Name: En Vivo Sondas de microdiálisis método para recolectar grandes proteínas extracelulares de líquido intersticial cerebral con corte de peso molecular alto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende microdiálisis in vivo con sondas de alto peso molecular para recolectar proteínas grandes del líquido intersticial cerebral en ratones despiertos. Este método permite estudiar señalización neuronal y eliminación de desechos en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por '' subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (proteína cerebral envejecimiento y demencia Control)(15H01552) de MEXT y subvenciones para jóvenes científicos (B) (16K 20969). El autor agradece a Dr. David M. Holtzman y Dr. John R. Cirrito para el asesoramiento técnico durante el desarrollo de este método.

Todos los estudios en animales fueron revisados y aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso de la escuela graduada de medicina en la Universidad de Tokio.
1. pre-quirúrgico
<ol><li>Antes de comenzar la cirugía, limpie todo con etanol al 70% para mantener las condiciones estériles. Se recomienda el apoyo térmico utilizando una almohadilla de calefacción.</li>
	<li>Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirmar anestesia realizando una pizca del dedo del pie. Se recomienda el uso de meloxicam SR en la inducción y la buprenorfina recuperación oferta durante al menos 24 h.</li>
	<li>Cepille el cabello con una recortadora quirúrgica. Fijar el ratón el ratón y el adaptador de rata neonatal utilizando barras de oídos y una pinza de nariz. Nota: Es crítico para asegurarse de que cabeza de ratón está asegurada en esta etapa y no mueve de lado a lado.</li>
	<li>Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.</li>
</ol>2. estereotáxicas cirugía para la implantación de cánula guía
<ol><li>Configurar el ratón y la rata neonatal el adaptador sobre el aparato estereotáxicas. Hacer sagittally una incisión en la piel sobre el cráneo con un bisturí.　Limpie la sangre y el tejido conectivo en el cráneo usando un hisopo de algodón húmedo.</li>
	<li>Determinar la coordenada de la región cerebral de interés utilizando atlas del cerebro. Antes de iniciar las mediciones, asegúrese de que esa línea media es recta de modo que el pedacito de taladro puede ser movido A P y en la sutura de la línea media todo el tiempo. Nota: Este artículo utiliza la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L:-2,50 mm, D/V:-1,20 mm, 12 grados) a hipocampo posterior.</li>
	<li>Nivel cráneo A-p<ol>
<li>Coloque un taladro en un manipulador de marco estereotáxicas. Baje la broca hasta que toque suavemente lambda y registrar sus coordenadas ventral. Repita este procedimiento para bregma. Nota: Cuando se nivela el cráneo, la medida vertical de vértice es igual a la de lambda. Si no, ajustar en consecuencia la altura de la abrazadera de la nariz. Después de que el cráneo es nivelado, grabar la coordenada anterior/posterior, lateral de bregma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nivel cráneo de izquierda a derecha<ol>
<li>Mueva el taladro del vértice a la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L: +2,0 mm), bajar el taladro en el cráneo y grabar la coordenada vertical. Repita este procedimiento para la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L:-2,00 mm). Nota: Si el cráneo está nivelado, estas mediciones verticales de dos puntos equidistantes de la línea media son iguales. Si no es así, ajuste la altura de las barras de oído.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perfore un agujero de burr cuidadosamente en las coordenadas de destino (A / P:-3,10 mm, M/L:-2,50 mm) implantar una cánula guía. Si el diámetro de un orificio de trépano no es lo suficientemente grande como para una implantación de cánula guía, perfore otro agujero que coincide con el primero. Perfore otro agujero en el hueso parietal derecho (lado contralateral) e inserte un tornillo de hueso, que ayuda a garantizar el cemento dental en 1.10 (ver figura 1B).</li>
	<li>Cortar una pieza cierre circular de la parte trasera de la tapa de un tubo de centrífuga de 1.5 mL por una cuchilla de afeitar y hacer una '' corona ''. Esta corona se utiliza para impedir la propagación a la piel de cemento dental. Colocar sobre el cráneo para que los agujeros de las rebabas en paso 2.5 mantenerse dentro del círculo (ver figura 1).</li>
	<li>Establecer una Asamblea estereotáctica por colocarle una cánula guía el brazo más corto de un adaptador estereotáxicas y fijarlo con una tuerca ciega. Coloque el brazo más largo del adaptador estereotáctica en la pinza de electrodo. Fije en el manipulador del aparato estereotáctica (ver figura 1A).</li>
	<li>Gire el conjunto de stereotax D-V en el brazo del manipulador por 12 grados (ver figura 1B). Hacia la cánula guía del orificio de trépano en 1.6. Inserte la cánula guía lentamente el cerebro mediante la reducción de 1,2 mm. Nota: El ángulo de la sonda es específico al hipocampo; otras regiones pueden requerir otros ángulos o sin ángulo en todo. Consultar un atlas del cerebro de coordenadas precisas. Secar la superficie del cráneo, porque si no el cemento no se pegue y tapa de cemento puede desplazarse</li>
	<li>Agregue el cemento dental dentro de la corona completamente cubrir tanto la parte metálica de la cánula de la guía y el tornillo del hueso suficiente para asegurarlos. Aplique cemento dental adicional si hay una parte de cráneo expuesta.</li>
	<li>Espere hasta que el cemento dental se seque totalmente (~ 12-20 min). Retire el adaptador estereotáctica de la abrazadera del electrodo. Retire la tuerca de la tapa y reemplace el adaptador estereotáxicas con un maniquí de prueba y sujetar la tuerca con sombrerete.</li>
	<li>Suelte el ratón del aparato estereotáxicas y casa el ratón solo en una jaula individual. Nota: El ratón no se debe dejar desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Compruebe el ratón todos los días hasta el día de microdiálisis. El ratón recibe AINE como carprofen si parece que está en el dolor. Espera 2 semanas es necesaria para estudios de sueño y vigilia así el ratón habituates al nuevo ambiente10, pero otros tipos de estudios pueden requerir períodos de recuperación más cortos (por ejemplo, 1-2 días).</li>
</ol>3. Microdialysis configuración
<ol><li>Control de calidad de las puntas de prueba: Llene una jeringa desechable de 1ml con agua destilada waterand lo conecte a la salida (puerto menor) de una sonda con un tubo byton. Cubra los orificios de ventilación con los dedos y presione el émbolo de la jeringa suavemente para infundir el agua a la sonda. Compruebe que el agua aparece desde la entrada de la sonda y hay no hay fugas en la superficie de una membrana de microdiálisis.<ol>
<li>Activación de las sondas: sumerja las membranas de una sonda en etanol (70-100%) durante dos segundos. Luego, incorporar agua destilada en la sonda otra vez con una jeringa otra vez.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de buffer de perfusión: con el fin de evitar la adherencia de moléculas Diana para los tubos, añadir BSA por diluir la solución de BSA de 30% al 4% con LCR artificial (1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3 , 122 m m NaCl, pH = 7.35), que parezca a concentración del electrólito en el LCR, inmediatamente antes del uso. El búfer de perfusión a través de una unidad de filtro de jeringa con 0.1 μm tamaño de poro del filtro. Nota: 4% BSA mejora la recuperación para pegar proteínas pero puede limitar severamente la entrega de compuestos, especialmente para compuestos que tienen alta Unión a BSA. Esta es una de las ventajas de utilizar la menor concentración de BSA (como 0,15%) en algunos casos3. Tenga en cuenta que BSA puede Agregar muy fácilmente cuando agitado por vortex o remover la placa. Estos agregados pueden obstruir las sondas o los poros de la membrana. Tenga cuidado al preparar una solución de BSA para limitar esta agregación</li>
	<li>Preparar dos líneas separadas de entrada y salida (ver figura 1) y conectar ambas líneas con una aguja de conexión. Llene una jeringa desechable de 3 mL con buffer de perfusión y conectar con el extremo de entrada de la tubería utilizando una aguja Roma-final. Llenar el tubo entero con tampón de perfusión mediante la ejecución de la bomba de jeringa.</li>
	<li>Parar la bomba de jeringa y vuelva a colocar la aguja de la conexión entre entrada y salida de línea con una sonda de microdiálisis activados en el paso 3.3 (ver figura 1). Antes de este reemplazo, coloque la tuerca de tapa en la punta de prueba.</li>
	<li>Monte el tubo del rodillo en el tubo de salida de la bomba de rodillo. Iniciar la bomba de la jeringuilla a 10 μl/min y luego la bomba de rodillos en el caudal un poco más lento (9,8 9,5 μl/min). Asegúrese de quitar todas las burbujas de aire en el tubo entero, que puede influir en la recuperación cuando introduce la sonda.</li>
	<li>Anestesiar el ratón de paso 1.12 de la misma manera como en el paso 1.2. Poner el collar de ratón alrededor de su cuello. Retire la tuerca de la tapa y la sonda dummy y lentamente Inserte una sonda de microdiálisis de 3.4 a través de la cánula guía y sujetar la tuerca con sombrerete.</li>
	<li>Lugar el ratón en la jaula conectada a un sistema de movimiento libre y traba el mouse con el collar. Mantener funcionando la bomba de jeringa y la bomba de rodillo el caudal indicado en el paso 3.5 para al menos 1 h. Nota: Para conseguir la colección de ISF de animales despiertos, este artículo utiliza un sistema de movimiento libre, donde la jaula sí mismo responde al movimiento de un animal para mantener tubos de torsión. Alternativamente, líquidos giratorios disponibles de varias compañías pueden también ser utilizados.</li>
	<li>Parada del rodillo de la bomba primero y luego la bomba de jeringa. Fijar el caudal deseado. Ejecute la jeringa bomba 20% más rápido que la bomba de rodillo. Nota: por ejemplo, si ejecuta a 1 μl/min, funciona la bomba de jeringa en 1.2 μl/min caudal óptimo debe determinarse empíricamente para cada molécula.</li>
	<li>Recoger muestras ISF: Coloque el extremo libre del tubo de salida en el colector de fracciones refrigerados. Nota: Volumen de muestra apropiado varía en función de análisis utilizados para el análisis.</li>
	<li>Después de la terminación del experimento, retire la sonda. (Anestesiar el ratón según sea necesario).  Manejar recuperación de ratón al igual que en el paso 2.11. Análisis de la ISF recogida por métodos tales como HPLC o ELISA.</li>
	<li>Para lavar la tubería entera después de microdiálisis, conecte la entrada y tubos de salida otra vez mediante la sustitución de la sonda con la conexión de la aguja y ejecutan el blanqueador diluido en el tubo entero y luego lavarlo con agua. Seque y almacene para uso repetido. Nota: Otros tipos de tuberías son aceptables, sin embargo, BSA en tampón de perfusión puede obstruir los tubos con pequeño diámetro, por lo tanto estos tubos se consideran como de un solo uso. Los tubos pueden ser usados o tapado después de múltiples usos, así que asegúrese de que el caudal es constante cada vez que lo use.</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
<li>Kushikata, T., Hirota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+microdialysis+in+free-moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide microdialysis in free-moving animals.</a> Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microdialysis+reveals+age-dependent+decrease+of+brain+interstitial+fluid+tau+levels+in+P301S+human+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).</li>
<li>Ulrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+apolipoprotein+E+from+the+brain+interstitial+fluid+using+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+transmission+via+ATP-dependent+K%2B+channels+regulates+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum.</a> Brain. 139 (3), 871-890 (2016).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-competent+high-molecular-weight+tau+species+accumulates+in+the+cerebrospinal+fluid+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model+and+human+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients.</a> Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).</li>
<li>Yamada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Microdialysis+of+brain+interstitial+fluid+for+the+determination+of+extracellular+tau+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels.</a> Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).</li>
<li>Kang, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+dynamics+are+regulated+by+orexin+and+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle.</a> Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+regulates+interstitial+fluid+amyloid-beta+levels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo.</a> Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).</li>
<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

Microdialysis con alto peso molecular cortado las membranas tiene que ser operado por un modo de vaivén, por lo tanto es fundamental que el caudal es constante y precisa. La inexactitud en las tasas de flujo puede ser la causa de la generación de burbujas de aire y la inconsistencia en la concentración de la muestra. Si el flujo es incompatible, verifique todas las conexiones de salida. Si el problema persiste, puede ser necesario volver a empezar con nuevas sondas y tubos.
Sondas Microdilaysi...

ISF consta de 15-20% del volumen total del cerebro y ofrece un microentorno crítico para la transducción de señales, transporte de substrato y separación de residuos1. Por lo tanto, la capacidad de recogida de ISF de animales vivos proporcionará mayor implicaciones para diversos procesos biológicos como mecanismo de enfermedad. Microdiálisis in vivo es uno de los pocos métodos muestra y cuantificar moléculas extracelulares de ISF de despierto, moviendo libremente animales y de tal modo sirve como una herramienta útil en Neurociencias investigación campo2,3. En este método, las sondas de microdiálisis con membranas semipermeables son insertadas en el cerebro y perfundidas con tampón de perfusión en la tasa de flujo relativamente lento (0.1-5 μl/min). Durante esta perfusión, moléculas extracelulares en ISF pasivamente se difunden en la punta de prueba según el gradiente de concentración y recogen como un dializado. Aunque este artículo se centra en el método de muestra de ISF en el cerebro, el principio y el método pueden aplicarse a otros órganos por la modificación apropiada si es necesario.
Microdiálisis primero fue empleado en la década de 1960 y desde entonces ha sido ampliamente utilizado para recoger pequeñas moléculas como aminoácidos o neurotransmisores en el cerebro. Sin embargo, la reciente disponibilidad comercial de las sondas de microdiálisis con peso molecular alto cortar membranas (100 kDa 3 MDa) ha extendido su aplicación a las proteínas relativamente mayores en ISF así4,5,6 ,7. Los estudios de uso de estas sondas ha llevado a la conclusión que las proteínas como tau o α-sinucleína que durante mucho tiempo se pensó que exclusiva citoplásmico también son fisiológicamente presente en ISF4,5,8.
Una de las dificultades con sondas de microdiálisis de corte grandes membranas (normalmente más de 1.000 kDa) es que son más susceptibles a la pérdida de líquido de ultrafiltración debido a la presión interna acumulada en las puntas de prueba. Sondas de microdiálisis aquí tienen una estructura única para evitar este problema. La presión no se construirá debido a esta estructura, por lo tanto microdialysis con estas puntas de prueba debe ser operado en un modo de "push-pull" utilizando una bomba de jeringa para inundar las sondas (= empuje) y una bomba peristáltica/rodillo para recoger la venida del dializado de la salida de la sonda (= tirar) 9 (aunque necesita empujar y tirar bombas, debido a la cancelación de los orificios de ventilación en las puntas de prueba, la presión el sistema es técnicamente sólo impulsado por la bomba de extracción). Este artículo comienza con la cirugía estereotáctica de una implantación de cánula guía y describe cómo configurar líneas de microdiálisis para recoger ISF a través de sondas de microdiálisis con 1.000 membranas de corte kDa.

<table><tbody><tr><td>El Micromuestreador Univentor 820</td><td>Univentor</td><td>8303002</td><td>Colector de fracciones refrigerado</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>KD scientific</td><td>KDS-101</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de rodillos</td><td>Eicom Microdiálisis</td><td>ERP-10</td><td></td></tr><tr><td>Raturn Sistema autónomo</td><td>BASi</td><td>MD-1409</td><td>Sistema de movimiento libre Kit de</td></tr><tr><td>jaula de doble especie</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de microdiálisis AtmosLM (longitud del eje 8 mm, longitud de la membrana 2 mm)</td><td>Microdiálisis</td><td>Eicom PEP-8-02</td><td>La longitud del eje para una sonda, una guía, una sonda dumy y un adaptador estereotáxico debe ser idéntica.</td></tr><tr><td>Guía de microdiálisis (longitud del eje 8 mm)</td><td>Eicom microdiálisis</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>Sonda ficticia de microdiálisis (longitud del eje 8 mm)</td><td>Eicom microdiálisis</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td>Tornillo óseo</td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>Super bond C& Conjunto B</td><td>Sunmedical</td><td></td><td>Cemento dental</td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico para animales pequeños con consola de visualización digital</td><td>Kopf</td><td>Modelo 940</td><td>Aparato estereotáxico</td></tr><tr><td>Ratón y rata neonatal</td><td>Adaptador Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Barras de oreja estándar y puntas de goma para ratón Stoelting estereotáxico</td><td></td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Solución de albúmina de suero bovino</td><td>Sigma</td><td>A7284-50ML</td> Tubo FEP de <td>solución BSA al 30%</td></tr><tr><td>(70 cm)</td><td>Microdiálisis Eicom</td><td>JF-10-70</td><td>Volumen interno = 0,5 &micro; L/cm</td></tr><tr><td>Tubo de teflón (50 cm)</td><td>Microdiálisis Eicom</td><td>JT-10-50</td><td>Volumen interno = 0,08 &micro; L/cm</td></tr><tr><td>Tubo Byton</td><td>Microdiálisis Eicom</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de puñalada Luer Intramedic 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>Aguja roma</td></tr><tr><td>Tubo de rodillo</td><td>Microdiálisis Eicom</td><td>RT-5S</td><td>Volumen interno = 4 &micro; L</td></tr><tr><td>Tuerca ciega</td><td>Eicom microdiálisis</td><td>AC-5</td><td></td></tr><tr><td>0,25 mL Tubo de microcentrífuga con tapón</td><td>QSP</td><td>503-Q</td><td>Tubos para colector de fracciones</td></tr><tr><td>Adaptador esterotáxico (longitud del eje 8 mm)</td><td>Microdiálisis</td><td>Eicom PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de conexión</td><td>Microdiálisis Eicom</td><td>RTJ</td><td></td></tr><tr><td>Collar de animales para ratones</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Micromotor Rotativo de Alta Velocidad</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Taladro</td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Destornillador para tornillos de</td><td></td><td></td><td></td>hueso</tr><tr><td>Bisturí</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hisopo</td><td></td><td></td><td></td>de algodón</tr><tr><td>Cortapelos</td><td></td><td></td><td></td> quirúrgicos</tr></tbody></table>

en vivo sondas de microdiálisis método para recolectar grandes proteínas extracelulares de líquido intersticial cerebral con corte de peso molecular alto

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

Microdiálisis in vivo es una técnica poderosa para recoger ISF en despiertos, comportándose libremente animales basados en el principio de la diálisis. Aunque la microdiálisis es un método establecido que mide relativamente pequeñas moléculas como aminoácidos o neurotransmisores, se ha utilizado recientemente para evaluar también la dinámica de moléculas más grandes en ISF usando puntas de prueba con alto peso molecular cortado membranas. Al uso de estas sondas, microdialysis tiene que ejecutar en modo push-pull para evitar la presión acumulada dentro de las sondas. Este artículo proporciona protocolos paso a paso, incluyendo cirugía estereotáctica y cómo configurar líneas de microdiálisis para recoger las proteínas de la ISF. Durante microdialysis, drogas pueden administrarse ya sea sistémica o por infusión directa en ISF. Microdiálisis reversa es una técnica para incorporar directamente compuestos en ISF. Inclusión de medicamentos en el búfer de perfusión de microdiálisis permite que difunden en ISF a través de las sondas mientras recogía simultáneamente ISF. Mediante la medición de la proteína tau por ejemplo, el autor muestra cómo los niveles se alteran al estimular la actividad neuronal por microdiálisis reversa de picrotoxin. Ventajas y limitaciones de microdiálisis se describen junto con la solicitud extendida mediante la combinación de otros métodos en vivo .

Para estimular o inhibir la actividad neuronal en la microdiálisis reversa11,12,13, picrotoxin, antagonista de los receptores GABAA o tetrodotoxina, blocker del canal del Na+ se han utilizado. Se ha demostrado que liberación de tau es estimulada por el aumento de la actividad neuronal13,14. Consistente con estas obse...

Microdiálisis in vivo ha permitido colección de moléculas presentes en el líquido intersticial del cerebro (ISF) de animales despiertos, comportarse libremente. Con el fin de analizar las moléculas relativamente grandes en ISF, el actual artículo se centra específicamente en el protocolo de microdialysis con sondas de alto peso molecular cortado de las membranas.

En Vivo Sondas de microdiálisis método para recolectar grandes proteínas extracelulares de líquido intersticial cerebral con corte de peso molecular alto

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de neurociencia sobre cómo se produce el transporte del sustrato de transducción de señales y un aclaramiento de residuos en los espacios extracelulares cerebrales. La principal ventaja de esta técnica es que permite el muestreo y cuantificación de grandes moléculas extracelulares en el fluido intersticial o ISF de animales despiertos que se mueven libremente. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, retire el cabello del cráneo de un ratón anestesiado y utilice las barras de las orejas y una abrazadera nasal para fijar el animal de forma segura en un adaptador.Aplique un ung ón en los ojos del animal y coloque el adaptador sobre el aparato estereotaxico. Utilice un bisturí para hacer una incisión de la piel sagittally sobre el cráneo y adjunte un taladro en el manipulador del marco estereotaxico. Baje el taladro hasta que toque suavemente lambda y restablezca la coordenada DV del taladro a cero.Entonces, mueva el taladro al bregma para reajustar las coordenadas AP y ML a cero. Mueva el taladro de bregma a la coordenada vertical. Baje el taladro al cráneo y establezca la coordenada DV en cero de nuevo.Después de repetir el procedimiento para una tercera coordenada, taladre cuidadosamente un agujero de rebaba en la coordenada de destino, seguido de un segundo agujero en el lado contralateral del hueso parietal. Inserte un tornillo óseo en el segundo orificio y coloque la pieza de bloqueo de una tapa de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros en el cráneo para que los orificios de la rebaba estén dentro del círculo. A continuación, coloque una cánula guía en el brazo más corto del adaptador estereotaxico y fije la cánula con una tuerca de tapa.Coloque el brazo más largo del adaptador estereotaxico en la abrazadera del electrodo y conecte el brazo en el manipulador del aparato estereotaxico. Gire el conjunto estereotaxico DV en el brazo manipulador 12 grados y mueva la cánula guía al orificio de la rebaba. Luego, baje lentamente la cánula guía 1.2 milímetros en el cerebro.Agregue cemento dental a la corona hasta que la parte metálica de la cánula guía, el tornillo óseo y cualquier cráneo expuesto estén cubiertos y asegurados y deje que el cemento se seque. Después de 12 a 20 minutos, retire el adaptador estereotaxico de la abrazadera del electrodo, retire la tuerca de la tapa y reemplace el adaptador estereotaxico por una sonda ficticia. A continuación, vuelva a sujetar la tuerca de la tapa, suelte el ratón del aparato estereotaxico y alberge al ratón solo en una jaula individual.Antes de configurar la microdiálisis, llene una jeringa desechable de un mililitro con agua destilada y utilice un tubo de vin viton para conectar la jeringa a la salida de una sonda de microdiálisis. Cubra manualmente los orificios de ventilación y presione suavemente el émbolo de la jeringa para infundir agua la sonda. Confirme que el agua aparece en la entrada de la sonda y que hay fugas en la superficie de la membrana de microdiálisis.Para activar la sonda, sumerja las membranas de la sonda en 70-100%etanol durante dos segundos, seguido de una segunda infusión de agua destilada. Conecte una aguja de conexión a una entrada y una línea de salida y cargue una jeringa desechable de tres mililitros con tampón de perfusión recién preparado. Conecte una jeringa equipada con una aguja de extremo romo al extremo de entrada del tubo y utilice una bomba de jeringa para llenar todo el tubo con tampón de perfusión.Cuando el tubo esté lleno, sustituya la aguja de conexión entre las líneas de entrada y salida por la sonda de microdiálisis activada y la tuerca de la tapa y monte un tubo de rodillos en el tubo de salida de una bomba de rodillos. Arranque la bomba de la jeringa a 10 microlitros por minuto y la bomba de rodillos a 9,5-9,8 microlitros por minuto. Ahora coloque el collar alrededor del cuello del animal implantado de la cánula guía anestesiada y retire la tuerca de la tapa y la sonda ficticia.Inserte lentamente la sonda de microdiálisis a través de la cánula guía y fije la tuerca de la tapa. A continuación, coloque el ratón en una jaula conectada a un sistema de movimiento libre y ate el ratón con el collar. Después de al menos una hora, detenga secuencialmente la bomba de rodillos y la bomba de la jeringa, reiniciando las bombas con la bomba de jeringa ajustada a un 20% más rápido que la bomba de rodillos y coloque el extremo libre del tubo de salida en un colector de fracción refrigerado para recoger el ISF cerebral.Cuando se haya obtenido el volumen experimental adecuado, quite la sonda y controle la recuperación del mouse como se acaba de demostrar. De acuerdo con observaciones anteriores, cuando se administran 50 micromolares Picrotoxina a través de la microdiálisis inversa como se ha demostrado en ratones C57B6J despiertos, se observa un aumento de los niveles intersticiales de tau endógeno en comparación con los niveles medidos en animales tratados con un control vehicular. Además de las administraciones de medicamentos, la microdiálisis se puede combinar con otros métodos in vivo como el registro de EEG u optogenética para responder preguntas adicionales sobre cómo la actividad neuronal influye en la concentración de sustrato en la ISF.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El seguimiento de los niveles de neurotransmisores extracelular en las regiones cerebrales distintas de animales libres de movimiento además de informaciones sobre el vínculo entre la liberación de neurotransmisores y la conducta. Microdiálisis in vivo, junto con detección electroquímica ofrece anatómica excelente y la resolución de químicos, así como información sobre cómo la neurotransmisión basal se ve alterada por las manipulaciones farmacológicas o fisiológicas.

La cirugía estereotáxica de supervivencia en los roedores

La modulación de hippocampally dependiente de memoria de trabajo espacial mediante microinyección intrahipocampal directo, acompañado y seguido...

Microinyección insulina hipocampo y<em&gt; En vivo</em&gt; Microdiálisis durante la prueba de memoria espacial

El video muestra el proceso de usar una sonda de microdiálisis para recolectar proteínas extracelulares del líquido intersticial (ISF) del cerebro de un ratón. Una sonda de microdiálisis, equipada con una membrana semipermeable cortada de alto peso molecular, se inserta en el cerebro de un ratón anestesiado a través de una cánula guía implantada. La sonda, conectada a bombas, permite que un tampón fisiológico perfunde el tejido cerebral y se mezcle con el ISF. Las proteínas en el ISF se...

Microdiálisis de líquido intersticial del cerebro de un ratón para aislar proteínas extracelulares

Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.

La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

La microdiálisis es una técnica muy utilizada en la investigación en neurociencias. Por lo tanto sondas comerciales están en gran demand.In esta obra un conjunto de sonda se explica en detalle la construcción de una sonda fiable, concéntrico a medida microdiálisis por menos de $ 10.

Por encargo Microdiálisis Sonda Diseño

Aquí, se describe un método para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de la membrana. Este protocolo tiene la ventaja clara de producir enriquecido microvessel muestras con proteínas aceptable rendimiento de animales individuales. Muestras pueden utilizarse para análisis de proteína sólida en el endotelio microvascular cerebral.

Un método Simple y Reproducible para preparar muestras de membrana de microvasos de cerebro recién aislado de rata

Aquí, describimos un método para microdiálisis en vivo analizar liberación de aspartato y glutamato en el hipocampo ventral de ratas epilépticas y no epilépticas, en combinación con las grabaciones de EEG. Concentraciones extracelulares de aspartato y glutamato pueden ser correlacionadas con las diferentes fases de la enfermedad.

Microdiálisis de aminoácidos excitatorios durante las grabaciones de EEG en mover libremente las ratas

El protocolo aquí proporciona un muestreo dinámico detallado en tiempo real del líquido extracelular del hipocampo de ratas despiertas utilizando un sistema de microdiálisis.

Recolección dinámica en tiempo real de líquido extracelular del hipocampo de ratas conscientes utilizando un sistema de microdiálisis

In vivo, las comunicaciones intercelulares que sustentan muchas enfermedades del sistema nervioso central, como el glioblastoma (GBM), son notoriamente difíciles de medir y caracterizar. Aquí describimos procedimientos de microperfusión cerebral de flujo abierto (cOFM) que pueden emplearse para muestrear componentes del líquido intersticial en un modelo animal longitudinal de GBM.

Uso de microperfusión cerebral de flujo abierto para la recogida longitudinal de fluido intersticial en un modelo animal de glioblastoma

Grabaciones extracelular de la actividad neuronal mediante sondas de silicio en la rata anestesiada se describen. Esta técnica permite obtener información a través de múltiples áreas cerebrales de más de 100 neuronas simultáneamente. Proporciona información con una resolución única célula sobre la dinámica de conjuntos neuronales en varios circuitos locales.

Grabación a gran escala conjuntos neuronales con sondas de silicona en la rata anestesiada

Aprende microdiálisis in vivo con sondas de alto peso molecular para recolectar proteínas grandes del líquido intersticial cerebral en ratones despiertos. Este método permite estudiar señalización neuronal y eliminación de desechos en tiempo real.

En Vivo Sondas de microdiálisis método para recolectar grandes proteínas extracelulares de líquido intersticial cerebral con corte de peso molecular alto (Video) | JoVE Journal

En Vivo Sondas de microdiálisis método para recolectar grandes proteínas extracelulares de líquido intersticial cerebral con corte de peso molecular alto

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