La combinación de análisis de la DNA en una extracción de crudo del virión con el análisis de ARN de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de Virus

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre virología ambiental, como la aparición de enfermedades nuevas. La principal ventaja de este método consiste en purificar variantes separándolas de los componentes celulares y utilizar esas variantes para extraer ADN destinado a secuenciación. Llegué a esta idea por primera vez cuando descubrimos que las plantas en nuestros invernaderos estaban infectadas con uno o más Badnavirus desconocidos. Las personas nuevas en este método enfrentarán dificultades por tres razones. Primero, la homogenización es un paso crítico para garantizar rendimientos de calidad. Segundo, la centrifugación diferencial puede producir múltiples precipitados y es necesario saber cómo identificarlos y separarlos. Tercero, el bioanalizador también puede resultar difícil de interpretar.

Se debe usar una bata de laboratorio y guantes en todos los pasos de este procedimiento. Comience cortando de 80 a 100 gramos de hojas de plantas enfermas previamente congeladas a menos 20 grados Celsius. Luego muela las hojas en una licuadora Waring usando 200 mililitros de tampón de molienda y sulfito de sodio al 0,5%. Transfiera el homogenato a un vaso de precipitados de un litro.

Aunque aún esté usando el equipo de protección personal adecuado, agregue 18 gramos de urea y 25 mililitros de detergente no iónico al 10 % al homogenato y cubra el vaso con papel de aluminio. Agite con un agitador magnético durante la noche. Al día siguiente, transfiera el homogenato a botellas para rotor de centrífuga de 250 mililitros y centrifugue en un rotor de ángulo fijo a 4000 veces g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Recupere el sobrenadante y filtre a través de cuatro capas de gasa. Mida el volumen del homogenato líquido recuperado y luego divida el homogenato entre tubos de centrífuga de polipropileno de 38,5 mililitros. Centrifugue el homogenato a 40.000 veces g a cuatro grados Celsius durante 2,5 horas. Cuando finalice la centrifugación, verifique la presencia de un sedimento verde en el fondo del tubo y un sedimento blanco a lo largo del tubo. Deseche el sobrenadante, conservando ambos sedimentos, y coloque las muestras en hielo.

Separar el pellet blanco del verde es uno de los pasos más difíciles del procedimiento. Requiere paciencia y habilidad.

Trabajando en una campana química, utilice un espátula de goma para separar los pelets. Raspe y transfiera los pelets a botellas de rotor diferentes. Coloque las botellas de rotor que contienen los pelets blancos sobre hielo. Añada un mililitro de agua a cada botella y pipetee hacia arriba y hacia abajo. Cada cinco minutos, durante un periodo de una a dos horas, pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo para re-suspender el pelet. Después de que los pelets blancos hayan sido re-suspendidos, mantenga las suspensiones durante la noche a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, centrifugue la suspensión a 6000 veces g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos para eliminar los restos celulares. Transfiera las suspensiones concentradas a tubos nuevos y centrifugue a 136.000 veces g a cuatro grados Celsius durante dos horas para obtener el sedimento de viriones. Retire el sobrenadante y re-suspenda el sedimento en un mililitro de tampón.

Comience este procedimiento desnaturalizando los viriones. Añada cuarenta microlitros de una solución de proteinasa K de dos microgramos por microlitro a las suspensiones del sedimento e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Añada un volumen de fenol-cloroformo-isoamil alcohol a cada muestra y agite manualmente durante 20 segundos.

Centrifugar a temperatura ambiente a 16.000 ×g durante cinco minutos. Retire la fase acuosa superior y transfiérala a un nuevo tubo. Repita esta extracción dos o más veces.

Concentre el ADN utilizando precipitación con etanol. Use 0,3 M de acetato de sodio pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol al 95%. Coloque las muestras a menos 20 grados Celsius durante 30 a 60 minutos. Luego, centrifugue a 13.000 ×g durante 10 a 20 minutos para obtener el precipitado de ADN.

Trabajando en una mesa de laboratorio, re-suspenda el pellet de ADN en un mililitro de tampón TE 0,1 milimolar. Filtre la suspensión mediante una columna comercial de filtración en gel por centrifugación. Analice las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% utilizando tinción con bromuro de etidio para observar las preparaciones de calidad y evaluar la calidad del ADN según se describe en el texto.

Cuando se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión, se observaron partículas virales en el pellet blanco recuperado mediante fraccionamiento crudo de hojas de caña infectadas. La electroforesis en gel de agarosa del ADN recuperado de los pellets verde y blanco identificó dos bandas de ADN de alto peso molecular en la fracción blanca, indicadas por los puntos rojo y amarillo.

La integridad del ARN aislado de hojas infectadas también se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Este gráfico muestra la abundancia y distribución taxonómica de los contigs ensamblados a partir de la preparación cruda del virus. Y este gráfico representa las proporciones de contigs virales asociados con la familia Caulimoviridae, el género Badnavirus y los contigs asociados con tres especies estrechamente relacionadas.

Estos dos gráficos siguientes muestran la abundancia de contigs derivados del secuenciamiento de ARN según su distribución taxonómica. El gráfico de la derecha representa la abundancia de contigs dentro de la población de contigs virales asociados a la familia Caulimoviridae, género Badnavirus y tres especies estrechamente relacionadas. La comparación de los contigs de longitud del genoma viral producidos por secuenciamiento de ADN y ARN como andamiaje mutuo confirma la presencia de dos genomas virales completos.

Finalmente, el análisis de RT-PCR utilizando ARN aislado de hojas infectadas con el virus detectó ambos genomas virales.

Una vez dominada, esta técnica puede llevar dos días, mientras que un principiante podría tardar tres días. Al realizar este procedimiento por primera vez, es importante llevar un registro del volumen del homogenato en cada uno de los sobrenadantes para poder comparar, al final del procedimiento, el rendimiento final de ADN con el material inicial de partida.

Tras su descubrimiento, este método ha allanado el camino en el campo de la virología vegetal para que los investigadores identifiquen nuevos virus de ADN en el medio ambiente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo homogeneizar material vegetal, concentrar variantes y obtener un buen rendimiento de ADN que pueda utilizarse para secuenciación de próxima generación. No olvide que trabajar con urea y fenol-cloroformo es extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar gafas, guantes, bata de laboratorio y mascarilla, cuando manipule estos productos químicos. Para una ultracentrifugación segura, es importante equilibrar correctamente los tubos; por ello, debe pesarlos y colocarlos uno frente al otro en el rotor, y su peso debe diferir en no más de 0,01 entre ellos.