Name: Método basado en una punta de pipeta para siembra células gota microfluídicos plataformas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Aprenda a encapsular células raras en gotas microfluídicas utilizando puntas de pipeta y chips PDMS. Este método mejora la eficiencia de encapsulación para estudiar la heterogeneidad celular en inmunología de sistemas.

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Agradecemos a la Universidad Tecnológica de Eindhoven por generoso apoyo.

1. entrada de 3 fabricación de dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS)
<ol><li>Medir 40 g de base PDMS en una mezcladora de acondicionado de la taza y añadir 4 g de agente de curado de PDMS para el reactivo con base en la Copa, con cuidado, usando un gotero.</li>
	<li>Coloque la taza de la batidora de acondicionado y medir el peso total de la Copa con el titular. Establecer el valor del peso de equilibrio de la centrífuga en el mezclador de acondicionado en consecuencia.</li>
	<li>La base de la mezcla y curado agente en el mezclador de acondicionado a 2.000 rpm por 2 min seguido por la formación de espuma a 2.000 rpm por 2 min.</li>
	<li>Preparar un barco de aluminio, con un diámetro de aproximadamente el mismo tamaño que el de una oblea de silicio de 100 mm. Colocar la oblea de silicio, para la réplica del moldeado, en el barco de aluminio y poner esta configuración en un plato de Petri (diámetro = 120 mm, altura = 20 mm). Nota: El tamaño de la caja Petri depende del tamaño de la oblea de silicio.</li>
	<li>Retire la taza del soporte y vierta la mezcla previamente curada de PDMS (contenido de la taza), cuidadosamente, sobre la oblea de silicio.</li>
	<li>Coloque la placa de Petri, que contiene la oblea de silicio con la mezcla previamente curada de PDMS, en un desecador durante unos 20 minutos para eliminar todas las burbujas de aire.</li>
	<li>Retire la placa de Petri después de 20 min y verificación por quedan burbujas de aire que se puede quitar.</li>
	<li>Coloque la placa de Petri en un horno a 65 ° C, durante al menos 3 horas.</li>
	<li>Retire la placa de Petri del horno después de 3 h y pelar cuidadosamente el PDMS curados de la oblea de silicio.</li>
	<li>Dispositivos PDMS cortados a lo largo de las líneas de corte, usando un cuchillo o un bisturí. Perfore agujeros en las entradas y salida de cada dispositivo utilizando un golpeador de 1,2 mm. Limpie cada aparato PDMS con cinta scotch para quitar cualquier polvo o residuo pedazos de PDMS.<ol>
<li>Opcionalmente, soplado con nitrógeno para eliminar piezas PDMS residual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpieza con agua jabonosa, seguido de isopropanol y secado con nitrógeno para preparar portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Enlazar un dispositivo limpio de PDMS con un portaobjetos de vidrio limpio en un plasma asher para cerrar las líneas de flujo. Utilice la siguiente configuración: potencia: 50 W, tiempo: 45 s, tiempo de retardo de la purga: 2 s, gas de proceso: 1 Gas (aire), ventilación: ambas válvulas, tiempo de ventilación restringida: 60 s, giro de bomba de tiempo: 10 s, tiempo de espera de ventilación: 0 s, tiempo de cierre de Gas: 1 s, Turbo bombeo habilitado : 0. Desconecte todas las líneas de gas. Nota: Los valores utilizados para el plasma que Asher puede variar según la marca del plasma asher utilizado.</li>
	<li>Preparar la solución de silano agregando 50 μl de silano (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane) a 950 μl de fluorados en aceite. Nota: Silano es tóxico. Por favor operan bajo campana.</li>
	<li>Extraer la solución de silano preparado en una jeringa, que está conectada a un tubo de teflón.</li>
	<li>Salinize el dispositivo por la solución de silano preparados a través de la salida del dispositivo de lavado.</li>
	<li>Coloque el dispositivo en un horno a 65 ° C, durante 30 minutos.</li>
	<li>Retire el dispositivo salinizado del horno y eliminar exceso silano del aparato con aceite fluorado.</li>
	<li>Coloque el dispositivo en un horno a 65 ° C, durante al menos 1 h completar el proceso de vinculación. Nota: El protocolo se puede detener aquí.</li>
</ol>2. pérdida menos células encapsulado
<ol><li>
Recolección de células
	<ol>
<li>Resuspenda las células Jurkat T en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) en concentraciones de 1.0x106 células/mL, 2.0x106 células/mL, 4.0x106 células/mL y 8.0x106 células/mL; PDC en hematopoyéticas sin suero medios de cultivo (por ejemplo, VIVO X 15) en concentraciones de 1.3x106 células/mL, 3.0x106 células/mL y 13.0x106 células/mL; Células A549 en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) a una concentración de 1.0x106 células/mL. Nota: El tipo de células y la concentración de las células puede variar basado en el experimento. Etiquetado de células puede también hacerse en base a la experiencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Carga punta para la generación de gotas acuosas
	<ol>
<li>Preparar aceite fluorado con mezcla de surfactante biocompatible 3% mediante la adición de 3 mL de surfactante 2 ml de aceite fluorado. Nota: La concentración del tensioactivo añadido al aceite fluorado determina la estabilidad de la emulsión para períodos de incubación diferentes. La concentración del tensioactivo varía en función de los medios utilizados para tipos específicos de células.</li>
		<li>Sacar la mezcla de la fase de aceite en una jeringa (1 mL). Eliminar burbujas de aire de la jeringa y conectar a una tubería del Teflon de la longitud correcta.</li>
		<li>Preparar una jeringa de muestra dibujo aceite mineral biocompatible en una jeringa. Eliminar burbujas de aire y conectar la jeringa a un tubo de teflón de la longitud correcta.</li>
		<li>Perforar un enchufe PDMS con un diámetro de 5 mm de una losa PDMS curada. Nota: La losa curada de PDMS se puede preparar usando pasos 1.1 a 1.9. Use una oblea de silicio llano en lugar de una oblea de silicio fabricado.</li>
		<li>Perfore otro agujero en el centro de la clavija con un punzón de 1 mm.</li>
		<li>Inserte el enchufe en una punta de pipeta μl 200, desde el extremo más grande, tal que se ajuste bien. Nota: Use una punta de pipeta 1.000 μl de volumen de muestra más grande y más grande. Para punta de 1.000 μl de pipeta, pueden utilizarse tapones de entre 5 mm y 7 mm de diámetro. Con un tapón de diámetro 5 m m, un volumen de muestra de alrededor de 400 μL puede ser aspirado en la punta de la pipeta. Si un enchufe de mayor diámetro es usada (7 mm), puede aspirarse más volumen de la muestra (alrededor de 900 μL).</li>
		<li>Inserte la tubería, que está conectada a la jeringa en el tapón PDMS, que se ha insertado en la punta de la pipeta. Empuje el émbolo lentamente para llenar la pipeta conectada con aceite mineral. Expulsar todo el aire residual de la punta de la pipeta.</li>
		<li>Bajar la punta de la pipeta, conectada a la jeringa, en la solución de muestra y aspirar unos 150 μL de la muestra en la punta.</li>
		<li>Repita los pasos 2.2.4 al 2.2.8 para preparar una segunda jeringa de muestra.</li>
		<li>Coloque con cuidado todas las tres jeringas preparadas en la bomba de jeringa.</li>
		<li>Introduzca ambos las puntas de pipetas, que contienen la muestra en las dos entradas de interiores de la viruta PDMS. Inserte el tubo que contiene la mezcla de la fase de aceite en la entrada exterior.</li>
		<li>Establecer el valor de las tasas de flujo de la bomba de jeringa como sigue: solución de fase continua: 600 muestras de células μl por hora: 100 μl/h, cada. Introducir y establecer las dimensiones de la jeringa. Nota: El diámetro configuración variará basado en el tipo de jeringa.</li>
		<li>Arrancar la bomba para solución de la muestra a través de los canales internos de la fase aceite y dispositivo a través del canal externo del dispositivo.</li>
		<li>Conecte un tubo de longitud adecuada al tomacorriente para comenzar a recoger las gotas cuando la formación de la gotita es estable. El tiempo de colección varía basado en el experimento.</li>
		<li>Recoger las gotas en un tubo de bloqueo. Añadir 200 μL de Medio RPMI (sin suero) en la parte superior las gotas recogidas e incubar la muestra. Nota: Incubación tiempo de gotas recogidas varía basado en el experimento. Gotitas se recogen en un tubo de bloqueo cuando el análisis basado en la citometría de flujo o el aislamiento se realiza después de recuperar las células de las gotas mediante la ruptura de la emulsión. Es posible recoger las gotitas en una cámara de cristal si el experimento requiere análisis microscópico de la gota.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperación de última hora y de la célula para análisis cytometric del flujo de la emulsión
	<ol>
<li>Preparar 20% 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-1-octanol (FOP) solución (v/v) aceite fluorado agregando 2 mL de FOP en 10 mL de aceite de flourinated.</li>
		<li>Quitar el aceite sobrante de la parte inferior del tubo de la colección, que contiene las gotas, utilizando una jeringa.</li>
		<li>Añadir 100 μl de solución al 20% FOP a la emulsión para romper la emulsión y liberar las células encapsuladas en la fase acuosa. Toque y mezclar brevemente. No en este momento no agitar con vortex. Incubar durante 1-2 min. Nota: La cantidad de PFO agregado depende de la cantidad de gotas producidas. Seguir añadiendo PFO adicional hasta que la capa de aceite se disuelva totalmente. Tenga en cuenta que FOP es tóxico para las células y que podría dar lugar a concentraciones de PFO demasiado alto o demasiado larga incubación de PFO aumenta la muerte celular.</li>
		<li>Girar la solución poco en el SCR posible más bajo de 30 s.</li>
		<li>Preparar 100 mL solución fría de Phosphate-Buffered salina (PBS) suplementada con 2% suero Fetal de ternero (FCS) (2 mL de FCS en 98 mL de PBS).</li>
		<li>Pipetee 550 μl de la fracción acuosa, inmediatamente después de la centrifugación y transferir a un tubo nuevo de la cerradura que contiene 500 μl de solución fría de PBS suplementado con 2% FCS, preparada en el paso 2.3.5. Dejar que cualquier aceite residual fregadero a la parte inferior del tubo nuevo de la cerradura.</li>
		<li>Aspire a 950 μl de la fase acuosa que contiene las células de este tubo de bloqueo, con cuidado, sin aspiración de cualquier aceite residual y transferir la solución a un tubo nuevo de la cerradura.</li>
		<li>Desactivación de las células en el tubo nuevo de la cerradura durante 10 minutos.</li>
		<li>Resuspenda las células en 300 μL de solución fría de PBS suplementado con 2% FCS, preparada en el paso 2.3.5. Nota: Las células pueden también volver a suspenderse en cualquier otra solución adecuada como media según el experimento. Se tiñen las células, basadas en el experimento, para el análisis mediante citometría de flujo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. célula maridaje
<ol><li>
Cosecha celular y la coloración
	<ol>
<li>Las células Jurkat T, frasco de cultura y girar por las células a 1.500 rpm por 5 minutos.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y Resuspenda 1.0x106 células en 1 mL de PBS para obtener una concentración de 1.0x106 células/mL. La cantidad de PBS agregadas depende de la cuenta de célula.</li>
		<li>Repita los pasos del 3.1.1 a 3.1.2 para preparar una segunda muestra de las células de Jurkat T con la misma concentración celular.</li>
		<li>Lave ambas muestras dos veces con 1 mL de PBS a 1.500 rpm por 5 minutos.</li>
		<li>Vuelva a suspender una muestra de células con 1.25 tinte de éster (CFSE) μm carboxyfluorescein succinimidyl y otra muestra de la célula con 1,25 μm mucho rojo tinte o 1,25 μm células proliferación tinte a una concentración celular de 1.0x106 células/mL. La total solución de tinción es de 1 mL para 1.0x106 células. Nota: Las células pueden estar etiquetadas con tintes diferentes dependiendo de los filtros disponibles en el citómetro de flujo o en el microscopio de fluorescencia.</li>
		<li>Incubar las muestras de células con tintes durante 10 min a 37 ° C.</li>
		<li>Detener la reacción de tinción mediante la adición de 1 mL de hielo frío FCS después de 10 min.</li>
		<li>Lavar las muestras de células dos veces con 1 mL de PBS a 1.500 rpm por 5 minutos.</li>
		<li>Vuelva a suspender las muestras de células en medios RPMI a una concentración de 10.0x106 células/mL, para cada color.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Carga punta para la producción de gotitas de hidrogel de agarosa para el emparejamiento de celular Nota: Para celular emparejado utilizando agarosa hidrogel gotas, mantener la temperatura del sistema entre 27 ° C y 37 ° C durante todo el droplet generación y colección de proceso para evitar la gelificación de los hidrogeles y para justificar la viabilidad celular9.<ol>
<li>Disolver la agarosa de temperatura gelificación bajas calentando hasta 75 ° C en PBS a una concentración de 4% (p/v) y removemos la mezcla durante 20 minutos.</li>
		<li>Mezcle la solución de agarosa con T Jurkat con células para producir una concentración de agarosa al 2% (w/v). Repita esto para la otra muestra con células diferentemente marcadas.</li>
		<li>Preparar aceite fluorado con mezcla de surfactante 2% mediante la adición de 20 mL de surfactante a 30 mL de aceite fluorado (mezcla de aceite de la fase).</li>
		<li>Siga los pasos 2.2.2 - 2.2.14. Nota: Debido a la naturaleza viscosa de agarosa bajo de fusión y para asegurar una producción estable de la gotita, establezca el valor de las tasas de flujo en las bombas de jeringa como sigue: aceite mezcla de fase: 2.000 muestras de células μl/h: 200 μL/h. introducir y establecer las dimensiones de la jeringa.</li>
		<li>Recoger las gotas en un tubo de bloqueo e incubar las gotas a 4 ° C durante 60 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ruptura de la emulsión y agarosa grano recuperación para el análisis FACS
	<ol>
<li>Después de la incubación de gotas durante 60 min, quitar exceso de aceite por el tubo de bloqueo, que contiene las gotas, utilizando una jeringa.</li>
		<li>Añadir 200 μL de FOP para quitar la interfase de aceite de las gotitas. Nota: La cantidad de PFO agregado al tubo depende de la cantidad de gotas producidas. Seguir añadiendo PFO adicional hasta que la capa de aceite se disuelva totalmente.</li>
		<li>Lavar las perlas de agarosa recogidos dos veces con 1 mL de PBS frío para eliminar totalmente el aceite por centrifugación a 1.500 rpm por 10 min.</li>
		<li>Analizar cuentas de agarosa recogidos mediante citometría de flujo. Nota: También es posible observar los granos bajo un microscopio de fluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

En este protocolo, hemos demostrado una técnica eficaz y sencilla para cargar y encapsular las células en gotas para el análisis de alto rendimiento, unicelular y realizar celular controlada maridaje para los estudios de interacción celular. Además, hemos comparado varios enfoques convencionales para cargar las células dispositivos microfluídicos y demostró que nuestra punta de carga del enfoque es una técnica más eficiente en comparación con otros métodos.
Estudio de muestras clínicas o tipos raros de la célula escasos en número de microfluídica basada en gotitas poseen algunos desafíos inherentes. Como también hemos demostrado, las células tienden a sedimentos en jeringas y en superficie de la tubería, de tal modo, prevención de encapsulación celular para ajustarse a los valores predichos. Para evadir este problema, algunos grupos utilizan barras de agitación en las jeringuillas. Sin embargo, al utilizar poblaciones celulares raro y limitado, el volumen celular total es también limitado, de tal modo, limitar el uso de jeringas grandes y barras de agitación. Además, también sustituimos el tubo más comúnmente utilizado con Teflon cubierto de la tubería para prevenir el accesorio de celular pero este método no mejoró los resultados y si la tubería es demasiado larga, el problema de la fijación celular agrava (datos no mostrados). Por otra parte, hemos utilizado un tubo vertical de carga enfoque donde las células se cargan en el tubo y no en la jeringa para evitar la pérdida de células en volumen de jeringa grande. Usando esta técnica, las células con volumen de muestra pequeño se pueden cargar, por ejemplo, el PDC que es raras y limitadas. Además, la muestra del tubo se carga al dispositivo de posición vertical para evitar la sedimentación de células. El tubo utilizado para la siembra de la célula tiene pequeñas dimensiones y puede ser comparado con microcanales. El flujo en la tubería es impulsado por la presión y sigue un perfil parabólico velocidad del26. Esto implica que la velocidad de flujo máxima está en el centro de la tubería y velocidad mínima en los bordes del tubo27. Cuando una población de células a través del tubo de lavado, el gradiente de velocidad hace que las células que se empujará hacia los bordes donde establecen porque la velocidad en el límite es cercano a cero. La sedimentación o el asentamiento de las células en el tubo, por lo tanto, reduce la eficacia de encapsulación como se muestra en los resultados representativos donde los datos experimentales no coinciden con el modelo previsto.
Otra solución adapta comúnmente utilizada por los científicos, que trabajan con la gotita microfluídica, es aumentar la densidad de los medios de cultivo celular por adición de densidad que reactivos, tales como Iodinaxol para evitar la sedimentación de células en jeringas19. Sin embargo, densidad de juego reactivos puede influir el comportamiento celular y negativamente afectan la secreción de citoquinas por las células (datos no mostrados)28.
A pesar de varias modificaciones pequeñas y grandes en la pila convencional carga técnicas mostraron ligeras mejoras en eficiencia de encapsulación, los resultados experimentales obtenidos todavía no coinciden con los cálculos teóricos. Sin embargo, con la punta de carga del enfoque podríamos superar las limitaciones de los métodos anteriores y eficiencia de encapsulación gobernadas por estadística de Poisson. Esta técnica no sólo es ventajosa para la suspensión de células de carga, pero puede aplicarse también para la carga de células adherentes, como queratinocitos primarios y A549 en chips de microfluídica. Al utilizar líneas de células abundantes, por ejemplo A549, K562, etc., puede utilizar mayor volumen de la muestra. Por lo tanto, según el volumen de la muestra, también se pueden utilizar diferentes tamaños de puntas de pipeta y esta técnica simple puede ser adaptada para encapsulación de unicelular y encapsulación de células múltiples.
Mientras que la concentración de células baja es necesaria para la encapsulación de células individuales en gotitas, altas concentraciones de células se desean aumentar el número promedio de células encapsuladas en cada gotita para estudios relacionados con la sincronización celular. Hay varios métodos de unicelulares que se han descrito previamente a las células inmunes par en chips de microfluídica o recientemente nanowells29,30,31. En gota de microfluídica, Poisson estadística dicta maridaje para dos diferentes tipos de células de ese celular de 1:1 se logra a concentraciones óptimas de la célula. Basado en la predicción de Poisson, también hay una probabilidad que gotitas pueden contener otras combinaciones. Mientras que emparejamiento 1:1 la célula puede ser deseable para el estudio de las interacciones celulares en la célula y genera mayor comprensión celular, múltiples células emparejamiento tiene también grandes ventajas. Permite para comprender la influencia de múltiples células de un tipo de célula en otro tipo de célula. Entre las células inmunes diferentes ayudan a generar una respuesta inmune efectiva contra varias infecciones y patógenos y también añade solidez a nuestro sistema inmunológico32. Como tal, la comunicación celular puede ser interrogado con alta precisión en distintos contextos, por ejemplo, 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, etcetera. rendimiento mayor comprensión sobre cómo único o pares de células controlan de la inducción de respuestas inmunes. Esto es particularmente interesante para estudiar por ejemplo la capacidad de las células asesinas naturales o células de T citotóxicas para matar en serie sus células de destino respectivo.
Como hemos comentado, para la encapsulación de varias de las células en gotas, se desean altas concentraciones celulares. Sin embargo, al cargar las células de una entrada para la encapsulación de células, concentraciones más altas de la muestra de células pueden causar células de agregado en la entrada. Esto resulta en tasas más bajas de la encapsulación y la mayor desviación de los valores teóricos. Para evadir este problema, las células pueden ser cargadas desde dos entradas separadas así. Teóricamente, sería posible desarrollar dispositivos microfluídicos con entradas múltiples para alcanzar niveles más altos de la encapsulación de la célula donde está garantizado un promedio x número de células. En este estudio se investigó la eficacia de la encapsulación de células Jurkat T cuando cargado de una entrada y dos entradas, utilizando la misma concentración total y obtuvo similar eficiencia de encapsulación. Esta modificación permite a los investigadores par diferentes tipos de células en el chip.
Mientras que este método ayuda en la carga de dispositivos microfluídicos sin pérdida significativa de las células de las células, hay ciertas precauciones que deben tenerse en cuenta. Cuando llene las jeringas con aceite mineral y aspirando la muestra de células en las puntas de pipeta, debe evitarse la incorporación de burbujas de aire y el sistema entero debe estar libre de aire. También es importante tener en cuenta que el aceite mineral no debe mezclar con la muestra. Puntas de pipeta, que contienen las muestras, deben insertarse firmemente en las entradas del dispositivo microfluídico, con extrema precaución, para evitar fugas y mayor incorporación de burbujas de aire. Para resumir, carga de punta es una técnica sencilla, pero robusta que permite el análisis de alto rendimiento del comportamiento celular a través de la encapsulación de la célula sin pérdida significativa de células de una manera rentable. Cuando se utiliza con las concentraciones de la muestra óptima en la entrada, este enfoque de células con puntas de pipeta de carga es muy flexible y puede ser adaptado para que diferentes tipos de células, especialmente para las células inmunes primarias raras, para obtener una mayor eficiencia de encapsulación, cerca modelos predichos.

En los últimos años, el uso de la microfluídica como una plataforma robusta y versátil para el análisis celular a nivel unicelular tiene rápidamente creciente1. Estas plataformas proporcionan detección de alto rendimiento de las células y moléculas biológicas de alta precisión y sensibilidad muy pequeña muestra volumen2,en3,4. Entre los diferentes tipos de diseños de microfluidos, plataformas basadas en gotita para habilitar análisis de alto rendimiento de las células aislándolos en una gota de fase acuosa rodeada de una fase inmiscible que permite un control preciso y exacto sobre el celular microambiente5,6. Microfluídica basada en gotas da la flexibilidad para aislar una o varias células en, ambos, acuosa y gotas de hidrogel y es útil para sondear comportamientos celulares complejos, como proteína secreción o celular interacciones7, 8 , 9. señalización y diafonía entre las células inmunes pueden ser influenciados por interacciones con otras células en el microambiente10. Aislamiento de las células en gotas proporciona un laboratorio analítico sin ruido eficaz, libre de la influencia de factores externos ambientales más eficientes y precisos resultados11,12. Modificar el diseño de una plataforma de gota microfluídicos con múltiples entradas permite la encapsulación de los múltiples tipos de células para el estudio de interacciones celulares a través de emparejamiento de celular12,13.
El proceso de encapsulación de células en gotas es al azar y la tasa de encapsulación de células puede ser determinada estadísticamente utilizando la fórmula para la distribución de Poisson14,15. Esta tasa de encapsulación puede estimarse teniendo en cuenta la tasa promedio de la llegada de las células en el cruce de la gotita y asumiendo que la llegada de cada célula es independiente de la llegada de otro de las células16. A pesar de que no se puede garantizar la llegada de células independientes, en los casos de células escasamente distribuidas, puede considerarse la hipótesis de independencia y se puede predecir la probabilidad de que una gota que contiene una o más celdas en función del número de células presente en cada gotita y el número promedio de células por gota16,17. Ya que esta estimación de encapsulación celular en gotas es dependiente en el número de células presentes en cada gotita, uno puede sugerir que aumentando la concentración de las células en la entrada se incrementará el número promedio de células presentes en cada gotita 16. por lo tanto, para asegurar la encapsulación de la célula, las concentraciones de células deben reducirse pero esto a menudo conduce a un gran número de gotitas vacío18.
Pérdida de las células durante la carga por archivo adjunto, sedimentación, o agrupar en la jeringa, tubo o dispositivo de producción es un inconveniente común responsable de la desviación de los valores reales de la encapsulación de la encapsulación predicho valores19 . Este problema es más exagerado cuando siembra células inmunes o muestras clínicas ya son escasos en la población y la encapsulación de sólo unas pocas células, mucho menores de lo esperado, no proporciona datos suficientes para el análisis experimental. Las células dendríticas de plasmacytoid (PDC) son un subconjunto raro de las células inmunes que sólo constituye aproximadamente 0.2 - 0.6 por ciento de los blancos todo la sangre célula población20. Estas células secretan cantidades masivas de los interferones en la activación de tipo I y así desempeñar un papel decisivo en las respuestas inmunitarias21. Al estudiar el comportamiento celular de dichas células en gotitas, es imprescindible para evitar la pérdida de la célula durante la siembra de la célula y encapsulado22. Hay varios acontecimientos relacionados que han asegurado la encapsulación de células en activo encapsulado métodos que utilizan las fuerzas físicas diferentes como fuerzas acústicas o eléctricas para la generación de gotitas que contienen gotitas de diseño las células solo23,24. Sin embargo, estos métodos tienen sus propias limitaciones en cuanto a la producción de gotas16.
En este estudio, se estableció un método robusto y sencillo que evita las deficiencias de los métodos tradicionales para la carga de las células individuales o múltiples dispositivos microfluídicos. Nuestro método, inspirado en Rho et al., utiliza pipetas de diferente tamaño para la siembra de pequeños volúmenes de células inmunes a plataformas de microfluidos gotita sin pérdida significativa de la muestra y resultados que son coherentes con la teórica predicciones25. Esta metodología puede ser fácilmente y con éxito adaptado para varias aplicaciones en microfluídica basada en gota y aplica para una amplia variedad de tipos de la célula o incluso micropartículas.

<table><tbody><tr><td>1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-1-octanol &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>171468-5G</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrietoxysilano</td><td>Fluorochem/UK</td><td>S13150</td><td>Silano (tóxico)</td></tr><tr><td>Agarosa (temperatura de gelificación ultrabaja)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten</td><td>Fisher Scientific</td><td>10630694</td><td>Jeringa</td></tr><tr><td>Biopsy Punch 1.2 mm</td><td>Harris Uni-Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Proliferation Dye eFluro 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Far Red Cell</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos</td><td>Tubos Eppendrof Tubos</td><td></td><td>Safe-Lok 1 mL y 2 mL</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS294775X38-72EA</td><td>Portaobjetos de microscopio Corning, lisos L &times; W 75&nbsp; mm y tiempos; 38 y nbsp; mm</td></tr><tr><td>Bombas Harvard</td><td>Aparato</td><td>Harvard C-400750; C-400727</td><td>Bombas de jeringa</td></tr><tr><td>HFE-7500 3M Novec Fluido de ingeniería</td><td>Fluorochem/UK</td><td>51243</td><td>Aceite fluorado</td></tr><tr><td>Kai Biopsy Punch 5 mm</td><td>Amstel Medical</td><td>1980130</td><td></td></tr><tr><td>Luer</td><td>stub Instechlabs/USA</td><td>LS20S</td><td>Luer stub, 20ga (rosa) x 0,5 pulgadas (12 mm), no estéril</td></tr><tr><td>Aceite mineral (ligero)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato solución salina tamponada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>Tabletas</td></tr><tr><td>Pico-Surf 1 (5%en Novec 7500)</td><td>Sphere Fluidics</td><td>020317-09</td><td>Surfactante</td></tr><tr><td>Plasma Asher</td><td>Emitech</td><td>K1050X&nbsp;</td><td>Asher de plasma</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Base de elastómero de silicona 184</td><td>Sylgard</td><td>9355218</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>base Agente de curado de elastómero de silicona&nbsp;</td><td></td><td>Agente de curado 9355218 Sylgard&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acoplador de catéter de acero inoxidable</td><td>Instechlab/USA</td><td>SC20/15</td><td>20ga x 15mm, no estéril</td></tr><tr><td>TFE Tubo de teflón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58696-U Tubo de</td><td>PTFE&nbsp; L y veces; D.O. y tiempos; Diámetro interior: 50 pies y veces; 1/16 pulg. y tiempos; 0.031 pulg.</td></tr><tr><td>Mezclador Thinky ARE-250</td><td></td><td>EX-4025F</td><td>Mezcla acondicionadora</td></tr></tbody></table>

método basado en una punta de pipeta para siembra células gota microfluídicos plataformas

A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms

Entre varios microfluídicos plataforma diseños utilizados para el análisis celular, microfluídica gota proporciona una robusta herramienta para aislar y analizar las células en el nivel unicelular mediante la eliminación de la influencia de factores externos en el celular microambiente. Encapsulamiento de las células en gotas se basa en la distribución de Poisson en función del número de células presentes en cada gotita y el número promedio de células por volumen de gota. Células primarias, especialmente las células inmunes, o muestras clínicas pueden ser escasas y menos pérdida de encapsulación de células sigue siendo desafiante. En este trabajo, presentamos una nueva metodología que utiliza puntas de pipeta para cargar dispositivos microfluídicos basada en gotas sin la pérdida significativa de células de las células. Con varios tipos de células, demostramos la encapsulación de la célula eficiente en gotitas que corresponde estrechamente a la eficiencia de encapsulación predicha por la distribución de Poisson. Nuestro método garantiza menos pérdida de carga de las células para microfluidos plataformas y puede ser fácilmente adaptado para el análisis unicelular aguas abajo, por ejemplo, para descifrar las interacciones celulares entre diferentes tipos de células.

Para nuestros experimentos, se utilizó un dispositivo de microfluidos en base de PDMS 3-entrada a la altura de 25 micras (figura 1). En esta configuración del dispositivo, se utilizó la entrada externa para limpiar el aceite con surfactante y las dos tomas de interiores para limpiar las fases acuosas con suspensiones celulares o medios de comunicación. Después de generación y de colección, las gotitas incubar durante un par de horas fuera de la viruta antes de análisis aguas abajo usando citometría de flujo. Durante el período de incubación, componentes de suero presentes en los medios de comunicación pueden interactuar con el surfactante y causar las gotas se vuelven inestables y se desintegran. Por lo tanto, es importante agregar una concentración optimizada de surfactante al aceite fluorado. Probamos la estabilidad de las gotitas de generación que contienen hematopoyéticas sin suero medios de cultivo suplementado con 2% de suero humano con diferentes concentraciones de surfactante en aceite fluorado. Se puede inferir de la figura 2 que estas gotas de generación son altamente estable hasta 24 horas cuando menos 3% surfactante se agrega a la fase aceite. Resultados similares se obtuvieron con medios RPMI con o sin la adición de 10% FCS (datos no mostrados). Por lo tanto, estabilidad de la gota es altamente dependiente de concentraciones de surfactante óptima cuando se trabaja con diferentes fuentes de medios de cultivo y los componentes del suero.
Para demostrar la eficacia de encapsulación de nuestro enfoque nos siembran primero las células usando tubería conectada a jeringas, que es la aproximación más convencional para la siembra de las células (figura 3A). Cosecha de células Jurkat T a diferentes concentraciones de 1.0x106 células/mL, 2.0x106 células/mL y 4.0x106 células/mL y obtuvieron una eficiencia de encapsulación que fue menor que los valores predichos (figura 3B). 1.0x106 células/ml, la fracción de gotas que contenían una sola célula fue 2,5%, que no aumentó incluso al utilizar concentraciones más altas de la célula. Para aumentar la eficiencia de la célula de carga, modificar nuestro enfoque anterior y monta el tubo en la mitad de la longitud para un elevado trípode y había cargado la suspensión de células en la mitad que fue unida al dispositivo de PDMS (figura 4A). Usando este acercamiento, hemos encapsulado las células Jurkat T a diferentes concentraciones de 1.0x106 células/mL, 2.0x106 células/mL y 4.0x106 células/mL y también raro PDC a diferentes concentraciones de 1.0x106 células/mL, 2.0x106 células/mL y 12.0x106 células/mL. Esperábamos mayor encapsulación tarifas por prevención de la sedimentación de células con este método. Sin embargo, en todas las concentraciones probadas, los resultados experimentales eran mucho menores que la predicha Poisson valores (figura 4B yC, figura 4).
Con nuestro enfoque de carga de punta hemos optimizado nuestras tarifas de encapsulación de la célula para obtener resultados experimentales coherentes con los valores predichos estadísticamente (figura 5A). Para diferentes concentraciones de células Jurkat T, la eficiencia de encapsulación obtenida había emparejado los valores calculados de todas las concentraciones (figura 5B). Notablemente, incluso con las células adherentes como A549 células del tumor, que tienden a grupo, se observó una eficiencia de encapsulación ligeramente mejorado a una concentración celular de 1.0x106 células/mL (figura 5C). También se evaluó la eficacia de nuestro sistema para encapsular menos disponible y escasa PDC a concentraciones diferentes de la célula de 1.0x106 células/mL, 3.0x106 células/mL y 13.0x106 células/mL(figura 5). Para facilitar la carga de posiblemente mayores volúmenes superiores a 200 μL, por ejemplo, al trabajar con líneas celulares o células inmunes primarias más abundantes, también investigamos la eficacia de la encapsulación de células mediante el uso de puntas de 1000 μl (azul). Hemos demostrado que estos 1.000 consejos μl dieron una similar eficiencia de encapsulación en comparación con los consejos de μl 200 (amarillo) (figura 5E).
Dependiente respecto a la viruta diseño y la investigación a la mano, nuestra punta de carga técnica puede utilizarse para cargar las células a través de una entrada, para sondear en heterogeneidad celular, o múltiples entradas en paralelo, para descifrar las interacciones celulares. Comparamos la carga de células Jurkat T (a una concentración de 10.0x106 células/mL) de una entrada a dos poblaciones con diferente de células Jurkat T (en una concentración combinada de 10.0 x106 células/mL) de las dos entradas (figura 6 de A y la figura 6B). Durante la encapsulación, las gotitas se generaron utilizando agarosa ultra bajo de temperatura gelificación y cuajó después de la producción de perlas de hidrogel de agarosa forma que permitió el análisis descendente posterior vía microscopia y flujo cytometry (figura 6 C y figura 6D). El análisis microscópico reveló que célula emparejamiento fue alcanzada en diferentes combinaciones que indica de emparejamiento (figura 6C) de la célula de alto rendimiento. Además, el análisis de la misma población de perlas de hidrogel por citometría de flujo reveló que granos sin las células podrían ser separados de los granos con las células basadas en el delantero distinto (FSC, tamaño) y hacia un lado (SSC, granularidad) patrón de dispersión (figura 6 D). Bloquean en la población de granos sin células confirmó la falta de encapsulación de la célula por la ausencia de señales fluorescentes. Además, bloquean en la población de grano con células reveló la existencia de múltiples indicativo de subpoblaciones para la encapsulación de células Jurkat T diferentemente etiquetadas. Nuestros resultados demuestran que célula eficiente vinculación puede lograrse, basado en tanto microscópica y el análisis cytometric del flujo y mostró una eficiencia de encapsulación ligeramente mayor en comparación con la predicción de Poisson (figura 6E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig1.jpg"> Figura 1 . PDMS basado gota microfluídicos dispositivo con tres entradas y una salida. El dispositivo consta de tres entradas para la fase de aceite continua, medios de cultivo celular y suspensión de la célula, respectivamente. Las gotitas generadas se recogen en la salida. Las muestras de flujo laminarly hasta el cruce de flujo enfoque donde están encapsuladas en gotitas. En las entradas, filtro estructuras tener partículas grandes como proteínas o agregados de células de nuevo. El diámetro de los huecos en la estructura del filtro se indican con líneas azules. El diámetro de los canales en la boquilla de producción se indican mediante líneas rojas. La altura del canal en la viruta entera era 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig2.jpg"> Figura 2 . Estabilidad de la gota durante 24 horas. Los gráficos muestran la zona de gotitas que contienen medios de cultivo libre de suero hematopoyético + 2% de suero humano, con el tiempo para tres diferentes concentraciones de surfactante A) 0.5% B) 3% C) 5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig3.jpg"> Figura 3 . Tubería de base celular carga enfoque. Las células de Jurkat T se cargan en diferentes concentraciones con el aparato mediante una jeringa conectada a la tubería. A) la ilustración muestra la configuración experimental B) la tasa de encapsulación celular determinado por microscopía de luz. Puntos: determinar experimentalmente los valores; Cerrado líneas: distribución de Poisson. Barra de error representa el error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig4.jpg"> Figura 4 . Encapsulación de varios tipos de células a diferentes concentraciones utilizando un tubo vertical de carga enfoque. Las células Jurkat T y el PDC (de diferentes concentraciones) fueron encapsulado para determinar la eficiencia de encapsulación de la célula. A) la ilustración muestra la configuración experimental para el tubo vertical de carga del enfoque. B) el gráfico muestra la eficiencia de encapsulación de Jurkat T las células. C) el gráfico muestra la eficiencia de encapsulación del PDC. Puntos: determinar experimentalmente los valores; Cerrado líneas: distribución de Poisson. Barra de error representa el error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig5.jpg"> Figura 5 . Punta de carga del enfoque para encapsular los tipos de células diferentes. A) ilustración esquemática de la punta de carga técnica. B) el gráfico muestra la eficiencia de encapsulación de células Jurkat. C) el gráfico muestra la eficiencia de encapsulación de células A549. D) el gráfico muestra la eficiencia de encapsulación del PDC. E) el gráfico muestra la eficiencia de encapsulación de Jurkat T células usar puntas de pipeta con 200 μl (amarillas) y puntas de pipeta de 1.000 μl (azul). Puntos: determinar experimentalmente los valores; Cerrado líneas: distribución de Poisson. Barra de error representa el error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig6.jpg"> Figura 6 . Célula de emparejamiento en gotitas. A) ilustración esquemática de la punta de carga del enfoque para acoplar distintas células de 2 entradas en gotitas. B) el gráfico muestra el encapsulado de Jurkat T las células mediante una entrada o dos entradas en paralelo. La concentración de células para un Consejo es 2.0x106 células/mL y la concentración celular para dos consejos ambos 1.0x106 células/mL. Puntos: determinar experimentalmente los valores; Cerrado líneas: distribución de Poisson. C) recubrimientos microscópicas el de perlas de hidrogel y etiquetadas células Jurkat T. D) El gráfico muestra el análisis de cytometric del flujo de células apareadas en hidrogel perlas de agarosa. La trama muestra dispersión hacia delante y dispersión lateral. E) comparación del número de células en agarosa hidrogel perlas como detectados por citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. Bares: significa valor; Bigotes: error estándar de la media, n ≥ 4. Barra de error representa el error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este artículo presenta un protocolo para la escasa población de células mediante puntas de pipeta los dispositivos microfluídicos gotita para proporcionar una mayor eficiencia de encapsulación de células en gotas de siembra.

Método basado en una punta de pipeta para siembra células gota microfluídicos plataformas

Amongst various microfluidic platform designs frequently used for cellular analysis, droplet-microfluidics provides a robust tool for isolating and ...

La integración de esta metodología con microfluídicos basados en gotas ayuda a responder preguntas clave relacionadas con el campo de la inmunología de sistemas para codificar la heterogeneidad celular y la comunicación entre células individuales o patógenos. La principal ventaja de esta técnica que desarrollamos es que este procedimiento de carga de puntas permite la encapsulación de células raras en gotas que coinciden estrechamente con el porcentaje de distribución previsto. La demostración visual de este método es fundamental para comprender cómo utilizar las puntas de pipeta para cargar celdas en gotas de género y para recuperar celdas de las gotas.Para la carga de puntas para la generación de gotas acuosas, primero agregue tres mililitros de tensioactivo a dos mililitros de aceite harineado y extraiga la mezcla de fase de aceite en una jeringa de 2,5 mililitros. Retire las burbujas de aire de la jeringa y conecte la jeringa a un trozo de tubo de teflón de una longitud adecuada. Cargue dos jeringas de muestra con un aceite mineral compatible con nosotros y conecte la jeringa a una segunda pieza de tubo de teflón de una longitud adecuada.A continuación, perforar un enchufe de cinco milímetros de diámetro de Polidimetilsiloxano o PDMS desde una losa EDMS curada y perforar un agujero de un milímetro a través del centro del enchufe. Inserte el enchufe firmemente en el extremo superior de una punta de pipeta de 200 microlitrotros e inserte el tubo unido a la jeringa de aceite mineral compatible en el enchufe. Presione lentamente el émbolo de la jeringa para llenar la punta de la pipeta con aceite mineral expulsando todo el aire residual.Coloque cuidadosamente las jeringas de muestra y la jeringa de aceite harineado en una bomba de jeringa. Cuando se haya eliminado todo el aire, baje cada punta de pipeta en la solución de muestra y aspire alrededor de 100 microlitros de muestra de célula en las puntas. A continuación, inserte las dos puntas de pipeta que contienen muestras en las dos entradas internas del chip PDMS e inserte el tubo que contiene la mezcla de fase de aceite en la entrada externa.Ajuste los caudales en la bomba de la jeringa como se indica y entre y ajuste las dimensiones de cada jeringa. Encienda la bomba para vaciar la solución de muestra a través de los canales internos del dispositivo y la fase de aceite a través del canal exterior del dispositivo. A continuación, enchufe un trozo de tubo de una longitud adecuada en la salida para comenzar a recoger las gotas cuando la formación de gotas es estable, recogiendo las gotas en un tubo de bloqueo.Una vez recogidas todas las gotas, añadir 200 microlitros de RPMI medio, sin suero, encima de las gotas e incubar la muestra con el orificio en la tapa del tubo de bloqueo durante el período de tiempo experimental adecuado. Para romper la emulsión, primero agregue dos mililitros de PFO a ocho mililitros de aceite flouinado y utilice una jeringa para eliminar el exceso de aceite de la parte inferior del tubo de recolección de gotas. A continuación, agregue 100 microlitros de 20%solución de PFO a la emulsión para liberar las células encapsuladas en la fase acuosa, y toque el tubo brevemente para mezclar.No olvide que el PFO puede ser perjudicial para las células. Y por lo tanto, mantenga el contacto con PFO al mínimo. Después de uno a dos minutos, gire la solución a la menor fuerza centrífuga relativa posible durante 30 segundos e transfiera inmediatamente 550 microlitros de la fracción acuosa a un nuevo tubo bloqueado que contenga 500 microlitros de PBS frío, complementado con 2%Fetal Calf Serum, o FCS.Deje que cualquier disipador de aceite residual al fondo del nuevo tubo de bloqueo y transfiera cuidadosamente 950 microlitros de la célula que contiene la fase acuosa a un nuevo tubo de bloqueo. Asegúrese de que el aceite no se transfiere junto con la fase acuosa en el nuevo tubo de bloqueo. Luego recoger las células por centrifugación y volver a suspender el pellet en 300 microlitros de PBS frío fresco complementado con 2%FCS.Usando el enfoque de carga de puntas como se acaba de demostrar, se pueden obtener las tasas de encapsulación de células T de Jurkat coincidentes con los valores predichos estadísticamente. Sorprendentemente, incluso con células adherentes como las células tumorales, que tienden a aglutillarse, o células raras como células dendríticas plasocitosicas, se observa una mayor eficiencia de encapsulación. Durante esta encapsulación representativa, las gotas se regeneraron utilizando agarosa de temperatura gelificante ultrabaja y gelificadas después de la producción para formar perlas de hidrogel de agarosa que permitieron el posterior análisis aguas abajo a través de microscopía y citometría de flujo.El análisis microscópico reveló que el emparejamiento celular se logró en diferentes combinaciones indicativas de emparejamiento celular de alto rendimiento y análisis de la misma población de cuentas de hidrogel por citometría de flujo, reveló que las cuentas sin células podían separarse de las perlas con células basadas en sus distintos patrones de dispersión hacia adelante y hacia un lado. De hecho, el gating en la población de cuentas sin células confirmó una falta de encapsulación celular por la ausencia de señales fluorescentes mientras que gating en la población de cuentas con células reveló la existencia de múltiples sub-poblaciones indicativas de la encapsulación de células T de Jurkat etiquetadas de manera diferente. Mientras se trabaja con este método, es importante recordar que la concentración celular es un factor limitante y debe optimizarse para asegurar la encapsulación eficiente de celdas y el emparejamiento de celdas.Siguiendo este procedimiento, no sólo se pueden encapsular una o dos células en gotas con alta eficiencia, sino que se pueden encapsular varias celdas, o tipos de celdas, para una replicación más precisa del entorno micro celular. Esta técnica allanará el camino para que los investigadores en los campos de la inmunología y las disciplinas relacionadas para la utilización óptima de las poblaciones de células de cicatrices y su encapsulación eficiente en gotas, estudien el comportamiento celular en un entorno libre de ruido.

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