Name: Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprende a caracterizar respuestas de isotipos de inmunoglobulina dependientes e independientes del timo en ratones mediante ELISA. Este protocolo permite medir cuantitativamente la activación de células B y la inmunidad humoral.

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Este estudio fue apoyado por los institutos nacionales de becas en salud CA158402 R01 (P. Xie) y R21 AI128264 (P. Xie), el Ministerio de defensa conceder W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), un premio de piloto del cáncer Institute de New Jersey a través de la concesión número P30CA072720 del Instituto Nacional del cáncer (P. Xie), una subvención Biomédica de Busch (P. Xie), una beca Stollar Victor (Lalani a.) y Anne B. y James B. Leathem beca (S. Zhu).

Este protocolo sigue las directrices del Comité de ética institucional de investigación animal de la Universidad de Rutgers. Todos los ratones se utilizan con arreglo a las directrices de los NIH y bajo un protocolo animal aprobado por la institucional Animal cuidado y uso.
1. preparación de ratones y recogida de sueros de ingenuo ratón
<ol><li>Mantenga todos los ratones para los experimentos de inmunización en un específico Animalario libre de patógenos.</li>
	<li>Nocaut de sexo-emparejado, joven adulto (8-12 semanas) de uso y littermate control de ratones que comparten los mismos padres y jaulas para los estudios de inmunización.</li>
	<li>Plan de vacunación los horarios de recogida de suero como se muestra en la figura 1.</li>
	<li>La cosecha ingenuo suero de cada ratón en 7 días (-7 días) antes de la vacunación. Seguir los retro-orbitales sangrado suero preparación procedimientos y como se detalla a continuación en el paso 4.</li>
</ol>2. elaboración de PNT-polisacárido (un antígeno de TI) y PNT-KLH (un antígeno de TD)
<ol><li>Disolver los polvos de antígeno en PBS estéril (pH 7,4) a hacer 0,5 mg/mL 1 mg/mL de las soluciones madre PNT-KLH y PNT-polisacárido. Alícuota cada antígeno común solución en tubos estériles de microcentrífuga a 0,5 mL/tubo y mantener las alícuotas a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Evitar congelar y descongelar las alícuotas de antígeno múltiples.</li>
	<li>En el día de la inyección, calcular el volumen de PNT-polisacárido (50 μg/100 μl/ratón) o PNT-KLH (100 μg/100 μl/ratón) necesarios según el número de ratones que se inyecta. Descongelar el número apropiado de PNT-polisacárido o PNT-KLH alícuotas a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Para la inyección de PNT-KLH, primero diluir el coadyuvante de alumbre (40 mg/mL) y 3 volúmenes de PBS estéril a una concentración final de 10 mg/mL. Asegúrese de que la mezcla de coadyuvante de alumbre es bien suspendida antes de la dilución.</li>
	<li>Combinar un volumen igual de 10 mg/mL alumbre coadyuvante de la mezcla del paso 2.3 y la solución de PNT-KLH descongelada (1 mg/mL) en un tubo de polipropileno de 5 mL y mezclar bien, incubar a 37 ° C durante 30 minutos preparar este PNT-KLH/alumbre la mezcla recién antes de la inyección.</li>
</ol>3. inmunización de ratones
<ol><li>Realizar la inyección intraperitoneal (i.p.) de PNT-polisacárido o PNT-KLH/alumbre para inmunizar los ratones con jeringas de insulina de 1 mL en un gabinete de bioseguridad. Inserte la aguja en ángulo de aproximadamente 30° preferentemente en el cuadrante inferior derecho de cada ratón para evitar la inyección en los órganos internos.</li>
	<li>Inyección i.p. 100 μl de PNT-polisacárido por ratón en el día 0 para la inmunización de TI Ag (figura 1A).</li>
	<li>En el día 0 para la vacunación de TD Ag inyectar la i.p. 200 μL de la mezcla de PNT-KLH/alumbre (recién preparada en el paso 2.4) por ratón. Repita la misma inyección el día 21 como una vacunación de refuerzo para estudios de memoria (figura 1B).</li>
	<li>Después de la inyección, retomar cada ratón de su jaula y mantener todos los ratones inyectados en condiciones libres de patógenos específicos.</li>
</ol>4. retro-orbital sangrado y preparación de suero
<ol><li>Suero de ratón en diferentes momentos de la cosecha: para la inmunización de PNT-polisacárido, recoger suero de ratón en el día -7 y 7 (figura 1A); para la inmunización de PNT-KLH/alum, recoger suero de ratón día -7, 7, 14 y 28 (figura 1B).</li>
	<li>Para retro-orbital sangrado, anestesiar cada ratón con isoflurano 5% 1-2 min en un gabinete de bioseguridad25. Realizar el reflejo pedal para asegurar adecuada anestesia de cada ratón.</li>
	<li>Sostenga el ratón anestesiado en una mano con el índice y el pulgar tirando la piel que rodea el globo ocular para que el globo ocular sobresale de la toma25. Inserte un tubo capilar o pipeta Pasteur no heparinizada en un ángulo de 45° en el ángulo interno de la cavidad del ojo debajo del globo ocular25.</li>
	<li>Aplique presión suave hacia abajo y gire el tubo suavemente para romper en la vena y recoge 150 – 200 μL de sangre en la pipeta o tubo o pipeta. Inmediatamente transferir la sangre a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril y retomar el ratón de su jaula para recuperar.</li>
	<li>Deje que la sangre muestras sentarse a temperatura ambiente durante 1-2 h para coagular.</li>
	<li>Centrifugar las muestras de sangre coagulada a 13.000 x g por 10 min a 4 ° C. Transferir el suero claro sobre el coágulo de sangre a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril.</li>
	<li>Repita el paso 4.6 una vez más para eliminar el coágulo de sangre residual y recoger el suero claro.</li>
	<li>Alícuota del suero en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril en 50 μl/tubo y almacenar los sueros a-80 ° C.</li>
	<li>Alternan el ojo para el sangrado en diferentes puntos temporales para que cada ojo es purgar a lo más dos veces para el experimento entero. En la terminal del sangrado, recoger a 1 mL de sangre de cada ratón antes de eutanasia. Eutanasia el ratón con 5% CO2 seguido por dislocación cervical. Nota: Las células de B esplénico pueden ser cosechadas en vitro cultura estudios y análisis de citometría de flujo. También preparamos el ADN genómico de esplenocitos verificar el genotipo de cada ratón.</li>
</ol>5. ratón Ig isotipo específica ELISA
<ol><li>
Preparar los buffers y soluciones antes de ELISA.
	<ol>
<li>Preparar 500 mL de tampón de acoplamiento (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Preparar 500 mL de solución de lavado (PBS-T (0,05% Tween 20), pH 7,4).</li>
		<li>Preparar 100 mL de tampón de bloqueo (1% de BSA en PBS, pH 7,4, almacenado a 4 ° C).</li>
		<li>Preparar 1 L de tampón de sustrato (dietanolamina de 1 M, pH 9.8 (97 mL de dietanolamina en 1 L de H2O, pH ajustado con 10 M de HCl) y 0,5 mM de MgCl2). Proteger el tampón de sustrato de luz envolviendo la botella con papel de aluminio. Almacenar a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 100 mL de solución de parada (3 M NaOH).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cubrir las placas de ELISA:
	<ol>
<li>Para el isotipo de Ig del suero total ELISA, capa de placas de 96 pocillos inmuno con 10 μg/mL de isotipo-específicos de captura del anti-ratón policlonal de cabra Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A o E) Abs en acoplamiento Buffer (PBS) a 100 μL/pocillo.</li>
		<li>Para PNT específicos Ig isotipo ELISA, capa de placas de 96 pocillos inmuno con 10 μg/mL de PNT(38)-BSA en PBS en 100 μL/pocillo.</li>
		<li>Para el isotipo de Ig PNT específicos de alta afinidad ELISA, capa de placas de 96 pocillos inmuno con 10 μg/mL de PNT(3)-BSA en PBS con 100 μL/pocillo26. Incubar las placas a 4 ° C durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la incubación de la capa, lavar los platos 2 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Desechar el tampón de lavado y la mancha blanca /negra seco las placas (pulse cada plato boca abajo sobre una pila de toallas de papel) después de cada lavado.</li>
	<li>Bloquear las placas: agregar 200 μL/pocillo de bloqueo (1% de BSA en PBS) en las placas de recubrimientos e incubar las placas durante 1 h a TA.</li>
	<li>
Mientras que las placas están bloqueando, preparar las diluciones de Ig isotipo estándares y las muestras de suero en Buffer de bloqueo en una placa de 96 pocillos separada, no tratada en 150 μL/pocillo.
	<ol>
<li>Preparar 250 estándares de isotipo de Ig ng/mL la concentración estándar inicial (St01) y hacer de 7 a 10 de diluciones seriadas 1:2 de las normas de Ig (St02 St07 o St10, figura 2A).</li>
		<li>Preparar suero de ratón muestras a una dilución 1: 100 o 1: 500 del factor como la dilución partida y hacen 3 o 4 de 1:10 diluciones seriadas para el isotipo de Ig total o diluciones seriadas de 1:5 para el isotipo de Ig PNT específico de cada muestra de suero (figura 2A). Para IgE ELISA, preparar las muestras de suero de ratón en un factor de dilución 1:2 como la dilución partida y hacer 3 de diluciones seriadas de 1:5 de cada muestra de suero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de bloquear, lavar los platos en el paso 5.4 tres veces con 200 μL/pocillo de PBS-T y blot seque las placas después de cada lavado.</li>
	<li>Transferir 100 μL/pocillo de diluido normas de isotipo de Ig (apropiadas para la captura y detección Abs) y las muestras de suero diluido de paso 5.5 a los platos preparados en el paso 5.6. Incubar las placas con los estándares y las muestras a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Lavar los platos 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T y la mancha blanca /negra seco las placas después de cada lavado.</li>
	<li>En cada plato, añadir 100 μL/pocillo de 10 μg/mL de una apropiado fosfatasa alcalina (AP)-conjugados de isotipo-específicos de cabra anti-ratón Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A o E) Abs diluido en Buffer de bloqueo.</li>
	<li>Incubar las placas con Abs AP conjugado para el 1-2 h a TA. Para la detección de IgE, incubar las placas durante 1 – 2 h a 37 ° C.</li>
	<li>Preparar 1 mg/mL de solución de sustrato mediante la disolución de dos tabletas de sustrato de la fosfatasa de 5 mg en 10 mL de Buffer sustrato.</li>
	<li>Lavar la placa 5 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T y la mancha blanca /negra seco las placas después de cada lavado.</li>
	<li>Añadir 100 μL/pocillo de solución sustrato a cada plato. Permite la reacción a desarrollar en el RT, que generalmente toma sólo unos minutos.</li>
	<li>
Leer cada placa a 405 nm usando un lector de microplacas con su software asociado.
	<ol>
<li>Haga clic en "configuración" para establecer las longitudes de onda "Lm1" en "405 nm" y haga clic en "OK".</li>
		<li>Haga clic en "plantilla" para asignar wells "en blanco", "normas" pozos y pozos "desconocida" según la configuración de la placa de 96 pocillos.</li>
		<li>Para los pozos de "normas", haga clic en "serie" para establecer la "Primera muestra"como"St01", seleccione "Comenzar desde" en el "Top" y establecer "Replica" como "2". Compruebe"Muestra Descriptor" y "Valor estándar": seleccione "unidades"como"ng/mL", "valor inicial" como "250", sistema "paso a" como "2". Haga clic en "OK".</li>
		<li>Haga clic en "Leer" para leer la placa cuando más concentraron estándar alcanza una densidad óptica (OD) de ~ 1.</li>
		<li>Haga clic en el menú "archivo" y haga clic en "Guardar" para guardar el archivo.</li>
		<li>Haga clic en "leer" para leer la placa otra vez cuando el estándar de mayor concentración acerca a OD405 de ~ 1,5, 2 y 2.5, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detener la reacción añadiendo 25 μL/pocillo de 3 M NaOH. Realice los pasos 5.12 a 5.15 para una placa a la vez.</li>
	<li>
Analizar los datos de ELISA utilizando el software asociado con el lector de microplaca:
	<ol>
<li>Compruebe los valores de OD405 de las normas de isotipo de Ig de leerlas archivos y seleccione una lectura apropiada con buen alcance lineal de las normas para el análisis de datos detallados.</li>
		<li>Seleccione el programa de instalación de 4 parámetros para trazar curvas estándar. Compruebe el coeficiente de la curva estándar (R2), que se necesitan para ser > 0.98 para asegurar datos buena calidad.</li>
		<li>Compruebe si los valores de OD405 de cada muestra de disminuyen con el aumento de factores de dilución. Clic en "Desconocidos" para recuperar la concentración de todos los pozos de muestra diluida.</li>
		<li>Seleccione un bien apropiado de cada muestra con OD405 en el rango lineal de la curva estándar del isotipo de Ig para el cálculo de la concentración.</li>
		<li>Calcular el suero la concentración de isotipo Ig de cada muestra utilizando la fórmula: suero la concentración de Ig = concentración bien seleccionado x factor de dilución.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trazar gráficos y realizar análisis estadísticos utilizando un software apropiado9,10,11. Hacer diagramas de dispersión vertical de suero niveles de isotipo de Ig para comparar las respuestas de Ig en el mismo punto de tiempo. Estudios de respuesta de memoria TD, hacer las curvas de respuesta del curso del tiempo a examinar las respuestas de isotipo de Ig antes y después de la vacunación del aumentador de presión. Usar barras de error para mostrar la desviación estándar (SD) de cada grupo de muestras. Para comparar las respuestas de isotipo de Ig entre los dos genotipos de ratones, use la prueba t para dos colas de datos para determinar la significación estadística. Establezca el valor de p < 0.05 como significativamente diferentes.</li>
</ol>

Los autores tienen intereses financieros que compiten.

Aquí, describimos el protocolo para la caracterización de las respuestas del TD y TI Ig isotipo en ratones usando ELISA. Exitosa implementación de este protocolo requiere el uso de materiales especificados en la tabla 1, incluyendo placas de ensayo ELISA, inmunización Ags, anticuerpos de isotipo-específicos de Ig de ratón y las normas. Debe tener cuidado de evitar el uso de las placas de cultivo de tejidos tratado para ELISA. Diluciones de los estándares y las muestras de suero deben ser en placas separa...

Los linfocitos B son el jugador principal en la inmunidad humoral y el único tipo de célula en mamíferos que son capaces de producir anticuerpos, denominados también como inmunoglobulinas (Ig)1,2. Anticuerpos secretados por las células de B proporcionan una defensa formidable contra los invasores patógenos a través de diversos mecanismos incluyendo la opsonización, neutralización y activación del complemento, conduciendo a inmunidad protectora3. Secreción de anticuerpos por las células B se logra después de la completa activación de células B específicas, que normalmente requiere que dos distintas señales3. Señal 1 es retransmitida por atascamiento directo del antígeno (Ag) al receptor de células B (BCR) expresado en la superficie de ingenuo específico B células3. Dependiendo de la fuente de señal 2, activación de la célula de B puede dividirse en timo dependiente (TD) o timo-independientes (TI)3,4. En una respuesta de antígeno TD, 2 señal es proporcionada por cognado T CD4 helper (TH) las células activadas, que expresan CD154, el ligando para el receptor coestimuladoras CD40 expresado en las células de B1,2,3. En una respuesta antígeno TI señal 2 viene de cualquier participación de receptores Toll-like (TLRs en el caso del tipo 1 TI Ag) o Cross-linking extenso de las BCRs (en el caso del tipo 2 TI Ag) en la B células3,4. Antígenos de TI (TI-1) de tipo 1 son ligandos microbianos de TLRs, incluyendo lipopolisacáridos bacterianos (LPS), RNAs virales y CpG de ADN microbiano4,5. Tipo 2 TI (TI-2) antígenos tienen estructura altamente repetitiva y son capaces de entregar prolongada y persistente de señalización a la célula de B por varios Cross-linking de la BCRs4,6. Típicos los antígenos TI-2 ejemplos de polisacáridos de neumococos y polisacárido conjugado hapteno-6,7. Antígenos de TD y TI pueden provocar respuestas de IgM específica de antígeno sólidas y también pueden inducir la producción de anticuerpos de isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) con la ayuda brindada por el antígeno que presenta las células (APCs), como las células dendríticas (DCs)1 ,2,3. Además, TD y TI antígenos son capaces de inducir respuestas de memoria con la ayuda de APC, pero TD antígenos son más eficientes en la inducción de memoria células B generación3,8.
En este protocolo, TD y TI Ig respuestas son sacadas en ratones por la inmunización intraperitoneal (i.p.) con hemocianina de Lapa 2,4,6-trinitrophenyl-cerradura modelo hapteno conjugado antígenos (PNT-KLH) y PNT-polisacárido (neutro, muy ramificado y la Misa), respectivamente9,10,11. Antígenos de TD se utilizan generalmente con un adyuvante para mejorar la producción de anticuerpos12. Aquí en nuestro protocolo, PNT-KLH se inyecta con el alumbre, un coadyuvante utilizado en estudios de inmunización12. Otros ejemplos de aditivos que pueden utilizarse son completo o incompleto adyuvante de Freund (CFA o IFA), monophosphoryl-lípido A / dicorynomycolate de trehalosa (adyuvante de "Ribi del") y oligodeoxynucleotides de CpG, etc.13, 14. después de la inmunización, sueros de ratón son cosechados en diferentes puntos temporales y anticuerpos de PNT específicos en el suero se cuantifican utilizando Ig isotipo específica enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo9,10, 11.
ELISA es un ensayo basado en la placa que es ampliamente utilizado como una herramienta de diagnóstico en medicina y también como una herramienta de análisis en investigación biomédica15,16. Se utiliza para detectar y cuantificar analitos como anticuerpos, hormonas, citoquinas, quimiocinas y varios antígenos, etcetera. ELISA se puede realizar en varios formatos diferentes, incluyendo directo, indirecto, sandwich y competitivo ELISA15,16. En general, implica la inmovilización del antígeno en una superficie sólida, generalmente una placa de microtitulación de 96 pocillos, que se incuba con un anticuerpo primario. Después de la incubación, el anticuerpo no Unido se lava lejos. En un ELISA directo, el anticuerpo primario directamente se conjuga a una enzima (generalmente la peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina), que puede unirse un sustrato cromogénico para producir un cambio de color visible detectado por un instrumento de detección de señal como un Espectrofotómetro15,16. Por el contrario, si un anticuerpo enzima-ligado del secundario se utiliza para enlazar el anticuerpo primario, entonces esto se considera como un indirecto ELISA15,16. ELISA directo es más rápido mientras que ELISA indirecta es más sensible15,16. En un sandwich ELISA, las placas están recubiertas con un anticuerpo de la «captura» utilizado para inmovilizar el antígeno de interés en las muestras, y luego puede detectarse el antígeno capturado por otro anticuerpo de la "detección" de una manera directa o indirecta15, 16. ELISA Sandwich ofrece alta especificidad ya que el antígeno es detectado por dos diversos anticuerpos del antígeno. En un ELISA competitivo, la competencia se establece entre el antígeno de la muestra y el antígeno de limite de placa de unión del anticuerpo primario, y entonces la concentración de antígeno en la muestra se cuantifica midiendo la reducción de señal del substrato 15 , 16. ELISA competitivo puede realizarse utilizando el formato mencionado directo o indirecto y es útil para la detección de antígenos pequeños con un único epitopo15,16.
Técnicas alternativas para la medición de anticuerpos incluyen radio-inmunoanálisis (RIA), electrochemiluminescence (ECL) ensayo y superficie de resonancia de plasmon (SPR) ensayo17. RIA fue el primer inmunoensayo desarrollado que medidas la presencia de un antígeno (o anticuerpos) de alta especificidad y sensibilidad usando reactivos radiactivos18,19. Sin embargo, debido a las preocupaciones de toxicidad radioactiva, sus costes de eliminación, vida útil y licencias especiales para trabajar con materiales radioactivos, ELISA es la mejor y más conveniente técnica común utiliza20,21. ECL es un ensayo altamente sensible que reacciones de quimioluminiscencia se inician usando electricidad para generar especies altamente reactivas a partir de precursores estables en la superficie de un electrodo y pueden ser utilizadas para medir la cantidad de analitos (como antígenos o anticuerpos)22. Sin embargo, ECL requiere un instrumento especial y por lo tanto no es tan ampliamente usado como ELISA23. SPR es un ensayo directo que puede utilizarse para medir la Unión de ligandos (por ej., anticuerpos) para inmovilizar moléculas (e.g., antígenos) en un sensor chip superficial24. SPR detecta las interacciones en tiempo real muy concreto y no requiere el uso de reactivos etiquetados como ELISA. Sin embargo, el SPR también requiere un equipo especial y tiene menor sensibilidad que el ELISA17. Dadas las limitaciones de los métodos alternativos, ELISA es la técnica más adecuada y conveniente para nuestro propósito en este protocolo. Aquí, describimos el uso de sandwich ELISA para el análisis de los niveles totales de isotipo de Ig y los procedimientos de ELISA indirecto para el análisis de los isotipos de Ig específica de antígeno.

<table><tbody><tr><td>Lector de microplacas sintonizable VersaMax</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>VERSAMAX</td><td>Equipo para la lectura de placas</td></tr><tr><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>Software para el lector de placas</td></tr><tr><td>Prisma GraphPad Prisma</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Software para gráficos y estadísticas</td></tr><tr><td>TNP-AECM-polisacárido (FICOLL)</td><td>Biosearch Technologies</td><td>F-1300-10</td><td>A TI Ag para inmunización</td></tr><tr><td>TNP-KLH</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5060-5</td><td>A TD Ag para inmunización</td></tr><tr><td>TNP(38)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (relación de conjugación: 38)</td><td>Recubrimiento Ag para ELISA específico</td></tr> de <tr><td>TNP TNP(3)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (relación de conjugación: 3)</td><td>Recubrimiento Ag para alta afinidad Ig Imject</td></tr><tr>Alumbre específico de TNP<td></td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>PI-77161</td><td>Alumbre adyuvante para la inmunización</td></tr><tr><td>Falcon Tubos de polipropileno</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-11A</td><td>Para la incubación de la jeringa de insulina BD TNP-KLH/alumbre</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-829-1B</td><td>Para inyección i.p. de ratones</td>Placas</tr><tr><td>inmunológicas de 96 pocillos, fondo plano</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-245-61</td><td>Para ELISA</td></tr><tr><td>Microplacas de 96 pocillos sin tratar, fondo redondo</td><td>VWR</td><td>82050-622</td><td>Para diluciones en serie de patrones y muestras</td></tr><tr><td>Sustrato de fosfatasa, 5 mg Comprimidos Sigma</td><td></td><td>S0942-200TAB</td><td>Sustrato AP</td></tr><tr><td>Dietanolamina</td><td>VWR</td><td>IC15251690</td><td>Un componente del tampón de sustrato AP</td></tr><tr><td>IgM antiratón de cabra SouthernBiotech</td><td></td><td>1020-01</td><td>Captura Ab para ratón IgM</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-01</td><td>Captura Ab para ratón IgG1</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-01</td><td>Captura Ab para ratón IgG2a</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-01</td><td>Captura Ab para ratón IgG2b</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-01</td><td>Captura Ab para ratón IgG3</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-01</td><td>Capture Ab para ratón</td></tr><tr><td>IgA cabra anti-ratón IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-01</td><td>Capture Ab para ratón IgE</td></tr><tr><td>AP-Cabra anti-ratón IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-04</td><td>Detección Ab para ratón</td></tr><tr><td>IgM AP-Cabra anti-ratón IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-04</td><td>Detección Ab para ratón IgG1</td></tr><tr><td>AP-Cabra anti-ratón IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-04</td><td>Detección Ab para ratón IgG2a</td></tr><tr><td>AP-Cabra anti-ratón IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-04</td><td>Detección Ab para ratón IgG2b</td></tr><tr><td>AP-Cabra anti-ratón IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-04</td><td>Detección Ab para ratón IgG3</td></tr><tr><td>AP-Cabra anti-ratón IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-04</td><td>Detección Ab para ratón IgA</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-ratón IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-04</td><td>Detección Ab para ratón IgE</td></tr><tr><td>ratón IgM estándar</td><td>BD Biosciences</td><td>553472</td><td>TNP-específico IgM, Clon&nbsp; G155-228</td></tr><tr><td>Estándar de IgG1 de ratón</td><td>BD Biosciences</td><td>554054</td><td>IgG1 específico de TNP, clon&nbsp; 107.3</td></tr><tr><td>Estándar de IgG2a de ratón</td><td>BD Biosciences</td><td>556651</td><td>IgG2a específico de TNP, clon&nbsp; G155-178</td></tr><tr><td>Estándar de IgG2b de ratón</td><td>BD Biosciences</td><td>554055</td><td>IgG2b específico de TNP, clon&nbsp; 49.2</td></tr><tr><td>Estándar de IgG3 de ratón</td><td>BD Biosciences</td><td>553486</td><td>IgG3 específico de KLH, clon&nbsp; A112-3</td></tr><tr><td>IgA de ratón estándar</td><td>BD Biosciences</td><td>550924</td><td>IgA inducida por aceite mineral, clon &nbsp; MOPC-320</td></tr><tr><td>Estándar de IgE de ratón</td><td>BD Biosciences</td><td>557079</td><td>IgE específica de TNP, clon &nbsp; C38-2</td></tr></tbody></table>

caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Anticuerpos, también llamados como distinguen de inmunoglobulinas (Ig), secretadas por los linfocitos B, células de plasma plasmablasts, en la inmunidad humoral proporcionan una formidable defensa contra la invasión de patógenos a través de diversos mecanismos. Un objetivo importante de la vacunación es inducir anticuerpos protectores específicos de antígeno para prevenir las infecciones mortales. Tanto timo dependiente (TD) y antígenos de timo-independientes (TI) pueden provocar respuestas de IgM específica de antígeno sólidas y también pueden inducir la producción de anticuerpos de isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) así como la generación de células de memoria B con la ayuda proporcionado por el antígeno que presenta las células (APCs). Aquí, describimos un protocolo para caracterizar las respuestas del TD y TI Ig isotipo en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). En este protocolo, TD y TI Ig respuestas son sacadas en ratones por inmunización intraperitoneal (i.p.) con antígenos conjugado hapteno-modelo PNT-KLH (en alumbre) y PNT-polisacárido (PBS), respectivamente. Para inducir la respuesta de memoria TD, una inmunización de refuerzo de PNT-KLH en alumbre se da en 3 semanas después de la primera vacunación con el mismo antígeno/adyuvante. Suero de ratón es cosechada en diferentes puntos temporales antes y después de la inmunización. Total niveles de Ig y anticuerpos específicos a la PNT posteriormente se cuantifican utilizando Ig isotipo específica Sandwich y ELISA indirecto, respectivamente. Para cuantificar correctamente la concentración de suero de cada isotipo de Ig, las muestras deben diluirse adecuadamente para encajar dentro de la gama linear de las curvas estándar. Usando este protocolo, siempre hemos obtenido resultados confiables con sensibilidad y alta especificidad. Cuando se utiliza en combinación con otros métodos complementarios como la citometría de flujo, en vitro cultura de esplénico de células B e immunohistochemical tinción (IHC), este protocolo permitirá a los investigadores obtener una comprensión completa del anticuerpo respuestas en un entorno experimental dado.

Hemos utilizado este protocolo para investigar las funciones de un regulador crítico del sistema inmune, TRAF3, TI y TD Ig isotipo respuestas9,10,11. TRAF3 directa o indirectamente regula la transducción de la señal de un número de receptores inmunes innatos y adaptativos, incluyendo la superfamilia de receptores TNF, receptores Toll-like y T de la célula del receptor/CD28, entre otros<sup class=...

En este artículo se describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipo de inmunoglobulina (Ig) T dependientes y T independientes en ratones usando ELISA. Este método se usa solo o en combinación con el flujo cytometry permitirá a los investigadores identificar las diferencias en las respuestas de isotipo de Ig mediada por células B en ratones después de la inmunización de antígenos T dependientes y T independientes.

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre las respuestas de anticuerpos dependientes e independientes inducidas por la inmunización con antígenos, así como la activación de las células B y las reacciones del centro germinal. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona mediciones fiables y cuantitativas de la respuesta del isotipo Ig con una comparación directa de la activación de las células B y la inmunidad humoral en ratones. Para la inmunización con polisacáridos TNP, cargue una jeringa de insulina de mililitros por ratón con 100 microlitros de solución de antígeno recién preparada e inserte la aguja en el cuadrante inferior derecho de cada animal en un ángulo de aproximadamente 30 grados para evitar la inyección en el órgano inferior.Cuando todos los ratones hayan sido inyectados, devuelva a los animales a sus jaulas para que los alojen en una instalación específica libre de patógenos. En los puntos de tiempo experimentales apropiados, se recogen de 150 a 200 microlitros de sangre de cada animal inmunizado mediante sangrado retroorbitario y se permite que las muestras se coagulen a temperatura ambiente durante una o dos

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un método para evaluar la respuesta inmune de anticuerpos a una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión en ratones pre-inmunizados. La inmunización mejora la respuesta de los anticuerpos, como se confirma mediante la determinación de los títulos de anticuerpos IgG.

Medición de los niveles de inmunoglobulina G frente a una vacuna de prueba en un suero de ratón

Con funciones efectoras diferenciadas de otros subconjuntos de células T, las células Th17 se han implicado en el centro de la autoinmunidad inflamatoria. Este protocolo de diferenciación in vitro de Th17 en proporciona un medio para determinar si ingenuas linfocitos T CD4 + pueden diferenciarse en células Th17, y para examinar aún más su papel en la autoinmunidad y la respuesta del huésped.

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

El análisis in vitro de la recombinación de interruptores de clase en ratones es un desafío debido a las moléculas citofílicas de IgE unidas a los receptores Fc en la superficie de las células B.  Describimos un método para la detección de IgE utilizando la escisión mediada por tripsina de IgE unida a la superficie antes de la fijación y permeabilización para la tinción con fluorescencia citoplasmática.

Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

Este informe proporciona una descripción detallada del trasplante de thymi murino de diferentes ratones donantes envejecidos bajo la cápsula renal de receptores de ratones inmunodeficientes. El objetivo de este enfoque es modelar el desarrollo de células T y los eventos de selección tímica in vivo.

Aislamiento y Trasplante de diferentes Aged murinos tímicos injertos.

+ &gt; 'jove_content'Naïve se polarizan en varios subconjuntos dependiendo del entorno en el momento de la activación.  La diferenciación de los linfocitos T CD4+ naïve a varios subconjuntos efectores se puede lograr in vitro mediante la adición de estímulos del receptor de linfocitos T y señales específicas de citocinas.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Este artículo describe la metodología in vivo e in vitro para caracterizar los progenitores de sedimentación tímica mediante el análisis de la cinética de generación, fenotipo y número de su progenie de células T.

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Se presenta un protocolo optimizado para la generación de anticuerpos monoclonales basado en la tecnología de hibridomas. Los ratones fueron inmunizados con un inmunoconjugado. Las células del bazo se fusionaron mediante PEG y un impulso eléctrico con células de mieloma inmortal. Las células de hibridoma productoras de anticuerpos se seleccionaron mediante HAT y ELISA específico de antígeno.

Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

En este estudio, presentamos un novedoso y eficaz protocolo para el aislamiento de los linfocitos de las placas de Peyer (PP), que pueden utilizarse posteriormente para ensayos funcionales en vivo y en vitro como en estudios de citometría de flujo folicular t helper y células del centro germinal B.

Desentrañando los jugadores claves de inmunidad Humoral: avanzada y Protocolo de aislamiento de linfocitos de parches Murine placas de Peyer

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Proporcionamos un protocolo detallado para aislar e identificar poblaciones de células T específicas de antígenos raros en pulmones de ratón a través del enriquecimiento de células T basado en perlas magnéticas y tetrámeros del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de péptidos.

Identificación de células T raras específicas de antígeno de pulmones de ratón con tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico:principal

Aprende a caracterizar respuestas de isotipos de inmunoglobulina dependientes e independientes del timo en ratones mediante ELISA. Este protocolo permite medir cuantitativamente la activación de células B y la inmunidad humoral.

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (Video) | JoVE Journal

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

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