Un método invasivo para la activación de la convolución del cerebro dentada de ratón por el estímulo de alta frecuencia

El objetivo general de este experimento es observar el efecto de la estimulación de alta frecuencia sobre la actividad neuronal en la neurogénesis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los mecanismos celulares y moleculares alineados de la estimulación cerebral profunda de alta frecuencia, como la inducción de la actividad neuronal y la neurogénesis en el hipocampo. La ventaja de esta técnica es que demuestra el poderoso efecto de la TBS de alta frecuencia sobre la actividad neuronal y la neurogénesis en el cerebro adulto.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los efectos del TBS de alta frecuencia en el giro dentado del ratón, también se puede aplicar a otros sistemas, como los ganglios basales y las regiones subtalámicas para los trastornos cerebrales en la clínica. Para comenzar este procedimiento, coloque un ratón anestesiado en el marco estereotáctico. Alinee las bandas de la oreja con su cabeza y apriételas suavemente para sostener la cabeza centrada.

Agarre la piel anterior a sus orejas y retire aproximadamente un centímetro cuadrado de ella sobre el cráneo. Luego, retire el músculo y otros accesorios que recubren el cráneo con un hisopo de algodón para exponer la superficie del cráneo. A continuación, aplique una solución de peróxido de hidrógeno para secar el cráneo con el fin de identificar las líneas de sutura sagital y lambda.

A continuación, identifica el bregma y la lambda. El punto bregma se utilizará como punto original para establecer la posición del núcleo. Después de eso, nivela el cráneo en el plano horizontal usando estos dos puntos.

Asegúrate de que las alturas de estos dos puntos sean casi las mismas en el plano ventral dorsal. Además, asegúrese de que el cráneo esté nivelado en el plano lateral medial. A continuación, monte un electrodo de microcable de cobre de dos canales casero en el soporte de electrodo giratorio en el marco quirúrgico estereotáctico.

Coloque el electrodo directamente sobre el bregma y colóquelo en el sitio original. Luego, mueva el electrodo suavemente a la posición correcta sobre el cráneo, sin tocarlo. Utilice la pantalla digital del marco quirúrgico estereotáctico para indicar las posiciones anteroposterior, lateral medial y dorsoventral.

Cuando se identifique el sitio deseado para la inserción del electrodo, marque la posición con un marcador negro. A continuación, utilice los ajustes estereotácticos dorsoventrales para elevar el portaelectrodos. Luego, esterilice la broca con etanol al 70%.

Utilice un taladro asistido por un micromanipulador manual, haga un orificio de rebaba con precisión en la posición marcada. Use un hisopo de algodón estéril para detener el sangrado durante la operación. Siga perforando hasta que la duramadre quede expuesta.

Use una aguja doblada para eliminar cualquier resto de hueso que se genere durante la perforación y haga un agujero en la duramadre sin dañar el tejido blando cerebral subyacente. Para confirmar que el orificio de rebaba está hecho correctamente en la posición deseada, baje el electrodo para asegurarse de que se inserte a través del orificio de rebaba suavemente sin tocar ningún obstáculo. Si no se detecta resistencia, inserte lentamente el electrodo a la profundidad objetivo desde la superficie del cráneo.

Luego, aplique cemento dental con una espátula pequeña para mantener el electrodo en su lugar. A medida que el cemento se espesa, moldea alrededor del electrodo insertado y otros tornillos óseos para formar una tapa agradable y lisa. A continuación, desconecte el electrodo del portaelectrodos.

Retire el ratón del marco estereotáctico y devuélvalo a una jaula caliente. Deje que el ratón se mueva libremente y permita que se recupere durante dos días en la jaula. Para administrar la estimulación, conecte el electrodo implantado a un estimulador programable a través de cables.

Configure la interfaz del software. A continuación, establezca los parámetros HFS como seis series de seis trenes de seis pulsos a 400 hercios y la intensidad de estimulación de 200 miliamperios. Entregue HFS durante el período de tiempo deseado según lo configurado.

Para el grupo de control, implante electrodos en los ratones sin administrar ningún estímulo. Para la tinción con CFAS, estimule los ratones experimentales dos veces durante un día. Para el marcaje de BrdU, aplique estimulaciones adecuadas tanto al grupo de estimulación aguda como al grupo de estimulación crónica.

Durante el transcurso de la estimulación, asegúrese de que el ratón esté despierto. Recuerde asegurarse de que los cables no estén torcidos. Cuando finalice la estimulación, desconecte con cuidado la clavija del portaelectrodos en el conector del sistema de grabación.

Para el CFAS y la tinción de una muesca, aproximadamente tres horas después de la última HFDBS, se anestesia a los ratones inyectando pentobarbital para lograr un plano quirúrgico de anestesia. Para el marcaje de BrdU, aproximadamente 12 horas después de la última estimulación de HFDBS, administre seis inyecciones de BrdU al control y a los ratones estimulados a intervalos de dos horas. 36 horas después de la última inyección, anestesiar profundamente a los ratones con pentobarbital y profusarlo transcárdicamente con 50 mililitros de PBS frío seguido de 50 mililitros de paraformaldehído frío al 4%.

Retira su cabeza y haz una incisión en la piel para exponer la habilidad. Con unas pinzas, corte ligeramente el cráneo y extraiga con cuidado todo el cerebro. Luego, después de la fijación, el cerebro contiene un 4% de paraformaldehído durante dos días adicionales y transfiéralo a una solución de sacarosa al 30% a cuatro grados centígrados durante la noche.

Con un criostato, corte el cerebro en secciones coronales de 20 micras. Transfiera y monte las secciones en el portaobjetos de vidrio con un cepillo y guárdelas a menos 20 grados centígrados. Después, transfiera los portaobjetos a un PBS normal que no contenga ningún fijador.

Lave las secciones con PBS tres o cuatro veces durante cinco minutos cada una para eliminar el exceso de fijador. Para el grupo marcado con BrdU, incubar las secciones en HCL de dos molares durante 30 minutos a 37 grados Celsius y enjuagarlas con un tampón de borato de 0,1 molares. Después de 10 minutos, lave las secciones dos veces en PBS durante cinco minutos cada vez.

Posteriormente, incubar las secciones en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, incubar las secciones con anticuerpo policlonal anti-CFAS, anticuerpo anti-notch one o anticuerpo anti-BrdU en una solución de bloqueo a cuatro grados centígrados durante la noche. Se colocaron las secciones tres veces en PBS durante 10 minutos cada vez, luego se incubaron con Alexa Fluor 568 antirarábigo conjugado, Alexa Fluor 488 conjugado anti-cabra o Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario conjugado anti-rata durante una hora a temperatura ambiente.

Fueron las secciones tres veces en PBS durante 10 minutos cada vez. Posteriormente, cubra las secciones cerebrales inmunomarcadas con un medio de montaje de reactivo antidecoloración que contenga DAPI. Deje que las secciones se sequen al aire y guárdelas protegidas de la luz a cuatro grados centígrados.

Aquí se muestra un paradigma experimental para el tratamiento con HFS en la generación de neuronas proliferantes marcadas con BrdU en la DG. Los animales se dividieron en un grupo agudo y otro crónico para recibir diferentes patrones de estimulación. Posteriormente, los animales de ambos grupos fueron inyectados con BrdU en el sexto día. Al octavo día, los animales fueron anestesiados y profusos para la preparación de secciones de criostato.

Aquí están las imágenes de la tinción inmunofluorescente BrdU post-HFDBS en el DG. Un análisis cuantitativo de la producción neuronal indicó que la estimulación aguda en el DG no pudo mejorar la neurogénesis. Mientras que la estimulación crónica en la DG reguló significativamente la neurogénesis. En comparación con el grupo control, el número de células marcadoras BrdU aumentó significativamente en el grupo crónico, tanto en el hemisferio ipsilateral como en el contralateral.

Estas son las imágenes de la tinción inmunofluorescente BrdU post-HFDBS en la subregión PP. Un análisis cuantitativo de la producción neuronal indicó que la estimulación aguda o crónica en el PP no pudo mejorar la neurogénesis de manera significativa. El número de células de marcaje BrdU se mantuvo relativamente estable con o sin el tratamiento con HFS.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar ubicar el electrodo correctamente y administrar la estimulación con éxito. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la estimulación de alta frecuencia de la neurociencia se inscribieran en los modelos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo administrar estimulación de alta frecuencia al núcleo cerebral profundo.