Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patogénesis bacteriana, como cuándo se expresan los efectores de virulencia que matan al huésped en las células bacterianas y cuáles son los estados de virulencia de las células implantónicas adheridas a la superficie. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, cuantitativa y las células huésped son relativamente fáciles de manejar. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que la subpoblación implantónica de Pseudomonas adherida a la superficie tiene diferentes fenotipos que matan al huésped.

Para comenzar, cultive la cepa BR de E. coli durante la noche, como se describe en el protocolo de texto. A continuación, lleve el cultivo de E. coli a temperatura ambiente. Con un palo de madera, inocular la ameba en 750 l de cultivo.

Agregue inmediatamente 700 l de la mezcla de ameba E. coli a una placa GYP. Incline la placa para esparcir el cultivo de manera uniforme en la superficie de la placa. Luego coloque el plato en una caja que mantenga alta humedad.

Incubar la placa dentro de la caja a 22 C durante cuatro o cinco días. Una vez finalizado el período de incubación, utilice una punta de pipeta estéril para recoger las esporas de ameba de la mitad de la placa. A continuación, pipetea hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender la ameba en la punta de la pipeta en 1 ml de medio PS.

Transfiera la mezcla de inoculado a un matraz de 250 mL con 25 mL de medio PS suplementado con solución antibiótica antimicótica. Haga crecer la ameba a 22 C en un agitador giratorio a 100 rpm. Después de cultivar Pseudomonas aeruginosa durante la noche, diluir el cultivo con medios PSB en una placa de Petri de 6 cm.

A continuación, agite el cultivo en un rotador de sobremesa ajustado a 100 rpm a 37 C. Primero microondas 50 mL de agar al 1% en tampón DB en un matraz de 250 mL. Añadir 15 L de calcio AM a los 15 mL de agar fundido y mezclar suavemente. Vierta la mezcla de agar fundido en un plato de vidrio de 12 por 10 cm y deje que el agar se solidifique durante diez minutos a temperatura ambiente.

A continuación, utilice una regla de metal y una rejilla impresa para cortar la almohadilla de agar solidificada en secciones más pequeñas de 1,5 por 1,5 cm. Asegúrese de que el gel permanezca hidratado hasta que esté listo para usar. A continuación, para aislar las células adheridas a la superficie, retire el medio líquido de la placa de Petri.

A continuación, lave el plato con 1 ml de tampón de desarrollo para eliminar las células planctónicas. Para analizar la virulencia de las células bacterianas adheridas a la superficie, agregue 10 L de células de ameba de las células bacterianas adheridas a la superficie obtenidas anteriormente. Para aislar las células planctónicas, transfiera 10 L del cultivo a una placa de Petri fresca.

A continuación, ensaye la virulencia de las células planctónicas mezclando 10 L de células de ameba con las bacterias planctónicas obtenidas previamente. Coloque inmediatamente la pequeña almohadilla de agar encima de la mezcla de bacterias ameba apropiada en la superficie de la placa de Petri. Luego, retire el exceso de líquido pipeteando suavemente el exceso de líquido y deje que el plato se seque durante 20 minutos.

Cubra el plato con la tapa e incube a temperatura ambiente durante 40 minutos más. Por último, utilice un microscopio de fluorescencia para obtener imágenes de al menos 100 células de ameba. En este protocolo, se analizó la virulencia de células planctónicas y de Pseudomonas aeruginosa adheridas a la superficie.

Ameba muerta de tipo salvaje adherida a la superficie Pseudomonas aeruginosa, indicada por una forma de célula de ameba redonda y la presencia de fluorescencia de calceína. En comparación con las células planctónicas, las células silvestres adheridas a la superficie, Pseudomonas aeruginosa tenían un alto índice de muerte del huésped. Las células planctónicas fueron consumidas por la ameba, lo que indica la forma amorfa de las células de ameba y la fluorescencia de la calceína relativamente pequeña.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar una reserva fresca de calceína AM y células de ameba y mantener un seguimiento cercano de la densidad óptica de la ameba. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la elaboración de perfiles de transcripción, para responder a preguntas adicionales como ¿Qué genes se activan en la subpoblación planctónica y adherida a la superficie? Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el ensayo de virulencia rápido basado en imágenes.