Name: Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Aprende a medir la virulencia bacteriana de forma rápida y cuantitativa utilizando Dictyostelium discoideum como hospedero. Este protocolo emplea microscopía de fluorescencia para evaluar efectos de muerte celular en una hora.

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KP y como escribieran y revisaron el manuscrito. KP realiza los experimentos y el análisis. Este trabajo fue apoyado por el Premio de transición de carrera de institutos nacionales de salud (NIH) (K22AI112816) a AS.

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en la Universidad de California, Irvine.
1. tampones y soluciones
<ol><li>Para preparar caldo de lisogenia (LB) en un frasco de vidrio de 1 L agregar 25 g de mezcla LB-Miller en 1 L de agua destilada doble (ddH2O). Para placas de Petri, agregar un adicional 20 g de agar. Autoclave para esterilizar. Vierte 25 mL de medio agar fundido en platos de Petri de 10 cm de diámetro y dejar para solidificar a temperatura ambiente. Almacenar medios líquidos a temperatura ambiente y las placas de agar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar platos para glucosa levadura peptona (GYP) en una botella de vidrio de 1 L mezclando 1 g de D-glucosa, extracto de 2 g de peptona, 0,25 g de levadura, 4,2 g de KH2PO4, 5,1 g de Na2HPO47 H2O y 25 g de agar en 1 L de ddH2 O. Autoclave para esterilizar. Vierte 25 mL de agar fundido en platos de Petri de 10 cm de diámetro y dejar para solidificar a temperatura ambiente. Almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparación de medio de peptona S (PS) en una botella de vidrio de 1 L mezclando 10 g de peptona, extracto de 7 g de levadura, 15 g de D-glucosa, 0,12 g de Na2HPO47 H2O, 1,4 g de KH2PO4, 40 μg de vitamina B12 , y 80 μg de ácido fólico en 800 mL de ddH2O. calibrar un medidor de pH electrónico utilizando estándares de pH 7 y pH 4, si el medidor de pH no ha sido utilizado dentro de un día.<ol>
<li>Medir el pH del medio PS utilizando el medidor de pH. Añadir KOH de 5 M o 5 M H3PO4 para ajustar el pH a 6.5. Ajustar el volumen final de 1 L con ddH2filtro de O. esterilice usando 0.22 μm filtro vacío y almacenar a 4 ° C. Nota: Proceder con cautela con los ajustes de pH con el uso de equipo de protección como guantes, ropa protectora, protección para los ojos y cara protección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 10 x Buffer de desarrollo primer (DB') buffer en una botella de vidrio de 1 litro mediante la adición de 3,4 g de KH2PO4, 13,4 g de Na2HPO4 7 H2O y ddH2O hasta un volumen total de 800 mL. Calibrar un medidor de pH electrónico utilizando estándares de pH 7 y pH 4, si el medidor de pH no ha sido utilizado dentro de un día.<ol>
<li>Medir el pH del buffer usando el medidor de pH electrónico. Suavemente agregar KOH de 5 M o 5 M H3PO4 según sea necesario para ajustar el pH a 6.5. Ajustar el volumen final de 1 L con ddH2O y esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente. Nota: Proceder con cautela con los ajustes de pH con el uso de equipo de protección como guantes, ropa protectora, protección para los ojos y cara protección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hacer 1 x de tampón de desarrollo (DB) mezclando 100 mL de 10 x DB' buffer con 1 mL de esterilizada 2 M MgCl2, y 1 mL de esterilizado 1 M CaCl2. Ajustar el volumen final de 1 L en una botella de vidrio de 1 L con un ddH esterilizada en autoclave2O. almacén a temperatura ambiente.</li>
	<li>Medio PS:DB en una botella de vidrio de 1 L se preparan mezclando 100 mL de medio de PS estéril, 100 mL de esterilizado 10 x DB' buffer y ddH esterilizada2O hasta un volumen total de 1 L. suplemento con 1 mL de esterilización de MgCl 2 M2 y 1 mL de esterilizado 1 M CaCl 2. almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar la solución madre de calceína-AM por añadiendo 50 μl de DMSO a 50 μg de calceína-AM en el envase plástico proporcionado por el fabricante. Almacenar a-20 ° C.</li>
</ol>2. crecimiento y mantenimiento de las amebas
<ol><li>Crecer la cepa de e. coli B/r17 como fuente de alimento para las amebas durante el período de crecimiento inicial. Racha de e. coli B/r de un stock congelado almacenados a-80 ° C sobre una placa de agar LB e incubar a 37 ° C durante la noche para obtener colonias individuales.</li>
	<li>Inocular una sola Colonia de e. coli B/r en 2 mL de medio LB e incubar en un tambor de rodillo o una coctelera a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Llevar durante la noche de cultura de e. coli a la temperatura ambiente. Usando un palo de madera, inocular amebas de un stock congelado guardado a-80 ° C en 750 μl de la cultura durante la noche. Nota: Uso D. discoideum cepa AX3, que es capaz de crecimiento axénico18. Este paso no requiere crecimiento axénico, pero los pasos posteriores tendrán su requisito.</li>
	<li>Inmediatamente añadir 700 μl de la mezcla dee. coli de amebas - sobre una placa de glucosa levadura peptona (GYP). Difundir la cultura uniformemente en la superficie de la placa inclinándola y hacia atrás y de lado a lado según sea necesario. Evitar el uso de un esparcidor.</li>
	<li>Coloque la placa GYP con el agar hacia arriba en una caja que mantiene la humedad. Utilizar dos envases de plástico desechables (183 cm x 183 cm x 91 cm) apilados en la parte superior unos a otros. Llene el recipiente inferior con aproximadamente 25 mL de agua y colocar el contenedor superior con varios 0,5 cm de diámetro agujeros perforados a través del suelo del recipiente para permitir que la humedad mover el tanque de agua en el contenedor superior.</li>
	<li>Incubar la placa de GYP y caja de 22 ° C durante 4-5 días hasta que las esporas de la ameba se observan creciendo cerca de la superficie de la placa (figura 2). Utilizar una incubadora refrigerada para incubar las placas en lugar de incubación a temperatura ambiente. Nota: Después de que las esporas han crecido, siguen siendo viables en las placas durante varias semanas si se almacena a 4 ° C. Almacenar las placas con agar hacia arriba. Después de 3-4 días de incubación, se observan zonas de claro en el césped bacteriano, que indican el inicio de la esporulación de la ameba.<ol>
<li>Observar amebas pequeñas esporas sobre la superficie de la placa tras 4-5 días de incubación (figura 2). Nota: Crecen las amebas por más de una semana, como la calidad de las esporas disminuye más allá de este período de tiempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger las esporas de las amebas para prepararse para el crecimiento axénico de las amebas por barrido paralelo a la superficie de la placa de una punta de pipeta estéril 1 mL. Recoger las esporas de la mitad de un plato de Petri de 10 cm. Nota: Evite tocar la punta de la superficie de la placa de agar como esta propuesta recogerá gran cantidad de e. coli.</li>
	<li>Resuspender las amebas en la punta de la pipeta por sumergir la punta en 1 mL de medio de PS y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Transferir la mezcla inoculada en un frasco de 250 mL que contenga 25 mL del medio PS complementado con la solución de antibiótico-antimicótico en concentración x 0.25. Nota: Almacene la solución antibiótico-antimicótico como alícuotas de μl 250 a-20 ° C. Evite ciclos repetidos de descongelación y congelación de esta solución como esto puede disminuir su eficacia.</li>
	<li>Crecen amebas axenically a 22 ° C en un agitador rotatorio a 100 rpm. Para el análisis de la virulencia en el paso 5, crecen las células a una densidad óptica medida a 600 nm (OD600) de 0.2 a 0.5. Nota: Este paso requiere 3-4 días de crecimiento desde el momento de la inoculación (paso 2.7). Si las células han crecido a una densidad más alta, diluir la cultura en el medio PS a un OD600 de 0.05 o menor y crecer a un OD600 de 0.2 a 0.5.</li>
</ol>3. el crecimiento de p. aeruginosa
<ol><li>Escoger una sola Colonia de p. aeruginosa de una placa LB, inocular en una cultura de PS:DB de 2 mL y crecer durante la noche a 37 ° C a la saturación. Nota: No agregue la solución antibiótico-antimicótico para los medios de PS:DB.</li>
	<li>Diluir la noche cultura 1: 100 o 1:1,000 en un plato de Petri de 6 cm de diámetro utilizando PS:DB. Si únicamente se es analizar la virulencia de las células planctónicas, crecen las culturas usando tubos de cultivo convencional en su lugar. Sacudir la cultura en un rotador de benchtop de 100 rpm a 37 ° C.</li>
	<li>Culturas en momentos específicos para asegurar la reproducibilidad de la cosecha. A los 30 min a 1 h antes de la evaluación de virulencia, preparar una almohadilla de agar como se describe en la sección 4. Nota: Virulencia en p. aeruginosa es inducida por aproximadamente 8 h de crecimiento en las superficies.</li>
	<li>Para aislar las células conectado a superficie, quite el medio líquido de la caja Petri, lavar de inmediato con 1 mL de tampón de DB para eliminar las células planctónicas y proceder de inmediato al paso 5.1. PRECAUCIÓN: No lave más de 30 s como este se perturban y separar células conectado en superficie y puede afectar la medición de la virulencia.</li>
	<li>Para aislar las células planctónicas, transferir 10 μl de la cultura de la placa de Petri a una caja de Petri limpia y proceder de inmediato al paso 5.1.</li>
</ol>4. microscopía - preparación de la almohadilla de Agar
<ol><li>Preparar pastillas de agar aproximadamente 30 min a 1 h antes de las amebas están listas para ser mezclados con p. aeruginosa.</li>
	<li>Microondas 50 mL de agar 1% (p/v) en buffer DB en un matraz de 250 mL. Mezcla cada 20 s hasta grupos de agar desaparecen.</li>
	<li>Enfriar el agar fundido al colocarlo en baño de agua precalentada 55 ° C durante 15 minutos.</li>
	<li>Añadir 15 μl de la solución madre de calceína-AM a 15 mL del agar fundido en un tubo cónico. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 4 - 5 veces y proceder de inmediato al siguiente paso. Nota: Realice este paso en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mL. No use un recipiente de vidrio grueso ya que el agar solidifique demasiado rápido.</li>
	<li>Vierta la mezcla de agar fundido en la parte superior una placa de vidrio de 12 cm x 10 cm y permitir que el agar solidifique durante 10 minutos a temperatura ambiente. Cortar la almohadilla de agar solidificado en secciones más pequeñas de 1,5 cm x 1,5 cm colocando la placa de vidrio sobre una cuadrícula impresa y corte a lo largo de la rejilla usando una regla de metal.</li>
	<li>Mantenga el gel hidratado en una caja húmeda hasta que esté listo para su uso.</li>
</ol>5. microscopía - preparación de la muestra de Bacteria ameba imagen
<ol><li>Para la virulencia de células bacterianas con conexión por superficie de ensayo, añadir 10 μl de células de Ameba de paso 2.10 bacterias conectado a superficie del paso 3.4. Nota: Este paso describe la mezcla de amebas con las bacterias.</li>
	<li>Para analizar la virulencia de las células planctónicas, mezclar 10 μl de las células de la ameba de paso 2.10 con 10 μl de las bacterias planctónicas de paso 3.5. Nota: No lave las células cultivadas axenically Ameba (en un OD600 de 0.2 a 0.5) antes de mezclar con la bacteria. No crecimiento de e. coli se observará en la cultura de Ameba debido al uso de la solución de antibiótico-antimicótico.</li>
	<li>Inmediatamente colocar la almohadilla de agar de calceína-AM 1,5 cm x 1,5 cm de paso 4.5 sobre la mezcla de bacterias-ameba en la superficie de la placa de Petri. Nota: Coloque la almohadilla de agar en la parte superior la mezcla utilizando un movimiento suave de rápido. Este movimiento tiende a empujar las células hacia la periferia y de la parte inferior de la almohadilla, no baje la almohadilla lentamente en la mezcla. Este paso garantizará que las bacterias y las amebas son uniformemente mezclados, inmovilizada y que ambos tipos de células están confinadas en el mismo plano.</li>
	<li>Quitar exceso de líquido mediante pipeteo suavemente hacia fuera cualquier líquido restante alrededor de la almohadilla de agar. Permita que la placa de Petri secar por 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cubrir con la placa de Petri con tapa e incubar la mezcla inmovilizados ameba-bacterias a temperatura ambiente durante un adicional 40 min. proceda al paso 6.1. Nota: Es importante incubar las muestras durante la misma cantidad de tiempo, como el fondo fluorescencia aumenta con el tiempo. Se recomienda un tiempo de incubación de 1 h. Incubaciones por más de 1 h son menos reproducibles como las células de las amebas pueden empezar a explotar.</li>
</ol>6. microscopia - adquisición de imágenes
<ol><li>Amebas de imagen utilizando un microscopio de fluorescencia capaz de adquirir imágenes de fluorescencia verde y trasmitida. Para fluorescencia verde, usar filtros de fluorescencia verde (GFP) de la proteína con 474/27 nm y 525/45 nm de excitación y emisión, respectivamente. Utilice un objetivo de (apertura numérica ≥0.3) X 10 a la imagen de las amebas. Nota: La calceína-AM en el agar causará muerte amebas a fluorescencia en el canal de fluorescencia verde. Amebas sanas de lo contrario no son fluorescentes.</li>
	<li>Ajustar tiempos de adquisición para el contraste de fase, canales GFP para limitar fototoxicidad y optimizar el rango dinámico de las intensidades de la imagen. Sustituir el interferencia diferencial (DIC) fase contraste si es necesario. Nota: Usar exposiciones de 100-200 ms contraste de fases y fluorescencia de GFP si es posible. Mantener los ajustes de exposición e instrumento sin cambios a lo largo de todo el experimento. Esto es fundamental para calcular el índice de homicidio de host.</li>
	<li>Adquirir imágenes de por lo menos 100 células de Ameba para obtener buenas estadísticas para calcular el host índice de matanza.</li>
</ol>7. Análisis e índice de la matanza de Host de la imagen
<ol><li>Cabo el análisis de imagen con ImageJ.</li>
	<li>Abra el archivo de imagen de contraste de fase en ImageJ haciendo clic en archivo | Abierto y seleccionar la imagen. Ajustar el umbral haciendo clic en imagen | Análisis | Umbral. Ajustar el umbral superior e inferior para seleccionar sólo el pico de intensidad (figura 3A).</li>
	<li>Convertir la imagen a binario haciendo clic proceso | Binario | Hacer binario. Rellenar agujeros seleccionando proceso | Binario | Llenar los agujeros. Nota: Utilizando la imagen en la figura 1 como el origen, pasos 7.1-7.2 producirá una imagen en la que las amebas y las bacterias superficie adjunta aparecen como las regiones oscuras (figura 3B).</li>
	<li>Asegurar que los cuadros de área y valor del gris medio se incorporan analizar | Establecer las medidas. Medir el tamaño aproximado de las amebas seleccionando la herramienta óvalo de la barra de herramientas principal. Haga clic en analizar | Medida y observe la zona de amebas representante.</li>
	<li>Crear máscaras para las amebas haciendo clic analizar | Analizar las partículas. En el cuadro tamaño, escriba el área que se incluyen las amebas pero excluyen las bacterias. Seleccionar máscaras en el menú desplegable de la opción de mostrar. Asegúrese de que está marcada la casilla añadir a gerente .</li>
	<li>Haga clic en OK y una imagen que muestra sólo las amebas y un ROI Manager aparecerá el cuadro de diálogo (figura 3C).</li>
	<li>Abra la imagen de la fluorescencia usando archivo | Abierto y seleccionar el archivo correspondiente. Seleccionar todas las regiones en el ROI Manager manteniendo pulsada la tecla Mayús y clic en cada región en la lista (figura 3D).</li>
	<li>Haga clic en el botón de medir en el ROI Manager. Se abrirá una ventana de resultados muestra el valor de la intensidad media de cada ameba.</li>
	<li>Copiar los valores de fluorescencia para cada ameba en un programa de hoja de cálculo y calcular el anfitrión matando índice tomando el promedio de todos los valores de fluorescencia.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método rápido y cuantitativo para analizar la virulencia en p. aeruginosa. Este protocolo puede ser probado con otras bacterias. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el medio de crecimiento debe ser compatible con las condiciones de crecimiento de la ameba. En particular, hemos optimizado el protocolo usando PS:DB como el medio de crecimiento bacteriano. Si se utilizan otros medios, puede ser necesario realizar un control del crecimiento sólo de los medios de comunicación en ...

La infección bacteriana es una de las principales causas de mortalidad en humanos y animales1,2. La capacidad para medir la virulencia de las bacterias en cultivos o biofilms es importante en entornos de cuidado de la salud y la investigación. Aquí, describimos un método versátil, rápido y relativamente simple para cuantificar la virulencia bacteriana. El organismo eucariota Dictyostelium discoideum (ameba) se utiliza como organismo modelo host. D. discoideum se ha utilizado como un host para identificar factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3,4,5 y otras bacterias6,7 ,8 y es susceptible a en gran parte los mismos factores de virulencia que matan las células mamíferas, incluyendo el tipo III secreción9,10. Anteriores ensayos de virulencia mediante D. discoideum han implicado la exposición prolongada de las bacterias con D. discoideum las células en el transcurso de horas3,4,5. Protocolo, aquí, presenta un método rápido de determinación de virulencia usando esta ameba. Este protocolo (figura 1) se describe como: (1) crecen las amebas axenically (en ausencia de bacterias), (2) crecer bacterias para el análisis, (3) preparar las bacterias y las células del huésped para microscopía, (4) realizan microscopía de epifluorescencia y (5) analizan los ameba fluorescencia.
Amebas inicialmente con mechas hacia fuera de la acción congelada y crecidas en un jardín de Escherichia coli (e. coli), donde las amebas producen esporas. Estas esporas son seleccionadas y se inocula en un medio enriquecido para el crecimiento axénico. Las amebas se mantienen a través del crecimiento axénico en condiciones ricas en nutrientes hasta que están listos para ser mezclados con bacterias para la evaluación de la virulencia bacteriana. La supervivencia o la muerte de las amebas se cuantifica midiendo la fluorescencia de calceína-acetoxymethyl (calceína-AM), que es hendida por esterasas intracelulares y, por lo tanto, activado por fluorescencia11,12. Amebas vivo exhiben poca o ninguna fluorescencia mientras que subrayó y fluorescencia de células muertas intensamente. Este resultado es debido a poca o ninguna incorporación de calceína-AM en amebas saludables e incorporación y clivaje del sustrato en amebas estresado13. Este comportamiento es notablemente distinto de fluorescencia de calceína-AM en células de mamífero11,14,15,16.
Las bacterias que se aplicará para la virulencia se cultivan por separado. Aquí, describimos cómo medir la virulencia de los patógenos oportunistas p. aeruginosa y detalle cómo cuantificar la virulencia de planctónico (natación) y las subpoblaciones conectado a superficie. Este protocolo puede ser adaptado para probar la virulencia de otras bacterias. En la sección de resultados de representante, demostramos que la virulencia se activa en las células de superficie conectado y es baja en las células planctónicas, que fue divulgado previamente13. Virulencia-activado superficie unida p. aeruginosa mata amebas mientras no virulenta células planctónicas son consumidas por las amebas. Si únicamente se es analizar la virulencia de las bacterias planctónicas, las bacterias pueden ser cultivadas en tubos de cultivo ordinario en lugar de utilizar placas de Petri como se describe en el protocolo.
El crecimiento de las amebas y las culturas de p. aeruginosa debe coordinarse que cultivos de p. aeruginosa alcanzan la fase de crecimiento previsto, mientras que las amebas están creciendo en estado estacionario en condiciones ricas en nutrientes. Esta condición requiere típicamente culturas amebas a diluirse al menos 1 día antes cuando se mezclan con las bacterias. Amebas y bacterias se inmovilizan usando teclas de agar son co se incubó por 1 h y fotografiado con una resolución baja (10 X, abertura numérica 0.3) filtros de la proteína de fluorescencia verde, objetiva (GFP) y una cámara. Análisis se pueden realizar usando el software ImageJ libremente disponible o modificado para requisitos particulares software de análisis de imagen. Nuestro análisis fue realizado usando nuestro propio software escrito usando un paquete de análisis científico13. El software debe crear una máscara con la imagen de contraste de fase y extraer valores de fluorescencia de las áreas enmascaradas en la imagen de fluorescencia. Valores de fluorescencia son un promedio sobre por lo menos 100 células, resultando en un índice de matanza de host numéricos.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</agar fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto, deshidratado</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Alícuota < 1 mL y almacenar a -20 < C</td></tr><tr><td>Calceína-acetoximetil éster (calceína-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calceína acetoximetil (AM)</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio, anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrosa</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fólico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Peptona especial</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de potasio</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain AX318</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Cepa B/r17</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>cepa19</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa & Delta; lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>Cepa derivada de PA1420</sup</td></tr><tr><td>>Suministros</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 y micro; Filtro M&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>Para la esterilización del filtro</td></tr><tr><td>Tubo cónico, 15 mL</td><td></td><td>Corning 352097</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidrio Pyrex</td><td></td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Placa de Petri, 6 cm de diámetro</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm placas de poliestireno Placa</td></tr> de <tr><td>Petri, 10 cm de diámetro</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Placas de poliestireno de 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Recipientes de plástico con tapa</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Envases cuadrados de 3 tazas</td></tr><tr><td>Platos de vidrio</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>Para la preparación de almohadillas de agar. Se pueden utilizar otras placas de vidrio con dimensiones similares.</td></tr><tr><td>Palos de madera</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Eclipse Ti-E&nbsp;</td><td>Configuración del</td><td>microscopio</td><td>Nikon MEA53100</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 objetivo&nbsp; 0.3 NA</td><td>Configuración del</td><td>microscopio</td><td>Nikon MRH20101</td></tr><tr><td>Fuente de excitación de fluorescencia</td> Motor de luz <td>Lumencor</td><td>Sola</td><td>Configuración del microscopio</td></tr><tr><td>Juego de filtros de fluorescencia</td><td>Semrock LED-DA</td><td>/FI/TX-3X3M-A-000&nbsp;</td><td>Configuración del microscopio</td></tr><tr><td>Cámara Orca Flash 4.0 V2</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Configuración del microscopio</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Software para el análisis de imágenes</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Software para el análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Incubadora agitadora orbital</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Para el crecimiento de bacterias a 37 &deg; </td></tr><tr><td>C Agitador de plataforma</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>Para el crecimiento de amebas a 22 &deg; C</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora refrigerada bajo mostrador</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>Para el crecimiento de amebas a 22 & grados; C</td></tr><tr><td>Baño de agua Isotemp&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>Para enfriar medios hasta 55 &deg; C</td></tr></tbody></table>

un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Ensayos de virulencia bacterianos tradicionales implican la exposición prolongada de las bacterias a lo largo de varias horas a las células del huésped. Durante este tiempo, las bacterias pueden experimentar cambios en la fisiología debido a la exposición al ambiente de crecimiento de anfitrión y la presencia de las células hospedadoras. Hemos desarrollado un ensayo para medir rápidamente el estado de virulencia de las bacterias que reducen al mínimo el grado al cual las bacterias crecen en presencia de las células del huésped. Bacterias y amebas se mezclan juntos e inmovilizadas en un solo plano de proyección de imagen con una almohadilla de agar. El procedimiento utiliza imágenes por fluorescencia unicelular con calceína-acetoxymethyl ester (calceína-AM) como un indicador de salud de la célula huésped. La fluorescencia de las células huésped se analiza después de 1 h de la exposición de las células del huésped a las bacterias mediante microscopía de epifluorescencia. Software de análisis de imagen se utiliza para calcular un índice de matanza de host. Este método se ha utilizado para medir la virulencia dentro de planctónicos y une superficie de Pseudomonas aeruginosa las subpoblaciones durante la etapa inicial de formación de biopelículas y puede ser adaptado a otras bacterias y otras etapas del crecimiento de biopelícula. Este protocolo proporciona un método rápido y robusto para medir la virulencia y evita muchas de las complejidades asociadas con el crecimiento y mantenimiento de líneas de células de mamífero. Fenotipos de virulencia mide aquí con las amebas también han sido validados con los macrófagos de ratón. En particular, este análisis fue utilizado para establecer esa virulencia de upregulates accesorio superficie en p. aeruginosa.

Hemos crecido salvaje p. aeruginosa cepa PA1419 o un ΔlasR cepa20 en el mismo fondo de PA14 en cajas Petri de 6 cm de diámetro y se analiza la virulencia de las células planctónicas y conectado a superficie. Culturas fueron inoculadas de colonias solo en las culturas PS:DB, cultivadas durante la noche en tubos de cultivo en un tambor de rodillo a 37 ° C saturación, diluido 1: 100 en PS:DB, cultiva para 8 h de 6 cm de diámet...

Aquí, presentamos un protocolo para medir la virulencia de las bacterias planctónicas o conectado a superficie utilizando D. discoideum (ameba) como anfitrión. Virulencia se mide durante un período de 1 h y anfitrión matando se cuantifica usando análisis de imagen y microscopia de fluorescencia. Demostramos este protocolo utilizando la bacteria p. aeruginosa.

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patogénesis bacteriana, como cuándo se expresan los efectores de virulencia que matan al huésped en las células bacterianas y cuáles son los estados de virulencia de las células implantónicas adheridas a la superficie. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, cuantitativa y las células huésped son relativamente fáciles de manejar. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que la subpoblación implantónica de Pseudomonas adherida a la superficie tiene diferentes fenotipos que matan al huésped.Para comenzar, cultive la cepa BR de E. coli durante la noche, como se describe en el protocolo de texto. A continuación, lleve el cultivo de E. coli a temperatura ambiente. Con un palo de madera, inocular la ameba en 750 l de cultivo.Agregue inmediatamente 700 l de la mezcla de ameba E. coli a una placa GYP. Incline la placa para esparcir el cultivo de manera uniforme en la superficie de la placa. Luego coloque el plato en una caja que mantenga alta humedad.Incubar la placa dentro de la caja a 22 C durante cuatro o cinco días. Una vez finalizado el período de incubación, u

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Fuente: Morales-Soto, N. et. al., Preparación, obtención de imágenes y cuantificación de ensayos de motilidad de la superficie bacteriana. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra un ensayo de enjambre utilizando bacterias que expresan proteína verde fluorescente para observar la motilidad de la superficie en agar blando. Las imágenes de lapso de tiempo capturan la expansión coordinada y la formación de zarcillos, destacando la motilidad de la superficie bacteriana.

Ensayo de enjambre para visualizar la motilidad de la superficie bacteriana

Fuente: Chen, Y., et al. Evaluación de la virulencia y patogénesis de la infección por Aeromonas en un modelo de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo muestra el ensayo de toxicidad líquida de C. elegans con Aeromonas, un método utilizado para evaluar la virulencia bacteriana midiendo la supervivencia de gusanos en un entorno líquido con pocos nutrientes. El ensayo revela patogenicidad específica de la cepa basada en la extensión del daño y mortalidad inducidos por toxinas en C.

Evaluación de la virulencia bacteriana utilizando el ensayo de toxicidad líquida de C. elegans

Fuente: Perinbam, K., y Siryaporn, A. Un ensayo rápido de virulencia bacteriana basado en imágenes usando ameba. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demuestra un método rápido basado en imágenes para evaluar la virulencia bacteriana incubando amebas con bacterias adheridas a la superficie o planctónicas, aplicando una almohadilla de agarosa de calceína-acetoximetilo (calceína-AM) y obteniendo imágenes de fluorescencia para detectar daños en las células huésped.

Un ensayo rápido basado en imágenes para el cribado de virulencias bacterianas inducidas por la superficie

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Este video muestra un ensayo para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos derivados de la médula ósea (BMM). Las células macrófagas están infectadas con los estadios invasivos móviles y no móviles de Leishmania, promastigotes metacíclicos y amastigotes, respectivamente. Los parásitos invaden los macrófagos, se internalizan en una vacuola parasitófora y se multiplican en su interior. El crecimiento intracelular del parásito se cuantifica utilizando un microscopio tras...

Un ensayo in vitro para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos

Se describe un ensayo cualitativo para supervisar la competencia bacteriana mediada por...

Un ensayo visual para monitorear T6SS mediada por la competencia bacteriana

Se describe un método para el seguimiento de la ruptura del endomembrane provocada por las bacterias...

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Esta técnica proporciona un método para cosechar, normalizar y cuantificar el crecimiento intracelular de las bacterias patógenas que son pre-cultivadas en células naturales protozoos anfitrionas antes de las infecciones de las células de mamíferos. Este método puede ser modificado para acomodar una amplia variedad de células huésped para la fase de cebado así como los tipos de células diana.

Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Cocultivo de amebas es un sistema de cultivo celular usando amebas adherente a crecer selectivamente a los patógenos intracelulares capaces de resistir las células fagocíticas tales como amebas y macrófagos. Por lo tanto, representa una herramienta clave para descubrir nuevos agentes infecciosos. Enriquecimiento amebas permite el descubrimiento de nuevas especies de amebas y de sus bacterias intracelulares específicos.

Descubrimiento de nuevos patógenos intracelulares por amebas Coculture y Enfoques amebas Enriquecimiento

Describimos aquí los últimos avances en aislamiento viral para la caracterización de nuevos genotipos de Faustovirus, un nuevo linaje de virus gigantes relacionado con asfarvirus. Este protocolo se puede aplicar al aislamiento de alto rendimiento de virus, especialmente virus gigantes que infectan amebas.

Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

Este procedimiento describe cómo visualizar, rastrear y cuantificar Acanthamoeba spp. motilidad.

Cuantificación de Acanthamoeba spp. Motilidad

Aprende a medir la virulencia bacteriana de forma rápida y cuantitativa utilizando Dictyostelium discoideum como hospedero. Este protocolo emplea microscopía de fluorescencia para evaluar efectos de muerte celular en una hora.

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

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