Name: La combinación de análisis de la DNA en una extracción de crudo del virión con el análisis de ARN de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a aislar y secuenciar virus de plantas mediante extracción de ADN y ARN de hojas infectadas. Este método permite identificar nuevos genomas virales de ADN de doble cadena y mejorar la comprensión de la diversidad viral ambiental.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Investigación fue financiada por el centro de Oklahoma para el avance de la ciencia y la tecnología aplicada investigación programa fase II AR 132-053-2; y por el Departamento de Oklahoma de agricultura cultivos de especialidad de investigación programa de subvenciones. Agradecemos a Dr. HongJin Hwang y la instalación de base de Bioinformática de OSU que fue apoyado por becas del NSF (EOS-0132534) y NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 y 5P20RR15564-03).

<ol><li>Dijkstra, J., Jager, C. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDijkstra%2C+J+%22Practical+Plant+Virology+%3A+Protocols+and+Exercises%22">Practical Plant Virology : Protocols and Exercises</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 1 edn (1998).</li>
<li>Roossinck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+virus+metagenomics%3A+biodiversity+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology.</a> Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).</li>
<li>Melcher, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+novel+viruses+by+analysis+of+nucleic+acids+in+virus-like+particle+fractions+from+Ambrosia+psilostachya%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya.</a> J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).</li>
<li>Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+metagenomic+data+for+viruses+using+the+e-probe+diagnostic+nucleic+Acid+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay.</a> Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).</li>
<li>Borah, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacilliform+DNA-containing+plant+viruses+in+the+tropics%3A+commonalities+within+a+genetically+diverse+group%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group.</a> Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).</li>
<li>Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomy%2C+molecular+phylogeny+and+evolution+of+plant+reverse+transcribing+viruses+%28family+Caulimoviridae%29+inferred+from+full-length+genome+and+reverse+transcriptase+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences.</a> Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).</li>
<li>Geering, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Banana+contains+a+diverse+array+of+endogenous+badnaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses.</a> J Gen Virol. 86, Pt 2 511-520 (2005).</li>
<li>Kunii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+putative+DNA+virus+from+endogenous+rice+tungro+bacilliform+virus-like+sequences+in+the+rice+genome%3A+implications+for+integration+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution.</a> BMC Genomics. 5, 80(2004).</li>
<li>Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PHYTO-12-11-0351">An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm.</a> Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).</li>
<li>Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+viral+and+non-viral+reverse+transcribing+elements+in+pineapple+%28Ananas+comosus%29%2C+including+members+of+two+new+badnavirus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species.</a> Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).</li>
<li>Gayral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+Banana+streak+virus+integration+event+in+the+banana+genome+as+the+origin+of+infectious+endogenous+pararetrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus.</a> J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).</li>
<li>Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+endogenous+badnaviruses+in+the+New+Zealand+flora%5BTitle%5D)+AND+%22AoB+Plants%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora.</a> AoB Plants. 2011, 008(2011).</li>
<li>Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+episomal+Banana+streak+viruses+by+multiplex+immunocapture+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR.</a> J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).</li>
<li>Singh, K., Talla, A., Qiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+profiling+of+virus-infected+grapevines%3A+evidences+for+virus+infection-associated+and+variety-specific+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Integr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs.</a> Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).</li>
<li>Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+determining+whole+viral+genomic+sequences+including+termini+using+a+single+deep+sequencing+run%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run.</a> J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).</li>
<li>Kreuze, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+viral+genome+sequence+and+discovery+of+novel+viruses+by+deep+sequencing+of+small+RNAs%3A+a+generic+method+for+diagnosis%2C+discovery+and+sequencing+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses.</a> Virology. 388 (1), 1-7 (2009).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirusDetect%3A+An+automated+pipeline+for+efficient+virus+discovery+using+deep+sequencing+of+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs.</a> Virology. 500, 130-138 (2017).</li>
<li>James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1744-7348.2011.00466.x">Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa.</a> Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).</li>
<li>Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+shorter+than+genome+length+episomal+Banana+streak+OL+virus+like+sequences+isolated+from+banana+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India.</a> Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).</li>
<li>Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+badnaviruses+infecting+Dioscorea+spp.+in+the+Pacific+reveals+two+putative+novel+species+and+the+first+report+of+dioscorea+bacilliform+RT+virus+2%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2.</a> Virus Res. 238, 29-34 (2017).</li>
<li>BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequence-independent+strategy+for+amplification+and+characterisation+of+episomal+badnavirus+sequences+reveals+three+previously+uncharacterised+yam+badnaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. <a target="_blank" href="https://www.plantmanagementnetwork.org/pub/php/brief/2004/canna/">Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida.</a> Plant Health Progress. , August 2-4 (2004).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Canna+yellow+mottle+virus+in+a+new+host%2C+Alpinia+purpurata%2C+in+Hawaii%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii.</a> Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).</li>
<li>Wijayasekara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+two+badnavirus+genomes+associated+with+Canna+yellow+mottle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease.</a> Virus Res. 243, 19-24 (2018).</li>
<li>Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caulimovirus+isolation+and+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Caulimovirus isolation and DNA extraction.</a> Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+2nd+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn</a>. , Cold Spring Harbor Press. (1989).</li>
<li>Radford, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next-generation+sequencing+technologies+in+virology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of next-generation sequencing technologies in virology.</a> J Gen Virol. 93, Pt 9 1853-1868 (2012).</li>
<li>Kanagal-Shamanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion+PCR%3A+Techniques+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Emulsion PCR: Techniques and Applications.</a> Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).</li>
<li>Getts, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+blockade+in+lethal+West+Nile+virus+encephalitis+indicates+a+crucial+role+for+very+late+antigen+%28VLA%29-4-dependent+recruitment+of+nitric+oxide-producing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages.</a> J Neuroinflammation. 9, 246(2012).</li>
<li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).</li>
<li>Gel filtration principles and methods. <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/ge-gel-filtration.pdf">GE Healthcare</a>. , (2010).</li>
<li>Goff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iPlant+Collaborative%3A+Cyberinfrastructure+for+Plant+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology.</a> Frontiers in Plant Science. 2, (2011).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+bioinformatic+approaches+to+detect+and+analyze+influenza+virus+in+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dev+Ctries%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets.</a> J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+SIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, Web Server issue 597-603 (2012).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUSCLE%3A+a+multiple+sequence+alignment+method+with+reduced+time+and+space+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity.</a> BMC Bioinformatics. 5, 113(2004).</li>
<li>Hung, J. H., Weng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+Alignment+and+Homology+Search+with+BLAST+and+ClustalW%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).</li>
<li>Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA+biocentric+software+for+sequence+and+phylogenetic+analysis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Bioinform+Res+Appl%22%5BJournal%5D)">MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review.</a> Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191(2013).</li>
<li>Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+cellulose+DNA+isolation+improves+DNA+yield+and+quality+among+diverse+plant+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa.</a> Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).</li>
<li>Moeller, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+cellulose+DNA+isolation+improves+DNA+yield+and+quality+among+diverse+plant+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa.</a> Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).</li>
<li>Grooms, K. <a target="_blank" href="https://www.semanticscholar.org/paper/Review%3A-Improved-DNA-Yield-and-Quality-from-Diverse-Grooms/b0a1299cacd7451cbbb9270caf72762379cd8e5d">Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa</a>. , (2015).</li>
<li>Nishimori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+antivirus+activity+of+an+anti-programmed+death-ligand+1+%28PD-L1%29+rat-bovine+chimeric+antibody+against+bovine+leukemia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection.</a> PLoS One. 12 (4), 0174916(2017).</li>
<li>Rojas, M. R., Gilbertson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783540757627">Plant Virus Evolution</a>. Roossinck, M. J. 1, Springer-Verlag. 27-51 (2008).</li>
<li>Roossinck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+big+unknown%3A+plant+virus+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">The big unknown: plant virus biodiversity.</a> Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).</li>
<li>Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Virus+Metagenomics%3A+Advances+in+Virus+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery.</a> Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).</li>
<li>Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. <a target="_blank" href="NULL">Plant Health Progress</a>. , Online (2004).</li>
<li>Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+diversity+among+badnavirus+isolates+infecting+yam+%28Dioscorea+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.).</a> Archives of Virology. 153 (12), Ghana, Togo, Benin and Nigeria. 2263-2272 (2008).</li>
<li>Harper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+Banana+streak+virus+isolates+in+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda.</a> Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).</li>
<li>Muller, E., Sackey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+variability+analysis+of+five+new+complete+cacao+swollen+shoot+virus+genomic+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences.</a> Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En los últimos años se han empleado una variedad de métodos para el estudio de biodiversidad de virus vegetal en ambientes naturales que incluyen enriquecimiento de partículas similares a virus (VLP) o virus específicos ARN o ADN2,3,44, 45,46 . Estos métodos son seguidos por NGS y bioinformáticas de análisis. El objetivo de este estudio fue encontrar al agente causal de una enfermedad común en una planta cultivada. La enfermedad fue divulgada para ser el resultado de un virus desconocido que tiene partículas no-envueltos baciliforme, y que sólo un fragmento de bp 565 ha sido clonado47. Esta información fue suficiente para que los investigadores previos hipotéticamente asignar el virus del género Badnavirus dentro de la familia Caulimoviridae. Mientras que informes anteriores la hipótesis de que la enfermedad del moteado canna en lirios de canna fue el resultado de un badnavirus solo, utilizando el enfoque de metagenómica planteado en este estudio, se determinó que la enfermedad era causada por badnavirus provisional dos especies24. Por lo tanto, la fuerza de la utilización de un metagenoma enfoque para descubrir el agente causal de una enfermedad es que ahora podemos identificar situaciones donde puede haber más de una causa.
Nuestro enfoque combina datos de secuenciación de DNA y RNA es completa y también demuestra que los resultados utilizando dos enfoques dieron resultados coherentes y confirmaron la presencia de dos virus relacionados. Empleó un procedimiento modificado para el aislamiento de Caulimovirus y produce una muestra que se enriquece para ácidos nucleicos de virus asociados y que estaban protegidos dentro de la cápside del virus. Un laboratorio de servicio fue contratado para llevar a cabo la secuenciación de ADN. El concepto esencial para la secuenciación de novo es que la ADN polimerasa incorpora el fluorescente con la etiqueta nucleotides en un filamento de la plantilla de ADN durante los ciclos secuenciales de la síntesis de ADN. Los contigs montado seguido por NGS se presentaron en un flujo de trabajo Bioinformático produciendo unos contigs que fueron identificados como virus contigs. Más confirmación de virus dos genomas10,24,48,49,50 se obtuvo a través de análisis Bioinformático de datos RNA-seq de preparaciones de RNA ribo-agotado. Un resultado interesante fue conocer que las poblaciones de secuencias recuperaron por secuenciación de ADN y ARN proporciona distribuciones similares de ácidos nucleicos virales y no virales. Para secuenciación de DNA y RNA, < 0,5% de secuencias fueron de origen del virus. Dentro de la población de virus secuencias 78-82% perteneció a la familia Caulimoviridae. Comparando los contigs de virus ensamblados de secuenciación de DNA y RNA, se confirmó que los dos genomas montados se produjeron en ambos conjuntos de datos.
Una preocupación de usar sola secuencia de la DNA para identificar los nuevos genomas de virus es que el genoma de badnavirus es un ADN circular abierto. Conjeturamos que secuencias de superposición de discontinuidades en el genoma pueden presentar obstáculos para el ensamblaje del genoma de contigs. Examen inicial de los resultados de la secuencia de la DNA reveló dos genomas de virus similares. Presumimos que estos genomas representaban o diversidad genética de una especie que no ha sido estudiada o mentionadas aquí dos especies co infectar la misma planta24. Por lo tanto, el análisis Bioinformático colectiva de conjuntos de datos obtenidos por NGS ADN y la secuencia de RNA, permitió la confirmación de la presencia de los dos genomas de longitud completa.
Hay otro informe que desarrolló un método alternativo para la extracción de ácidos nucleicos y VLP de homogenados de planta para los estudios de metagenómica, basados en procedimientos para recuperar el ADN del virus del mosaico del coliflor (CaMV; un caulimovirus)3. Este enfoque identifica novela RNA y secuencias de ADN de virus en plantas no cultivadas. Las medidas derivadas del procedimiento de aislamiento caulimovirus utilizado en este estudio para descubrir al agente causal de una enfermedad de las plantas cultivadas son los pasos para extraer VLP de plantas naturalmente infectadas24. El éxito de ambos métodos modificados sugiere que el procedimiento marco para caulimovirus aislamiento puede ser un valioso punto de partida para estudios de metagenómica de virus de plantas en general.

Enfermedades emergentes conducen los investigadores a desarrollar nuevas herramientas para identificar el agente causal correcta. Informes iniciales de enfermedades virales nuevos o recurrentes se basan en los síntomas que comúnmente ocurren como mosaico y de malformaciones de la hoja, vena claro, enanismo, marchitez, lesiones, necrosis, u otros síntomas. El estándar por informar de un nuevo virus como el agente causal de una enfermedad es diferenciarlo de otros patógenos contaminantes, propagar en el huésped adecuado y reproducir la enfermedad por inoculación en plantas sanas de la especie original. La limitación de este enfoque es que muchos géneros de virus de plantas dependen de un insecto u otros vectores para la transmisión a un huésped adecuado o a la especie original. En este caso, la búsqueda para el vector apropiado puede ser prolongada, puede haber dificultades para establecer colonias de laboratorio del vector, y más esfuerzos son necesarios para elaborar un protocolo para la transmisión experimental. Si las condiciones de los estudios de transmisión de laboratorio exitoso no se logra, entonces la obra incumple la norma por informar de una nueva enfermedad de virus. Los virus que se producen en sus hospederos naturales a muy bajas concentraciones, los investigadores deben identificar hosts alternativos de propagación para mantener suficientes existencias infecciosas para llevar a cabo la investigación. Para especies de virus que infectan sólo algunas plantas también esto puede ser un obstáculo para el crecimiento de cultivos stock1.
En los últimos años, los científicos son más a menudo que emplean NGS de alto rendimiento y metagenómica enfoques para descubrir secuencias de virus que están presentes en el ambiente, que puede existir sin relación a una enfermedad conocida, pero puede ser asignado a géneros y especies taxonómicas 2 , 3 , 4. estos enfoques el descubrimiento y clasificación de material genético en un ambiente distinto proporciona una manera de describir la diversidad de virus en la naturaleza o su presencia en un determinado ecosistema pero no necesariamente confirma un marco para la definición de agentes causales de una enfermedad evidente.
El género Badnavirus pertenece a la familia Caulimoviridae de pararetrovirus. Estos virus son baciliforme en forma con genoma de ADN circular de doble cadena de aproximadamente 7 a 9 kb. Los pararetrovirus replican a través de un intermediario de RNA. Pararetrovirus existen como episomas y replican independientes de la planta cromosómico DNA5,6. Estudios de campo de poblaciones de virus indican que las poblaciones de estos virus son genéticamente complejas. Además, la información obtenida a través de una gama de genomas de plantas mediante secuenciación de alto rendimiento han descubierto numerosos ejemplos de fragmentos de genoma de badnavirus insertados por eventos de integración ilegítimo en genomas de plantas. Estas secuencias endógenas badnavirus no están necesariamente asociadas con infección7,8,9,10,11. Posteriormente, el uso de NGS para identificar nuevos badnaviruses como el agente causal de la enfermedad es complicado por la diversidad de la subpoblación de genoma episomal, así como la aparición de secuencias endógenas12,13.
Mientras que hay no una tubería óptima para el descubrimiento de los genomas de pararetrovirus novela, hay dos métodos comunes para identificar estos virus como agentes causales de enfermedad. Un método es enriquecer para pequeñas secuencias de ARN de hojas infectadas y luego montar estas secuencias para reconstituir el virus genome(s)14,15,16,17. Otro enfoque es la amplificación de círculo rodante (RCA) para amplificar genomas de virus de ADN circular18. El éxito de RCA depende de la edad de la hoja y el título del virus en el tejido seleccionado. Los productos RCA son sometidos a digestión de restricción y clonados en plásmidos para directo secuencia19,20,21.
Virus del moteado amarillo de Canna (CaYMV) es un badnavirus y se describe como la causa etiológica de la enfermedad del moteado amarillo en canna, aunque sólo un fragmento de 565 PB del genoma ha sido previamente aislado de cannas infectados22. Un estudio contemporáneo identificado CaYMV de Alpinia purpurata (jengibre de floración; CaYMV-Ap)23. El objetivo de este estudio fue recuperar las secuencias del genoma completo badnavirus de lirios de canna infectados. Describimos un protocolo para la purificación de virus de los contaminantes de la planta y luego aislar DNA viral de esta preparación y preparar una biblioteca de DNA para el uso de NGS. Este enfoque elimina la necesidad de pasos intermedios de amplificación molecular. También aislamos mRNA de plantas infectadas para NGS RNA-seq., que incluye RNA-seq se realizó con cada preparación de ácidos nucleicos. Contigs montados se encontró que se refieren a la taxonomía de Badnavirus en ambos conjuntos de datos con el Centro Nacional de biotecnología y la información (NCBI) herramienta de búsqueda de alineación local básico para los ácidos nucleicos (BLASTn). Se identificaron los genomas de dos badnavirus especies24.

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976</td><td>Tampón de molienda para la purificación</td></tr><tr><td>de virus Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0751</td><td>Tampón de molienda para la purificación de virus</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td><td>Tampón de molienda para la purificación</td>de</tr><tr><td>virus</td><td>urea Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>Extracción homogeneizada&nbsp;</td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>X-100</td><td>Extracción homogeneizada&nbsp;</td></tr><tr><td>Estopilla</td><td>VWR Radnor, PA</td><td>21910-107</td><td>Filtro homogeneizado&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Resuspensión de pellets& Tampones de resuspensión de ADN&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>Tampón de resuspensión de pellets</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Spectrum</td><td>E1045</td><td>Detiene las reacciones enzimáticas</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>Tampón de resuspensión de ADN</td></tr><tr><td>fenol:cloroformo:isoamilalcohol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Disolver proteínas de virión</td></tr><tr><td>ADNasa I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Degradar el ADN celular a partir de extractos</td></tr><tr>de<td>etanol al 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>Precipitación de ADN de virus</td></tr><tr><td>Mezclador de laboratorio</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>Molienda de muestras de hojas</td></tr><tr><td>Modelo de suelo ultracentrífuga&nbsp; & Rotor Ti70</td><td>Beckman Coulter, Irving TX&nbsp;</td><td>A94471</td><td>Separación de extractos celulares</td></tr><tr><td>Centrífuga modelo suelo y rotor JA-14</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>Separación de extractos celulares Placa de</td></tr><tr><td>agitación magnética</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>Mezcla de urea en muestras durante la noche</td></tr><tr><td>Policía de goma</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>Disolver pellets de virus</td></tr><tr><td>&nbsp; Bioanalizador 2100 Instrumento</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td><td>G2939BA</td><td>Detección sensible de la calidad y cantidad de ADN y ARN</td></tr><tr><td>Bioanalizador 2100 RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>Chip de microfluídica utilizado para mover, teñir y medir la calidad del ARN en un bioanalizador 2100</td></tr><tr><td>Bioanalizador 2100 Chip de ADN-Alta sensibilidad</td><td>5067-4626 Chip de</td><td>microfluídica utilizado para mover, teñir y medir la calidad del ADN en un bioanalizador 2100</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanodrop</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Análisis de la calidad del ADN/ARN en los pasos intermedios de los procedimientos Kit de aislamiento de</td></tr><tr><td>ARN total de la planta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>ARN aislado para RNA-seq</td></tr><tr><td>Agua libre de ARNasa&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10128-514</td><td>Resuspensión de ADN y ARN para</td></tr><tr><td>la columna de centrifugación del concentrador de ARN</td> NGS <td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td> Kit de eliminación <td>de ARNr de preparación de ARN para RNA-seq</td></tr><tr><td></td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>Preparación de ARN para RNA-seq</td></tr><tr><td>Imán DynaMag-2</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Preparación de ARN para RNA-seq</td></tr><tr><td>&nbsp; ARN&nbsp; sistema de enriquecimiento</td><td>Roche</td><td>7277300001</td><td>Prepare RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>16500100</td><td>Análisis en gel de la calidad del ADN/ARN en las etapas intermedias de los procedimientos</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15585011</td><td>tinción en gel de agarosa</td></tr><tr><td>células competentes pGEM-T +JM109</td><td>Promega, Madison, WI</td><td>A3610</td><td>Fragmentos del genoma del clon</td></tr><tr><td>pFU Taq polimerasa</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>PCR amplificar el genoma del virus</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>PCR amplificar el genoma del virus</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos de PCR</td><td>IDT, Coralvill, IA</td><td>Pedido personalizado</td><td>PCR amplificar el genoma del virus</td></tr><tr><td>Miniprep Kit de purificación de ADN</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Purificación de ADN plasmídico antes de la secuenciación</td></tr><tr><td>Kit de limpieza de PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Preparar productos de PCR para la clonación</td></tr><tr><td>Software pDRAW32</td><td>ACAClone</td><td></td><td>Análisis informático de ADN circular y motivos</td></tr><tr><td>MEGA6.0 software</td><td>MEGA</td><td></td><td>Análisis de genética evolutiva molecular</td></tr><tr><td>Primer 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&trade; RiboGreen&comercio; Kit de ensayo de ARN</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>Determinación fluorométrica de la cantidad de ARN</td></tr><tr><td>GS Junior&trade; Sistema de pirosecuenciación</td><td>Roche</td><td>5526337001</td><td>Plataforma de secuenciación</td></tr><tr><td>GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996520001</td><td>Reactivos para emulsión PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Reactivos de recuperación de perlas</td><td>Roche</td><td>5996490001</td><td>Reactivos para PCR</td></tr> <tr><td>en emulsiónReactivos GS Junior EmPCR (Lib-A)</td><td>Roche</td><td></td><td>5996538001 Reactivos para emulsión PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Oil & Kit de rotura</td><td>Roche</td><td>5996511001</td><td>Reactivos para emulsión PCR</td></tr><tr><td>GS Jr Titanio Kit de secuestro*</td><td>Roche</td><td>5996554001</td><td>Incluye reactivos de secuenciación, enzimas, tampones y perlas de empaquetadura</td></tr><tr><td>GS Jr. Kit de placas de picotiter de titanio Roche</td><td></td><td>5996619001</td><td>Placa de secuenciación con reactivos y juntas asociados</td></tr><tr><td>Mezclador</td><td></td> IKA Turrax <td>3646000</td><td>Mezclador especial utilizado con Turrax Tubos</td></tr><tr><td>IKA Turrax Tube (mezclador especializado)</td><td></td><td>20003213</td><td>Tubos de mezcla especializados con rotor interno para la creación de emulsiones</td></tr><tr><td>Kit de nebulizadores GS</td><td>Roche</td><td>5160570001</td><td>Fraccionador de tamaño de ácido nucleico para uso durante la preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>GS Junior emPCR Contador</td> de <td>perlas Roche</td><td>05 996 635 001</td><td>Contador de perlas de biblioteca</td></tr><tr><td>GS Junior Dispositivo de deposición de perlas</td><td>Roche</td><td>05 996 473 001</td><td>Soporte para placa Picotiter durante la centrifugación</td></tr><tr><td>Contrapeso & Adaptador para los dispositivos de deposición de cordones</td><td>Roche</td><td>05 889 103 001</td><td>Se utiliza para equilibrar el dispositivo de deposición con la centrifugación de placas de picotiter</td></tr><tr><td>GS Junior Software</td><td>Roche</td><td>05 996 643 001</td><td>Paquete de software para el control del instrumento, la recopilación y el análisis de datos</td></tr><tr><td>GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluido en el artículo 05 996 643 001 anterior)</td></tr><tr><td>GS Run Processor v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluido en el ítem 05 996 643 001 arriba)</td></tr><tr><td>GS De Novo Assembler v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluido en el ítem 05 996 643 001 arriba)</td></tr><tr><td>GS Reference Mapper v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluido en el ítem 05 996 643 001 arriba)</td></tr><tr><td>GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluido en el ítem 05 996 643 001 arriba)</td></tr></tbody></table>

la combinación de análisis de la dna en una extracción de crudo del virión con el análisis de arn de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de virus

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Este enfoque del metagenoma se utiliza para identificar virus con genoma de ADN circular y sus transcripciones. A menudo virus de ADN de plantas que se producen en títulos bajos en su host o no pueden ser inoculadas mecánicamente a otro host son difíciles de propagar para lograr una mayor concentración de material infeccioso. Hojas infectadas son en un tampón suave con pH óptimo y composición iónica recomendado para purificar más retrovirus de párr de baciliforme. La urea se utiliza para romper los cuerpos de inclusión que atrapan a los viriones y disolver los componentes celulares. Centrifugación diferencial proporciona más separación de viriones de contaminantes de la planta. Luego tratamiento de proteinasa K elimina la cápsida. Entonces el ADN viral es concentrado y usado para la secuenciación de próxima generación (NGS). Los datos NGS se utilizan para armar contigs que son sometidos a NCBI-BLASTn para identificar un subconjunto de secuencias del virus en el conjunto de datos generado. En una tubería paralela, ARN es aislada de hojas infectadas utilizando un método de extracción basado en la columna estándar RNA. Luego agotamiento del ribosoma se lleva a cabo para enriquecer para un subconjunto de transcritos de ARNm y virus. Montado secuencias derivadas del ARN (RNA-seq) de la secuencia fueron sometidas a NCBI-BLASTn para identificar un subconjunto de secuencias del virus en este conjunto de datos. En nuestro estudio, se identificaron dos genomas relacionados badnavirus integral en los dos conjuntos de datos. Este método es preferido a otro enfoque común que los extractos de la población total de pequeñas secuencias de ARN para la reconstitución de secuencias genómicas de virus de plantas. Este último metagenómica tubería recupera virus relacionados con las secuencias que se insertan elementos retro-transcripción en el genoma de la planta. Esto junto a los análisis bioquímicos o moleculares más discernir los agentes infecciosos activamente. El método documentado en este estudio, recupera secuencias representativas de replicar virus que probablemente indican infección activa del virus.

Este método de purificación de virus modificado proporciona un enriquecimiento de virus ADN útil para identificar dos especies de virus por NGS y bioinformática. Después el homogeneizado se centrifugó a 40.000 x g durante 2.5 h, hubo una pelotilla verde en la parte inferior del tubo y una pelotilla blanca a lo largo de la longitud. Se resuspendió el precipitado verde en un tubo de microcentrífuga y se resuspendió el sedimento blanco en dos tubos de microcentrífuga. PCR se llevó a cabo usando las cartillas diagnóstico estándar de PCR CaYMV, y los productos fueron detectados en la pelotilla blanca solubilizada y no la pelotilla verde (figura 1A). Una muestra de la preparación del crudo fue examinada por microscopia electrónica de transmisión y observamos las partículas baciliforme mide 124-133 nm de longitud (figura 1B). Esto es dentro de la predicha modal de badnaviruses más. ADN fue extraído de las pelotillas blancas y verdes y suspendido por separado. En la figura 1C, hemos cargado 5 μl de ADN extraído de la verde y muestra pelotilla blanca (1,6 μg de ADN de la fracción verde) y 3,1 μg de ADN para la fracción blanca de agarosa al 0.8% electrophoresis del gel y analizaron el ADN después de bromuro de etidio de tinción. La fracción verde contenía ADN de bajo peso molecular mientras que la fracción blanca produjo dos bandas de peso molecular más alto del ADN, así como el menor peso molecular de ADN (figura 1C). El gel presentado en la figura 1C se ejecutó durante 40 min a 100 V y el frotis en el carril 3 sugiere que la tensión de gel debe reducirse para producir bandas más claras. Estos datos sugieren que la pelotilla blanca se enriqueció de viriones. La concentración de ADN (0.6 μg/mL) extraída de la muestra blanco era bajo, pero suficiente para NGS, que requiere un mínimo de 10 ng de ADN para proceder. ADN fragmentado se utiliza para preparar una biblioteca para NGS.
En paralelo, RNA fue extraída de las plantas infectadas canna (figura 1D) para alto rendimiento RNA-seq. Un flujo de trabajo estándar se llevó a cabo para la preparación de la biblioteca, NGS, creación de contigs y la identificación de secuencias del genoma viral (figura 1E). Se compararon los resultados de salida del uso de ADN y ARN como materiales de partida.
Se obtuvieron 188.626 lecturas de ADN crudos por NGS usando la DNA aislada de preparación cruda del virus. Lee se reunieron en 13.269 contigs y BLASTn fue utilizado para buscar el conjunto de datos NCBI de secuencias de nucleótidos (usando Viridplantae TaxID: 33090 y Virus TaxID: 10239 como los organismos limitantes) (figura 1E). Los resultados de BLASTn NCBI revelaron que 93% de los contigs de novo montado eran secuencias celulares, 22% eran desconocido, y 0.3% fueron contigs de virus (figura 2A). La mayoría de los contigs categorizado como secuencias celulares fueron identificadas como mitocondrial o ADN del cloroplasto. Dentro del conjunto de datos de virus contigs, 32% de los contigs de virus se relaciona con miembros de Caulimoviridae (que no eran secuencias Badnavirus) y 58% de ellos estaban relacionados con Badnavirus. De los contigs de virus, 29% fueron muy similares (e < 1 x 10-30) para CaYMV aislante V17 ORF3 gene (EF189148.1), virus de baciliforme de la caña de azúcar aislar Batavia D, genoma completo (FJ439817.1), y virus del rayado del banano CA completo (genoma KJ013511). Dentro de esta población, había contigs largos que parecían dos genomas de longitud completa.
Alto rendimiento RNA-seq producido 153.488 limpio secuencia individual Lee con un promedio leer longitud de < 500 BP Contig montaje reducido esto a 8.243 contigs. Estos fueron sometidos a NCBI BLASTn (usando Viridplantae TaxID: 33090 y Virus TaxID: 10239 como los organismos limitantes) y las salidas a 76% de los contigs en una categoría de secuencias celulares de la planta, 23% eran desconocidas, y 0.1% fueron categorizados como (contigs) virus Figura 2 B). un examen más cercano de la población de la población de 0.1% de contigs virus determinó que 68% de estos fueron asignado a Caulimoviridae (figura 2B). Se identificaron tres grandes contigs dentro de esta población con alta similitud (e < 1 X 10-30) para CaYMV aislante V17 ORF3 gen (EF189148.1), el virus baciliforme de caña de azúcar aislar D Batavia, genoma completo (FJ439817.1) y Banana streak Virus de CA genoma completo (KJ013511). Examinar los tres contigs, manualmente se unió a dos de estos para producir un genoma de virus completos.
Se comparó el virus genoma contigs de longitud producida por secuenciación de ADN y ARN como andamio mutuo para confirmar la presencia de los dos genomas de virus completos. Un genoma de virus completos de 6.966 bp fue nombrado provisionalmente virus del moteado amarillo asociado de Canna 1 (CaYMAV-1) (figura 3A). El segundo genoma fue 7.385 bp y una variante de CaYMV infección de Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (figura 3A).
Finalmente, iniciadores PCR que fueron diseñados para fragmento de bp clon ~ 1.000 de cada virus, se utilizaron para detectar diferencialmente dos genomas en una población de 227 plantas de canna que representa nueve variedades comerciales. En muchos casos las plantas individuales fueron infectadas con ambos virus. Le ofrecemos un ejemplo de detección RT-PCR de CaYMAV-1 y CaYMV-Ap01 en 12 plantas. Tres de estos fueron positivos solo para CaYMV-Ap01 y nueve fueron positivo para ambos virus (figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Figura 1 : Flujo de trabajo NGS y preparaciones de ácido nucleico del virus. (A) agarosa (1.0%) gel electroforesis de los fragmentos PCR bp 565 de genomas de CaYMV. Dos productos PCR fueron detectados en muestras preparadas de la pelotilla blanca (carriles 1, 2) pero no en la muestra de pellet verde (carril 3). Control positivo (+) representa un producto PCR amplificado de planta infectada ADN que fue aislado usando un método automatizado para que las partículas de celulosa paramagnético estándar. L carril contiene la escalera de ADN utilizada como un estándar para medir el tamaño de las bandas de DNA lineales en carriles de muestra. (B) ejemplo de partículas del virus por microscopía electrónica de transmisión en la pelotilla blanca recuperada por fraccionamiento crudo de hojas infectadas de canna. (C) agarosa (0,8%) gel de electroforesis de la DNA se recuperó de la verde (carril 1) y blanco (carril 2) bolitas de ese positivo probado por PCR en panel A. Los puntos rojos y amarillos junto a lane 2 identifican dos bandas de ADN de alto peso molecular que ocurren en la fracción blanca. (D) agarosa (1%) gel de electroforesis de ARN total recuperado por basado en la columna de purificación de RNA. L carril contiene la escalera de ADN utilizada como un estándar para medir el tamaño de bandas lineales en carriles de la muestra. Carriles 1-6 contiene el ARN aislado de hojas de canna infectados que se combinaron para una sola muestra de agotamiento de ribo y tubería esquemática del RNA-SEQ (E) de aislamiento de ácidos nucleicos, preparación de biblioteca, secuencia, montaje contig y genoma del virus descubrimiento. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Figura 2 : Gráficas corona visualizar las categorías taxonómicas de contigs. (A) la tabla de la izquierda muestra la abundancia y distribución taxonómica de contigs montados desde la preparación cruda del virus. La tabla de la derecha representa las proporciones de contigs de virus asociados a la familia Caulimoviridae , género Badnavirus y tres especies estrechamente relacionadas. (B) el panel de la izquierda muestra la abundancia de contigs derivado de RNA-seq basado en su distribución taxonómica. A la derecha es el gráfico que representa la abundancia de contigs dentro de la población de contigs de virus asociados a la familia Caulimoviridae , género Badnavirus y tres especies estrechamente relacionadas. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Figura 3 . Caracterización de genomas de CaYMAV 1 y CaYMV-Ap01. (A) representación esquemática del moteado amarillo de Canna asociado virus 1 (CaYMAV) y del virus del moteado amarillo de Canna similares al genoma de Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Las posiciones del nucleótido 1-10 se identifica como el comienzo del genoma y contiene un tRNAmet anticodon sitio típico de la mayoría de badnavirus de genomas. Las posiciones de parada y arranque para la traducción de marco de lectura abierto (ORF) 1 y 2 son adyacentes. Estas proteínas tienen desconocido funciones. ORF3 es una poliproteína que contiene dedos de zinc (ZnF), proteasa (Pro), transcriptasa inversa (RT) y dominios Rnasa H. Se conserva una secuencia señal 3' poly(A) para ambos genomas del virus. (B) análisis de RT-PCR se llevó a cabo utilizando ARN aislado de virus infectadas hojas y primers que detectan CaYMAV y CaYMV-Ap01. En la misma población de 12 plantas, tres fueron infectados con CaYMV-Ap01 solamente, mientras que los restantes fueron infectados con CaYMAV y CaYMV-Ap01. (+) indica control positivo y control negativo (-). Esta cifra es reproducido/modificado de Wijayasekara et al. 24 con permiso. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí presentamos un nuevo enfoque para identificar virus con genomas de ADN de doble cadena. Usamos métodos estándar para extraer el ADN y el ARN de hojas infectadas y llevar a cabo la secuenciación de próxima generación. Herramientas bioinformáticas montan secuencias en contigs, identifican contigs representación de genomas del virus y asignan genomas a grupos taxonómicos.

La combinación de análisis de la DNA en una extracción de crudo del virión con el análisis de ARN de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de Virus

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre virología ambiental, como la aparición de enfermedades nuevas. La principal ventaja de este método consiste en purificar variantes separándolas de los componentes celulares y utilizar esas variantes para extraer ADN destinado a secuenciación. Llegué a esta idea por primera vez cuando descubrimos que las plantas en nuestros invernaderos estaban infectadas con uno o más Badnavirus desconocidos. Las personas nuevas en este método enfrentarán dificultades por tres razones. Primero, la homogenización es un paso crítico para garantizar rendimientos de calidad. Segundo, la centrifugación diferencial puede producir múltiples precipitados y es necesario saber cómo identificarlos y separarlos. Tercero, el bioanalizador también puede resultar difícil de interpretar.Se debe usar una bata de laboratorio y guantes en todos los pasos de este procedimiento. Comience cortando de 80 a 100 gramos de hojas de plantas enfermas previamente congeladas a menos 20 grados Celsius. Luego muela las hojas en una licuadora Waring usando 200 mililitros de tampón de molienda y sulfito de sodio al 0,5%. Transfiera el homogenato a un vaso de precipitados de un litro. Aunque aún esté usando el equipo de protección personal adecuado, agregue 18 gramos de urea y 25 mililitros de detergente no iónico al 10 % al homogenato y cubra el vaso con papel de aluminio. Agite con un agitador magnético durante la noche. Al día siguiente, transfiera el homogenato a botellas para rotor de centrífuga de 250 mililitros y centrifugue en un rotor de ángulo fijo a 4000 veces g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Recupere el sobrenadante y filtre a través de cuatro capas de gasa. Mida el volumen del homogenato líquido recuperado y luego divida el homogenato entre tubos de centrífuga de polipropileno de 38,5 mililitros. Centrifugue el homogenato a 40.000 veces g a cuatro grados Celsius durante 2,5 horas. Cuando finalice la centrifugación, verifique la presencia de un sedimento verde en el fondo del tubo y un sedimento blanco a lo largo del tubo. Deseche el sobrenadante, conservando ambos sedimentos, y coloque las muestras en hielo. Separar el pellet blanco del verde es uno de los pasos más difíciles del procedimiento. Requiere paciencia y habilidad.Trabajando en una campana química, utilice un esp&aacute;tula de goma para separar los pelets. Raspe y transfiera los pelets a botellas de rotor diferentes. Coloque las botellas de rotor que contienen los pelets blancos sobre hielo. A&ntilde;ada un mililitro de agua a cada botella y pipetee hacia arriba y hacia abajo. Cada cinco minutos, durante un periodo de una a dos horas, pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo para re-suspender el pelet. Despu&eacute;s de que los pelets blancos hayan sido re-suspendidos, mantenga las suspensiones durante la noche a cuatro grados cent&iacute;grados.Al día siguiente, centrifugue la suspensión a 6000 veces g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos para eliminar los restos celulares. Transfiera las suspensiones concentradas a tubos nuevos y centrifugue a 136.000 veces g a cuatro grados Celsius durante dos horas para obtener el sedimento de viriones. Retire el sobrenadante y re-suspenda el sedimento en un mililitro de tampón.Comience este procedimiento desnaturalizando los viriones. Añada cuarenta microlitros de una solución de proteinasa K de dos microgramos por microlitro a las suspensiones del sedimento e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Añada un volumen de fenol-cloroformo-isoamil alcohol a cada muestra y agite manualmente durante 20 segundos.Centrifugar a temperatura ambiente a 16.000 ×g durante cinco minutos. Retire la fase acuosa superior y transfiérala a un nuevo tubo. Repita esta extracción dos o más veces.Concentre el ADN utilizando precipitación con etanol. Use 0,3 M de acetato de sodio pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol al 95%. Coloque las muestras a menos 20 grados Celsius durante 30 a 60 minutos. Luego, centrifugue a 13.000 ×g durante 10 a 20 minutos para obtener el precipitado de ADN. Trabajando en una mesa de laboratorio, re-suspenda el pellet de ADN en un mililitro de tampón TE 0,1 milimolar. Filtre la suspensión mediante una columna comercial de filtración en gel por centrifugación. Analice las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% utilizando tinción con bromuro de etidio para observar las preparaciones de calidad y evaluar la calidad del ADN según se describe en el texto.Cuando se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión, se observaron partículas virales en el pellet blanco recuperado mediante fraccionamiento crudo de hojas de caña infectadas. La electroforesis en gel de agarosa del ADN recuperado de los pellets verde y blanco identificó dos bandas de ADN de alto peso molecular en la fracción blanca, indicadas por los puntos rojo y amarillo.La integridad del ARN aislado de hojas infectadas también se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Este gráfico muestra la abundancia y distribución taxonómica de los contigs ensamblados a partir de la preparación cruda del virus. Y este gráfico representa las proporciones de contigs virales asociados con la familia Caulimoviridae, el género Badnavirus y los contigs asociados con tres especies estrechamente relacionadas.Estos dos gráficos siguientes muestran la abundancia de contigs derivados del secuenciamiento de ARN según su distribución taxonómica. El gráfico de la derecha representa la abundancia de contigs dentro de la población de contigs virales asociados a la familia Caulimoviridae, género Badnavirus y tres especies estrechamente relacionadas. La comparación de los contigs de longitud del genoma viral producidos por secuenciamiento de ADN y ARN como andamiaje mutuo confirma la presencia de dos genomas virales completos.Finalmente, el análisis de RT-PCR utilizando ARN aislado de hojas infectadas con el virus detectó ambos genomas virales.Una vez dominada, esta técnica puede llevar dos días, mientras que un principiante podría tardar tres días. Al realizar este procedimiento por primera vez, es importante llevar un registro del volumen del homogenato en cada uno de los sobrenadantes para poder comparar, al final del procedimiento, el rendimiento final de ADN con el material inicial de partida.Tras su descubrimiento, este método ha allanado el camino en el campo de la virología vegetal para que los investigadores identifiquen nuevos virus de ADN en el medio ambiente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo homogeneizar material vegetal, concentrar variantes y obtener un buen rendimiento de ADN que pueda utilizarse para secuenciación de próxima generación. No olvide que trabajar con urea y fenol-cloroformo es extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar gafas, guantes, bata de laboratorio y mascarilla, cuando manipule estos productos químicos. Para una ultracentrifugación segura, es importante equilibrar correctamente los tubos; por ello, debe pesarlos y colocarlos uno frente al otro en el rotor, y su peso debe diferir en no más de 0,01 entre ellos.

combining-analysis-dna-crude-virion-extraction-with-analysis-rna-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales.

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 1

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 2

Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales. Parte 3 describe el proceso de etiquetado fluorescente del ARN amplificado de host y de muestras de virus mediante el acoplamiento de aminoácidos de alilo de los colorantes.

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 3

Se describe el proceso de aislamiento de ADN de alta pureza herpesvirus nucleocápside de las células infectadas. El final de ADN capturado de la solución es de alta concentración y pureza, por lo que es ideal para la secuenciación de alto rendimiento, alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfecciones para producir nuevas recombinaciones virales.

Preparación de ADN viral de nucleocápside

Una manera sencilla, eficiente y robusta para sincronizar la entrega de múltiples componentes virales a las células vegetales...

Simple y robusto En vivo Y In vitro Enfoque para el estudio de ensamblaje del virus

Genómica de virus individuales (SVG) es un método para aislar y amplificar los genomas de los viriones individuales. Suspensiones virales de un conjunto mixto se ordenan mediante citometría de flujo en un portaobjetos de microscopio con pozos discretas que contienen agarosa, capturando así el virión y la reducción del genoma cizallamiento durante el procesado posterior. Amplificación del genoma completo se logra mediante la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) resultante en el...

Aislamiento y Análisis del Genoma de viriones individuales utilizando &quot;Genómica solo virus &#39;

Aquí, se presenta un protocolo para crear un cromosoma artificial bacteriano infeccioso que contiene un ADNc de longitud completa del ARN genómico de cadena positiva del virus de la encefalitis japonesa. Este protocolo se puede utilizar para construir un ADNc funcional de otros virus de ARN de cadena positiva, lo que lo convierte en una poderosa herramienta genómica para estudiar la biología del virus.

Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

Proporcionamos una estrategia novedosa para aislar compartimentos de replicación viral (RC) de células humanas infectadas con adenovirus (Ad). Este enfoque representa un sistema libre de células que puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares que regulan la replicación y expresión del genoma viral, así como la regulación de las interacciones viral-huésped establecidas en el RC.

Aislamiento de fracciones Sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales Humanos

El objetivo de este protocolo es específicamente la etiqueta y aislar selectivamente la DNA viral de células infectadas para la caracterización de proteínas del genoma viral asociado.

Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas

Aquí presentamos un enfoque de secuenciación profunda que proporciona una determinación imparcial de naciente 3'-termini, así como perfiles mutacionales de moléculas de ADN monocatenario. La principal aplicación es la caracterización de los nacientes DNAs complementarios retrovirales (cADN), los intermedios generados durante el proceso de transcripción inversa retroviral.

Determinante 3'-Termini y secuencias de las moléculas de ADN Viral naciente en HIV-1 Reverse transcripción en células infectadas

Este protocolo describe cómo establecer infección viral en vivo de Drosophila melanogaster utilizando el método de inyección de nano y técnicas básicas para analizar interacción virus-huésped.

Establecimiento de la infección Viral y análisis de la interacción huésped-Virus en Drosophila Melanogaster

Aprende a aislar y secuenciar virus de plantas mediante extracción de ADN y ARN de hojas infectadas. Este método permite identificar nuevos genomas virales de ADN de doble cadena y mejorar la comprensión de la diversidad viral ambiental.

La combinación de análisis de la DNA en una extracción de crudo del virión con el análisis de ARN de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de Virus (Video) | JoVE Journal

La combinación de análisis de la DNA en una extracción de crudo del virión con el análisis de ARN de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de Virus

Explorar más videos