: Ofrece procedimientos estandarizados de ELISA con requisitos definidos de dilución y controles de rango lineal, asegurando la consistencia del ensayo entre experimentos.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma para el análisis comparativo de formulaciones de antígenos, adyuvantes o modelos genéticos en campañas de cribado de inmunogenicidad.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Permite la evaluación de respuestas específicas frente a antígenos en modelos que reflejan la inmunidad humoral humana, apoyando la alineación de biomarcadores traslacionales.
- Continuidad preclínica: Conecta el perfilado de isotipos de inmunoglobulinas en fases tempranas del descubrimiento con la validación preclínica mediante muestreos longitudinales de suero antes y después de la inmunización.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orienta los criterios de avance al identificar defectos en el cambio de isotipo (por ejemplo, IgG1) o en las respuestas de memoria asociadas a vías celulares específicas (por ejemplo, TRAF3 en células T).
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y la evaluación preclínica, especialmente para inmunomoduladores y vacunas, donde el perfilado de isotipos predice resultados funcionales.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la clarificación de rutas al vincular la exposición al antígeno con firmas definidas de isotipos de Ig (por ejemplo, TI IgG3 frente a TD IgG2b).
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas listas para ensayos con alta especificidad y sensibilidad, permitiendo la comparación fiable del potencial inmunogénico entre diferentes candidatos.
- Análisis: Ofrece mediciones basadas en densidad óptica a 405 nm que se interpolan a partir de curvas estándar, lo que permite la comparación estadística entre grupos de títulos de anticuerpos.
- Investigación Traducional: Se alinea con la continuidad preclínica al permitir el seguimiento longitudinal de respuestas primarias y de memoria, fundamental para la evaluación de candidatos vacunales.
- Reutilización Empresarial: Establece una herramienta inmunológica de perfilado reutilizable, aplicable en múltiples proyectos que involucran respuestas mediadas por linfocitos B.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor Científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de activación de linfocitos B.
- Valor Operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante protocolos definidos de dilución de suero y pasos de optimización de ELISA.
- Valor Estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance/no avance al vincular los perfiles de isotipos con resultados inmunitarios funcionales, reduciendo el riesgo biológico en etapas tardías.
- Impacto en el Portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos según su capacidad para inducir respuestas de conmutación de isotipo y respuestas de memoria deseadas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunología murina, manejo de suero y optimización de ELISA para garantizar una cuantificación precisa dentro del rango lineal de las curvas estándar.
- Depende del acceso a lectores de microplacas, incubadoras, centrífugas y instalaciones estériles de cultivo celular para el procesamiento de suero y la realización del ensayo.
- Necesita estandarización entre equipos en cuanto al momento de recolección de muestras, técnicas de sangrado (por ejemplo, retro-orbitario) y condiciones de almacenamiento (−80 °C) para mantener la integridad de los datos.
- Requiere consideraciones de adaptación al extenderse a diferentes cepas de ratón, antígenos (por ejemplo, TNP-KLH frente a TNP-polisacárido) o sistemas de adyuvantes (alumbre frente a PBS).
- Limitación práctica: Suele ser necesario realizar diluciones seriadas de las muestras para evitar la saturación de la señal y asegurar una interpolación precisa a partir de las curvas estándar, lo que aumenta el tiempo de manipulación.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
2,4,6-Trinitrophenyl (TNP)-polysaccharide and TNP-keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Immunization and Serum Preparation
1:54
Enzyme-linked Immunosorbent Analysis (ELISA)
4:17
Results: Representative Thymus-independent (TI) and Thymus-dependent (TD) Ig Isotype responses to TNP-polysaccharide and TNP-KLH Immunization
5:36
Conclusion
