Imágenes en vivo de la célula de fluorescencia de ciclo completo de células vegetativas de la lento-crecimiento Social bacteria Myxococcus xanthus

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular bacteriana, como cómo las células replican su ADN, cómo crecen y cómo se dividen. La principal ventaja de esta técnica es que las células bacterianas vivas se pueden monitorear durante al menos 24 horas bajo el microscopio y la técnica no requiere equipo especial. Aunque este método puede proporcionar información sobre el crecimiento y la división de Myxococcus xanthus, también se puede aplicar fácilmente a otras bacterias de crecimiento lento.

Para comenzar, vuelva a suspender una sola colonia de M.xanthus en 500 microlitros de CTT al 1%, suplementado con antibióticos, en un tubo estéril y transfiera toda la suspensión a un matraz Erlenmeyer de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de CTT al 1%. Prepare una solución de microscopía de agarosa al 1% que contenga 0,2% de CTT mezclando un gramo de agarosa con 80 mililitros de tampón TPM y 20 mililitros de medio CTT al 1%. Calienta la solución en el microondas hasta que la agarosa se derrita.

Llene una placa de Petri con aproximadamente 60 mililitros de agarosa fundida y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Precaliente la almohadilla de agarosa a 32 grados centígrados durante al menos 15 minutos antes de usarla. A continuación, coloque un cubreobjetos de vidrio estéril en un marco de plástico o metal que tenga un orificio en el medio, luego use cinta adhesiva para fijar el cubreobjetos al marco.

Agregue de 10 a 20 microlitros de células M. xanthus cultivadas exponencialmente en el cubreobjetos. Para agregar microesferas fluorescentes como marcadores fiduciales de las células, use el tampón TPM para diluir las microesferas a 1:100. Agite bien la suspensión de cuentas y agregue de cinco a 10 microlitros a las celdas.

De la almohadilla grande precalentada al 1% de agarosa, corte una almohadilla pequeña aproximadamente del tamaño del cubreobjetos y colóquela encima de las celdas. A continuación, coloque un cubreobjetos en la parte superior de la almohadilla para evitar la evaporación y mantener las células en un ambiente húmedo. Incube la muestra de microscopía a 32 grados centígrados durante 15 a 20 minutos para permitir que las células se adhieran a la parte inferior de la almohadilla de agarosa antes de las grabaciones de microscopía de lapso de tiempo.

Para realizar microscopía de lapso de tiempo, encienda el microscopio e inicie el software de control del microscopio. Seleccione el objetivo correcto y los espejos y filtros correctos para adquirir imágenes de contraste de fase, así como imágenes de proteínas fluorescentes verdes, fluorescentes rojas o fluorescentes amarillas. Agregue una gota de aceite de inmersión de alta calidad en la lente del objetivo y en el fondo de la muestra preincubada a 32 grados centígrados.

Con el lado del orificio hacia el objetivo, coloque el marco de metal con la muestra en la platina del microscopio y, a continuación, fije la muestra de forma segura en el soporte de la platina. Concéntrese en las celdas moviendo el escenario en la dirección Z más cerca del objetivo. Cuando el aceite del objetivo y la muestra entren en contacto, mueva la platina en la dirección X/Y.

Cambie al software Metamorph y abra la herramienta Adquirir. Seleccione Contraste de fase en la lista desplegable Configuración y establezca el Tiempo de exposición en 100 milisegundos. Haga clic en Mostrar en directo, Llevar celda al plano focal y mueva el escenario en la dirección X/Y hasta que haya varias celdas individuales visibles en el campo de visión.

Asegúrese de que al menos una microesfera fluorescente esté en la región de visión para alinear posteriormente las imágenes adquiridas. A continuación, abra el asistente de adquisición multidimensional del software de control del microscopio para configurar un experimento de lapso de tiempo que permita al microscopio adquirir imágenes en múltiples longitudes de onda y posiciones de etapa si es necesario. En la pestaña Principal, active el lapso de tiempo y Múltiples longitudes de onda.

Aparecerán pestañas adicionales en el lado izquierdo de la ventana. Haga clic en la pestaña Guardar y seleccione Directorio para seleccionar una carpeta vacía en el disco duro de la computadora para guardar las imágenes adquiridas, luego active Incrementar nombre base si existe archivo para asegurarse de que los conjuntos de datos consecutivos no sobrescriban los anteriores. Asigne al experimento un nombre con fecha y el nombre de la cepa o el título del experimento.

Haga clic en la pestaña de lapso de tiempo para ajustar los parámetros de lapso de tiempo, luego establezca el Intervalo de tiempo en 20 minutos y la Duración en 24 horas. El número de puntos de tiempo cambiará automáticamente. Ahora, haz clic en la pestaña Longitudes de onda.

Seleccione el número de longitudes de onda que desea adquirir para cada imagen en cada punto de tiempo cambiando el número. Seleccione Permitir posición de AF memorizada por hardware separada para cada longitud de onda. Haga clic en la pestaña Primera longitud de onda en la parte superior.

En la lista desplegable Iluminación, seleccione Contraste de fase. Seleccione 100 milisegundos para la exposición y, en la lista desplegable Adquirir, seleccione Cada punto de tiempo. Desactive la exposición automática en la lista desplegable seleccionando Nunca y seleccione Cada adquisición en la lista desplegable para Enfoque automático.

Establezca la exposición para cada longitud de onda como se acaba de demostrar utilizando los siguientes parámetros. A continuación, para adquirir imágenes de varias posiciones del escenario, en la pestaña Principal active Varias posiciones del escenario. Haga clic en la pestaña Escenario y haga clic en el botón En vivo para ver el campo de visión.

Mueva el escenario en la dirección X/Y hasta que haya un retorno de la inversión en el campo de visión. Guarde las coordenadas X e Y en la pestaña Etapa haciendo clic en el signo más. Vuelva a mover el escenario en la dirección X/Y hasta que se encuentre un nuevo ROI y guarde las coordenadas de nuevo haciendo clic en el signo más.

Continúe hasta que se guarde el número deseado de regiones. Compruebe una vez más que las celdas están enfocadas haciendo clic en las diferentes posiciones X e Y guardadas e inicie el enfoque automático del hardware haciendo clic en AFC hold para mantener constante la posición Z guardada durante el transcurso del experimento. Inicie la grabación de lapso de tiempo en el asistente de adquisición multidimensional del software de control del microscopio haciendo clic en Adquirir.

Compruebe que las celdas siguen enfocadas después de los primeros puntos de tiempo en las grabaciones de lapso de tiempo para maximizar la calidad de las imágenes y volver a enfocar si es necesario. Para generar películas time-lapse y realizar la alineación de imágenes, inicie el software de análisis y procesamiento de imágenes. Para abrir las imágenes como una pila, haga clic en Revisar datos multidimensionales, seleccione Archivo base, Seleccionar directorio y, a continuación, abra la carpeta con los datos multidimensionales.

Compruebe el conjunto de datos y haga clic en Ver. El conjunto de datos se mostrará como imágenes individuales desde el Punto de Tiempo Uno hasta el final. Active la longitud de onda para crear una pila, luego seleccione todas las imágenes que deben estar en la pila y haga clic en Cargar imágenes.

Repita este paso para todas las longitudes de onda y guarde las pilas completadas. Active la pila de imágenes que deben corregirse para detectar desviaciones. Abra la herramienta de alineación usando Aplicaciones, Alineación automática.

Marque Pila como origen de las imágenes y Primer plano/punto de tiempo como plano de referencia, luego seleccione la pila con el botón Pila de origen y haga clic en Aplicar. Una vez completada la alineación automática, guarde la pila alineada. Para generar una película en formatos MOV o AVI, abra la función Crear película a través de Pila, Hacer película.

Seleccione las grabaciones de lapso de tiempo con el botón Pila de origen, luego seleccione el formato de salida, la velocidad de fotogramas, el número de fotogramas y haga clic en Guardar. En este experimento de lapso de tiempo con células móviles de tipo salvaje DK1622, se adquirieron imágenes de contraste de fase cada cinco minutos durante 24 horas. Como era de esperar, las células eran móviles y se movían predominantemente en grupos.

En las imágenes de células vivas con contraste de fase con células Delta-mgIA inmóviles, se siguió el crecimiento y la división de las células individuales durante la formación de microcolonias. Cuando las imágenes se adquirieron cada cinco minutos durante 24 horas, fue posible cuantificar el tiempo de interdivisión de 235 más o menos 50 minutos con una resolución de una sola célula. Para investigar si las células crecen normalmente mientras rastrean las proteínas marcadas con YFP durante largos períodos, se rastrearon las células de M.xanthus que expresan ParB-YFP.

ParB-YFP inicialmente formó un solo grupo en la región de la célula subpolar. Poco antes o después de la división celular, el grupo se duplicó, con un grupo permaneciendo en el antiguo polo celular y el segundo translocándose al nuevo polo celular. En este experimento, las células no móviles que expresan FtsZ-gfp mostraron una fuerte acumulación de FtsZ-gfp en la célula media, lo que dicta la posición de la división celular.

FtsZ-gfp formó un grupo en la célula media, predominantemente en células más largas. Dos horas después de la división celular, FtsZ-gfp se acumuló en la mitad de la célula en las células hijas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar de forma rutinaria en Myxococcus xanthus, así como en cualquier otra bacteria de crecimiento lento.

Al configurar este procedimiento para una bacteria, es importante ajustar la composición del medio de crecimiento en la placa de agar para cumplir con los requisitos de crecimiento específicos de esa bacteria. Para cualquier bacteria, es importante determinar las condiciones óptimas de imagen, como el tiempo de exposición, la intensidad de la luz y la frecuencia de la imagen, para evitar la fototoxicidad. Además, para cualquier proteína marcada con fluorescencia, las condiciones de imagen deben ajustarse para evitar la fototoxicidad y también el fotoblanqueo.