Preparación de muestras de larvas de Drosophila para cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)-base metabolómica

Este método puede responder a preguntas clave en el campo del metabolismo, como por ejemplo cómo se sintetiza el oncometabolito L2-hidroxiglutarato en células sanas. La principal ventaja de esta técnica es que permite al usuario medir directamente más de 100 metabolitos de forma sensible y reproducible. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el protocolo requiere un procesamiento eficiente de la muestra y es extremadamente sensible al vapor de agua.

Para comenzar el protocolo, agregue un mililitro de cloruro de sodio al 0,9% helado en un tubo de 1,5 mililitros que contenga larvas previamente preparadas. Cierre la tapa, voltee verticalmente el tubo para lavar bien las larvas y coloque el tubo en hielo durante 30 segundos. Las larvas se hundirán hasta el fondo del tubo, pero la levadura permanecerá en suspensión.

Una vez que todas las larvas hayan formado un pellet suelto, retire la solución de cloruro de sodio con una pipeta de un mililitro. Centrifugar las muestras a 2.000 g durante un minuto a cuatro grados centígrados. Retire toda la solución residual con una pipeta de 200 microlitros e inmediatamente congele la muestra en nitrógeno líquido.

Use un marcador a prueba de etanol para etiquetar el costado de un tubo de cuentas con tapa de rosca de dos mililitros. A continuación, tara la masa del tubo de cuentas marcado utilizando una balanza analítica capaz de medir con precisión 0,01 miligramos. Use pinzas largas para extraer el tubo de muestra de 1,5 mililitros del dewar de nitrógeno líquido.

Con guantes de nitrilo, agarre el tubo congelado, inviértalo y golpee bruscamente la tapa del tubo contra la mesa de trabajo para desalojar el pellet congelado. Vierta inmediatamente el pellet en un tubo de cuentas con tapón de rosca de dos mililitros previamente tarado. La muestra debe procesarse rápidamente para garantizar que las vías metabólicas endógenas no se reactiven.

Mida rápidamente la masa combinada del pellet larvario y el tubo de cuentas. Coloque inmediatamente el tubo de muestra en nitrógeno líquido. Coloque los tubos de muestra en un refrigerador de sobremesa a 20 grados centígrados negativos.

Agregue 0,8 mililitros de metanol al 90% preenfriado que contenga dos microgramos por mililitro de ácido succínico-D4 en cada tubo. Regrese las muestras a la nevera de sobremesa de 20 grados centígrados negativos. Establezca un control negativo añadiendo 0,8 mililitros de metanol al 90% preenfriado que contenga dos microgramos por mililitro de ácido succínico-D4 en un tubo de perlas vacío.

A continuación, homogeneice las muestras durante 30 segundos a 6,45 metros por segundo utilizando un homogeneizador de molino de bolas situado en una sala de control de temperatura de cuatro grados centígrados. Regrese las muestras homogeneizadas al refrigerador de sobremesa de 20 grados Celsius negativos y transfiera el refrigerador a un congelador de 20 grados Celsius negativos durante al menos una hora. Después de la incubación, centrifugar los tubos a 20.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para eliminar el precipitado resultante.

Transfiera 600 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y no altere el precipitado. Abra todos los tubos de muestra y colóquelos en una centrífuga de vacío. Seque las muestras a temperatura ambiente hasta que se elimine todo el solvente.

Si las muestras secas se almacenaron a menos 80 grados centígrados, coloque los tubos de muestra sin abrir en una centrífuga al vacío y séquelos durante 30 minutos. Prepare una solución de 40 miligramos por mililitro de clorhidrato de metoxilamina, o MOX, en piridina anhidra. Guarde el MOX y la piridina en un desecador.

A continuación, use una pistola de calor para secar una jeringa de vidrio de un mililitro durante unos cinco segundos. Inserte la aguja de la jeringa en el frasco de piridina anhidra. Retire un mililitro de piridina y agréguelo a un tubo de microfuga que contiene 40 miligramos de MOX.

Esta parte del protocolo es extremadamente sensible al agua. Todos los reactivos deben almacenarse en un desecador antes de su uso. Además, el usuario debe asegurarse de que la muestra tenga una exposición mínima al vapor de agua atmosférico.

A continuación, enjuague el frasco de piridina anhidra con argón. Selle la botella y devuélvala al desecador. Disuelva el MOX en piridina incubando el tubo en un mezclador térmico a 35 grados centígrados durante 10 minutos a 600 rpm.

A continuación, agregue 40 microlitros de 40 miligramos por mililitro MOX en solución de piridina anhidra a la muestra seca. Agite la muestra durante 10 segundos y centrifugala brevemente. A continuación, incubar la muestra en un mezclador térmico.

Centrifugar la muestra a 20.000 g o velocidad máxima durante cinco minutos para eliminar las partículas. Transfiera 25 microlitros del sobrenadante a un vial de muestreador automático con un inserto de microvolumen de vidrio desactivado de 250 microlitros. Agregue 40 microlitros de MSTFA que contengan 1% de TMCS.

Coloque una tapa en el vial del muestreador automático y selle el vial con una herramienta de engarzado. Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante una hora con agitación a 250 rpm. Por último, añada tres microlitros de solución estándar de éster metílico de ácidos grasos previamente preparada, o FAMES, al vial del muestreador automático utilizando un muestreador automático robótico inmediatamente antes de la inyección.

La cromatografía de gases-espectrometría de masas de larvas mutantes de lactato deshidrogenasa exhibe cambios significativos en lactato, piruvato y L2-hidroxiglutarato en comparación con las larvas de control. Los espectros GC-MS generados con el protocolo muestran muchas características visibles y un pico notable para la trehalosa, que normalmente representa el pico más grande en una muestra de larvas. El análisis de componentes principales, o PCA, muestra claramente que los grupos knockout y wild-type se separan entre sí y que no hay valores atípicos en ninguno de los grupos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las muestras congeladas antes de la homogeneización y mantener todos los reactivos secos durante todo el procedimiento.