Name: Seguimiento en Vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprende a realizar imagen en vivo de larga duración en pupas de Drosophila para estudiar la respuesta inflamatoria y la migración de hemocitos hacia heridas. Este método permite analizar la inmunidad innata y la cicatrización tisular con alta resolución.

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Nos gustaría agradecer a miembros de la Martin, Nobes, Richardson y madera labs para el debate útil. También agradecemos a la instalación de Bioimagen Wolfson (Universidad de Bristol, Reino Unido), centro de Stock de Bloomington (Universidad de Indiana, USA) y centro de recursos de Drosophila de Viena (para las poblaciones de Drosophila ) y Flybase (para hasta la fecha Drosophila anotación de genes). Este trabajo fue financiado por una subvención de proyecto de MRC a P.M. y W.W. (Señor/J002577/1), un Wellcome Trust Senior Fellowship a W.W. y un Wellcome Trust Award de investigador a la tarde.

Este protocolo consta de cuatro principales pasos secuenciales: (1) preparación de poblaciones de Drosophila y puesta en escena de Drosophila pupa, pupa (2) la disección y montaje, hiriendo a pupa (3), (4) en vivo Time-lapse proyección de imagen confocal.
1. preparación de las poblaciones de Drosophila y puesta en escena de pupas
<ol><li>Obtener poblaciones de Drosophila apropiadas (ver introducción y Tabla de materiales).</li>
	<li>Recoger jóvenes moscas adultas saludables del genotipo correspondiente.<ol>
<li>Seleccione adulto vuela mediante el uso de pastillas de dióxido de carbono gas para anestesiar brevemente las moscas y un pincel fino para transferir vuela del genotipo apropiado o género a un frasco de colección.</li>
		<li>Añadir 20 machos y 20 hembras vírgenes a cada frasco contiene medios de alimentos mosca (una mezcla de harina de maíz-melaza-agar, véase Tabla de materiales) complementado con la levadura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la óptima generación pupal, punta el adulto vuela cada día en nuevos alimentos en frascos frescos, manteniendo todos los frascos a 25 ° C. Nota: Si se utiliza el sistema de Gal4-UAS31 para expresión génica específicos de linaje, todas las medidas deben realizarse a 25 ° C o superior, como el sistema de Gal4-UAS es sensibles a la temperatura.</li>
	<li>18 h antes de la sesión programada de imágenes, seleccione al menos 10 recién formados blanco pre pupas (figura 1A) de los viales (es decir, 0 h después de la formación del pupario, APF) con pinzas o un pincel fino para sacar las pupas de la superficie interior del frasco y pupas de transferencia cuidadosamente al lado de un frasco plástico limpio vacío. Nota: Errante 3rd instar larvas arrastran hacia arriba en el medio de la comida a la pupación; prepupas blanco recién formados se pueden identificar fácilmente ya que poseen espiráculos anteriores evertidos y son inmóviles (a diferencia de 3 larvas de estadio de lard ). La cutícula se transforma en la 'mosca' (la envoltura pupal) que es inicialmente suave y blanco17. Debe tenerse cuidado para evitar dañar las pupas, como esto puede conducir a una respuesta inflamatoria inducida por la lesión no deseada, sino también a un retraso significativo en el desarrollo.</li>
	<li>Edad de las pupas seleccionadas a la etapa de desarrollo apropiada (18 h APF dará resultados óptimos) en el frasco a 25 ° C. Nota: Las pupas se convierten, la envoltura pupal se volverá progresivamente más oscuro y más frágiles.</li>
	<li>Otros reactivos se preparan para el siguiente paso antes de tiempo. Para hacer el heptano pegamento, combina una longitud de 20 cm de cinta de doble cara enrollada con heptano 20 mL en un tubo de centrífuga de 50 mL, sellado con la película de parafina y en la temperatura durante la noche en el Banco.</li>
</ol>2. preparación y disección de pupas de Drosophila 
<ol><li>Transferencia de las pupas de Drosophila efectuadas a un pedazo de cinta adhesiva de doble cara montada sobre un portaobjetos de vidrio. Colocar las pupas de modo que el lado ventral está firmemente pegado a la cinta y el lado dorsal es hacia arriba (figura 1B). Nota: La parte anterior de la pupa será identificable de los dos espiráculos que sobresalen del extremo anterior de la envoltura pupal.</li>
	<li>Retire con cuidado el pupas de su cubierta protectora pupario bajo un microscopio de disección trasmitida utilizando pinzas y tijeras micro (figura 1B-D).<ol>
<li>Al principio, hacer una incisión en la región más anterior del pupario con el fórceps (figura 1B). Asegurar que la envoltura pupal en esta área es hueco y carece de tejido pupa porque las pupas habrá encogido dentro de la caja durante el temprano desarrollo pupal.</li>
		<li>Después de esta primera incisión, cuidadosamente rasgar o cortar la envoltura pupal abierta en un anterior hacia el posterior, con pinzas o microscissors (figura 1) hasta que la pupa está totalmente libre de la cubierta frágil opaca marrón (figura 1). Nota: En esta etapa las pupas son muy frágiles y debe tenerse cuidado para evitar pinchar la superficie de la pupa; pinchar es obvio como hemolinfa sale rápidamente desde el sitio de punción. Pupas con pinchazos, sin embargo pequeños, deben ser desechados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte las pupas en un plato con fondo de cristal, usando pegamento de heptano.<ol>
<li>Utilice una pipeta de 20 mL para colocar una gota 10 mL de heptano preparados pegamento (véase la sección 1.6 anterior) en una línea en el plato con fondo de cristal.</li>
		<li>Deje que el pegamento se seque durante 5 s antes de transferir las pupas disecadas cuidadosamente sobre el adhesivo de heptano utilizando fórceps (Figura 1E).</li>
		<li>Para facilitar la herida y la proyección de imagen, se alinean las pupas en una fila; se sugieren aproximadamente 5 pupas pero más se podrán administrar con experiencia. Nota: Uso de pegamento de heptano se recomienda cuando se utilizan sistemas de proyección de imagen vertical pero no es necesario cuando se utiliza un sistema invertido. Si el pegamento crea óptico aberraciones durante proyección de imagen, pupas pueden colocarse directamente sobre el cubreobjetos en lugar de ello, la adherencia natural entre la pupa del tejido y el vidrio será suficiente en la mayoría de los casos para la proyección de imagen estable, siempre y cuando se tiene cuidado al mover la proyección de imagen plato entre microscopios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para mejores resultados, Monte las pupas que el ala quede plano sobre el cubreobjetos con la mayoría de la superficie del ala en contacto directo con el cubreobjetos (Figura 1F). Rollo de las pupas con unas pinzas para cambiar su posición para asegurar que el ala se monta correctamente.</li>
	<li>Para evitar la deshidratación de la muestra durante el período de proyección de imagen, añadir un trozo de papel de filtro absorbente humedecido en agua destilada al lado del plato con fondo de cristal en el extremo de montaje, teniendo cuidado de no perturbar las pupas (Figura 1E). Cubrir el plato con una tapa. Nota: Están listas para herir y proyección de imagen de pupas.</li>
</ol>3. láser inducida por heridas a alas Pupal de Drosophila 
<ol><li>Transferir el plato con fondo de cristal que contienen las pupas montadas a un microscopio de campo amplio, equipado con un sistema de ablación láser sintonizable.<ol>
<li>Uso de un láser pulsado-UV enfriados por aire bombea nitrógeno ablación atentos a 435 nm – véase Tabla de materiales de información11; la exacta longitud de onda de la luz que se utiliza para la iluminación es seleccionado por el usuario a través de una célula de tinte apropiado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Óptica brightfield, ajustar los controles de etapa de microscopio para localizar el ala pupa de la pupa primer ser herido (Figura 1F).</li>
	<li>Para obtener resultados óptimos, utilice un objetivo de inmersión 40 X o 63 X aceite para la proyección de imagen y láser ablación; Asegúrese de que el líquido de inmersión utilizado (aceite o glicerol) es consistente entre ablación y sistemas de imágenes. Ajuste del microscopio para enfocar sobre el plano del epitelio ala pupa más cercano el cubreobjetos de vidrio (es decir, el foco en la región del epitelio para ser herido) usando el mando de foco fino.</li>
	<li>Usando los ajustes de etapa de microscopio, coloque el ala pupa para que el área a ser heridos está alineado directamente con el área de destino conocido del laser de ablación.</li>
	<li>Usar una diapositiva de atenuador de densidad de energía instalada en el microscopio para ajustar manualmente el nivel de potencia de la luz de la ablación. Nota: El regulador del atenuador tiene topes y reglas para identificar el nivel relativo de atenuación y permitir el uso de ajustes reproducibles.</li>
	<li>Usando un control manual externo gatillo , activar el láser de ablación con un solo clic breve sobre el gatillo para hacer una herida. Verifique la aparición de la burbuja de aire transitorio en el sitio de ablación ya que heridas normalmente serán acompañada. Compruebe si ha tenido éxito usando los filtros fluorescentes adecuados para visualizar el epitelio pupa la herida inducida por láser. Nota: tenga cuidado para evitar la exposición accidental a los rayos láser como las reflexiones de la viga pueden causar severo ojo o daño de la piel.</li>
	<li>Si herir es infructuoso, variar el plano focal (mover el foco del microscopio ligeramente por encima o por debajo del actual nivel focal) y repetir el clic del disparador de la ablación. Por otra parte, aumente gradualmente la energía del laser con la diapositiva de atenuador hasta logra el tamaño deseado de la herida.</li>
	<li>Para variar la frecuencia de repetición del pulso de láser ablación, use la perilla de la tasa de repetición en el panel de control trasero (que cambia la tasa de menos de 1 pulso/s hasta 60 Hz). Para herir óptimo, fijar las tasas de repetición de pulso a 40 Hz.</li>
	<li>Para generar diferentes heridas de tamaño, utilice la diapositiva de atenuador de densidad de energía para ajustar manualmente el nivel de potencia de la luz de la ablación.</li>
	<li>Abstenerse de herir todas las pupas montadas y utilizar estas pupas no ablación como controles unwounded.</li>
	<li>Para obtener resultados consistentes, periódicamente vuelva a alinear el sistema de ablación (usando las correspondientes instrucciones). También, limpiar y rellenar la celda de resonador de tinte que controla la longitud de onda de salida de láser.</li>
</ol>4. en Vivo Time-lapse proyección de imagen Confocal
<ol><li>Transferir rápidamente el plato con fondo de cristal en un microscopio apropiado para Time-lapse de imágenes. Nota: Para obtener resultados óptimos, utilice una alta especificación de confocal o spinning disco microscopio equipado con detectores sensibles que pueden detectar GFP y mCherry fluoróforos.</li>
	<li>Para el ala pupa todo la imagen, utilice un objetivo de bajo aumento (por ejemplo, 20 X) (figura 2A). Para la reparación de la imagen de la herida y la respuesta inflamatoria que acompaña con alta resolución espacial, utilizar la inmersión de aceite 40 X (NA 1.3) o 63 X lentes del objetivo (NA 1.4) (ver imágenes representativas en figura 2B-D).</li>
	<li>Abra el software de captura de imagen apropiados asociado con el microscopio.</li>
	<li>Utilizando el software de captura de imagen, encender lasers apropiados p. ej. el 488 nm y 561 láseres nm visualizar fluoróforos GFP y mCherry, respectivamente (haciendo clic en las casillas pertinentes) y ajustar la potencia del láser y gain/offset configuración para dar señal fluorescente suficiente evitando la saturación de píxeles; utilizar la menor potencia posible del láser (en el rango 5-20%) para minimizar el fotoblanqueo y fototoxicidad.</li>
	<li>Para capturar tanto la reparación epitelio y reclutamiento de células inflamatorias, ajustar el microscopio para grabar una z-pila usando los botones de ajuste de enfoque fino del panel de control; para obtener resultados óptimos, ajustar el software (con clics de botón manual) a rodajas z registro a través del ala pupa (mínimo cada 3 mm), de la parte superior del epitelio herido a través del espacio extracelular bajo (contiene hemocitos migrantes) para lograr una gran z-stack (en el rango de 50-100 mm).</li>
	<li>Para Time-lapse de imágenes, grabar z-pilas en intervalos de tiempo regulares (mínimo cada 30 s) de al menos 1 h la herida. Nota: El intervalo de tiempo exacto entre z-pilas elegido representa un compromiso entre capturar la dinámica de la célula cambian rápidamente y evitando foto-blanqueo de las muestras.</li>
	<li>Para la imagen simultáneamente varias pupas (incluyendo controles unwounded no ablación), utilizar un escenario motorizado (atado microscopio) y la función de adquisición de múltiples posiciones disponible dentro del software de imágenes. Ajustar manualmente la posición de cada pupa individual dentro del software usando las perillas de control de posición de fase y luego configurar manualmente los límites apropiados z-pila (superior e inferior) de cada pupa individual.</li>
	<li>Visualizar las imágenes de Time-lapse durante la captura de imagen o más adelante con software de análisis de imagen especializado (como el ImageJ32) utilizando proyecciones de z-stack o renderizado 3D. Por ejemplo, para seguir los movimientos de los hemocitos (como en la figura 2' y D'), pista hemocyte núcleos usando el acceso abierto plug-ins de ImageJ "TrackMate" o el "Manual de seguimiento" (métodos publicados en 33, 34).</li>
	<li>Utilizar sondas photoconvertible (como Kaede30) selectivamente photoconvert y la etiqueta de un subconjunto de células epiteliales o inmunes durante proyección de imagen.<ol>
<li>Abrir módulos apropiados dentro del software de imágenes para realizar el photoconversion (como el FRAP, recuperación de fluorescencia tras blanquear foto módulo) y activar el 405 nm láser (haciendo clic en el cuadro de software pertinentes)35.</li>
		<li>Seleccionar las celdas que photoconverted dentro del software FRAP con la herramienta de selección cuadrada, circular o a mano alzada. Dentro del software FRAP, defina el curso del tiempo para photoconversion (elblanqueo) para un sola iteración/marco y el 405 nm láser en energía del laser de 20%. Manualmente, haga clic en iniciar el experimento para realizar photoconversion.</li>
		<li>Salir del módulo FRAP (haga clic en cerrar) y volver a la pantalla original de imágenes dentro del software; uso el 488 nm y láseres de 561 nm para el comportamiento de las células photoconverted y no photoconverted de la imagen configurando una z-stack y grabación Time-lapse como arriba. Nota: Photoconverted sondas permanecen estables durante muchas horas después de la photoconversion inicial, lo que permite el comportamiento de las células photoconverted a seguir en el tiempo (de al menos 5 horas). Por ejemplo, las células inflamatorias en la herida pueden ser selectivamente photoconverted (figura 2F) y su comportamiento seguido como que resolución desde el sitio de la lesión (figura 2 y H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Los autores declaran que no tienen ninguna competencia conflictos de intereses.

La respuesta aguda inflamatoria al daño tisular es un proceso complejo y altamente dinámico que es esencial para coordinar la reparación de tejidos lesionados, incluyendo la remoción de restos necróticos y la lucha contra la infección. Para comprender y desentrañar los aspectos fundamentales de esta respuesta, es fundamental que los estudios son realizados en vivo sobre muestras de 3 dimensiones de la vida en orden para el comportamiento exacto y las interacciones de los diversos linajes involucrados a seguir de la célula exactamente en el tiempo. Análisis en tiempo real de la dinámica de estas células permiten una caracterización más detallada de los fenotipos mutantes que estática momentos solo de muestras fijadas mediante técnicas de inmunohistoquímica clásica. Tradicionalmente, la mayoría estudios de imágenes en vivo utilizando el modelo de Drosophila genéticamente manejable han utilizado la fase embrionaria del desarrollo de la mosca debido a su transparencia óptica y la inmovilidad en comparación con las posteriores etapas de desarrollo4 , 5. sin embargo, más recientemente nuestro grupo y otros han desarrollado la pupa de Drosophila como un modelo novedoso para realizar imágenes a largo plazo de reparación de la herida y la inflamación al mismo tiempo y de alta resolución en vivo8,22 ,23. Este nuevo enfoque ofrece un interesante potencial a largo plazo para la presidencial aspectos fundamentales del comportamiento de células inflamatorias y puede ser adaptado más para investigar el comportamiento dinámico de otros linajes celulares (como Drosophila adipocitos 38) después de lesión del tejido.
Hay una serie de factores críticos durante la preparación y proyección de imagen de heridos pupas de Drosophila que determinarán la calidad de las imagen los resultados descritos anteriormente. Sin duda el paso más difícil del protocolo descrito es la disección cuidadosa y colocación exacta de las pupas antes de la herida y la proyección de imagen. Pupas en esta etapa del desarrollo son extremadamente frágiles y daños accidentales incluso menores a las pupas durante etapas de preparación deterioran significativamente el experimento; cualquier pupas que pueden haber sufrido daño involuntario deben ser desechados del experimento ya que este daño puede activar su propia respuesta inflamatoria, que podría conducir a más extenso (o incluso sistémicos) efectos sobre el comportamiento de células inflamatorias en otros lugares en la pupa. Debido al continuo desarrollo de las pupas en estos experimentos (que están experimentando los cambios de tejido importante para preparar los tejidos para la edad adulta), ocasionalmente pupas se moverán durante el transcurso de la proyección de imagen. Pupa del balanceo es, sin embargo, es más probable que ocurra si las pupas no se han montado correctamente con la superficie más plana del reborde de la mariposa (u otro tejido para ser reflejada) en el contacto directo con el cubreobjetos; uso de pegamento de heptano para estabilizar las pupas en el vidrio de cubierta debe minimizar este movimiento indeseable. Por esta razón, gran debe también tener cuidado para evitar desalojar las pupas de sus posiciones cuidadosamente alineados al mover las muestras entre microscopios; Idealmente, el láser herido se adjuntará el mismo microscopio para posterior proyección de imagen de Time-lapse y foto-conversión.
Además de la competencia de la disección pupal y pasos para el montaje, el genotipo exacto de las pupas de Drosophila utilizado tendrá un efecto significativo sobre la calidad de las proyección de imagen los datos generados. Por ejemplo, el número de copias del conductor Gal4 y construcciones UAS (e.g. UAS-GFP o UAS-Kaede) dentro de un genotipo de pupa individual determinarán la relación señal a ruido durante proyección de imagen posterior. Como regla general, cuantas más copias de un Gal4 o UAS construyen presente, mayor será el nivel total de proteína fluorescente (e.g. GFP o Kaede) dentro del tejido. El nivel óptimo de proteína fluorescente será, sin embargo, un cuidadoso equilibrio entre la fluorescencia de tejidos elevando suficientemente para permitir que la alta calidad de imagen (que permite el uso de potencias de láser baja, reducción de fotoblanqueo y proyección de imagen en el tiempo extendido periodos) pero sin causar toxicidad celular inducida por el fluoróforo; el número óptimo de construcciones Gal4 y UAS en cada experimento variarán según los conductores particulares y fluoróforos se utiliza. Debe tener cuidado de levantar las pupas a 25 ° C (o por encima, hasta los 29 ° C) porque el sistema Gal4-UAS es sensibles a la temperatura y será ineficaz para baja temperaturas31. Para alcanzar niveles adicionales de control sobre el tejido o tiempo-especificidad de Gal4-impulsado por la expresión, el represor sistema de Gal4-UAS Gal80 también se puede incluir dentro de la pupa genotipo39. Gal80 puede ser utilizado para reprimir la actividad de Gal4 dentro de un tejido particular (utilizando un Gal80 de tejidos específicos) o en un momento determinado (utilizando una temperatura Gal80 sensible). El sistema Gal4-UAS puede combinarse además con otros sistemas binarios independientes (como los sistemas de QF -QUAS y LexA -lexAop ) para generar Drosophila que tiene varias construcciones (por ejemplo, fluoróforos, líneas RNAi u otras construcciones genéticas) expresada simultáneamente en una variedad de diferentes tejidos39.
Uso de este nuevo modelo pupal de Drosophila ofrece una serie de ventajas sobre el enfoque más tradicional del embrión. En comparación con la proyección de imagen a corto plazo (hasta 3 h) disponible en embriones en fase 15 (la fase más embrionaria hiriendo a estudios que se realizan), pupas pueden ser reflejadas sobre períodos mucho más largos de tiempo (en principio hasta la edad adulta después de 96 h de desarrollo pupal ). Además, un número mucho mayor de hemocitos (células inmunes innatas deDrosophila ) está presentes dentro de los tejidos pupas (y disponible para la proyección de imagen) en comparación con el número más limitado en el embrión y esto nos ha permitido reunir mucho más datos de imágenes en el comportamiento de hemocyte utilizando el mismo número total de ejemplares. Fundamentalmente, esto, a su vez, nos ha permitido aplicar modelos matemáticos más sofisticados para analizar comportamiento de hemocitos y extraer características novedosas de la herida atrayentes y la respuesta inflamatoria que de lo contrario hubiera seguido siendo experimental inaccesible23. Otra ventaja del modelo pupa es que caída de silenciación de genes es considerablemente más eficiente que en anteriores etapas embrionarias, lo que permite mejores análisis del tejido o inactivación de genes específicos mediante sistemas binarios como el sistema de Gal4-UAS 39. la eficacia de RNAi en esta etapa se abre así la posibilidad de realizar a gran escala (o incluso imparcial en todo el genoma) pantallas de RNAi para buscar nuevos actores involucrados en la reparación de la herida o comportamiento de la célula inflamatoria.
Sin embargo, pupas de Drosophila claramente no se puede utilizar para el estudio de los fenotipos resultantes de mutaciones genéticas que son embrionarias letal; estudios funcionales y de imagen en vivo de los genes que son esenciales para el desarrollo embrionario deben realizarse en embriones, por lo tanto todavía a menos que la caída de silenciación de genes en un momento o manera de tejidos específicos permite el desarrollo que se produzca a través de etapas de pupal. El embrión sigue siendo el modelo de elección para el estudio y vivir-imagen ciertas características de comportamiento de células inmunitarias, como la dispersión del desarrollo de las células inmunes de su origen, contacto-inhibición de la locomoción y la fagocitosis de cuerpos apoptóticos generados durante el desarrollo tejido esculpir5,8 que no se han observado en modelos pupas. Aunque los estudios en adultos y en larvas de Drosophila han proporcionado una penetración importante en los mecanismos subyacentes herida inflamación y reparación40,41,42,43, 44 estudios de imágenes en vivo en estas etapas han probado difíciles debido a la naturaleza inherentemente móvil de las muestras. Mientras que las larvas pueden anestesiar para permitir breves períodos de proyección de imagen en vivo, debido a la naturaleza temporal de la anestesia, solo corta las instantáneas de la herida en reparacion o respuesta inflamatoria puede ser visualizado45. Un reciente estudio ha desarrollado un protocolo mejorado que permite la proyección de imagen a largo plazo de larvas de cicatrización46, aunque la preparación y proyección de imagen todavía siguen siendo considerablemente más difícil que en embriones o pupas. En el largo plazo, visualizamos mediante la utilización de la etapa de desarrollo más adecuada para cada cuestión específica, estudios en los cuatro de estas diferentes etapas de Drosophila - de embriones a través de períodos larvales y de pupas a la edad adulta (cada uno con sus únicas ventajas y limitaciones) - proporcionará conocimientos complementarios en el mecanismo molecular y celular de conducción reparación de herida y la inflamación.
En el futuro, este protocolo para herir y la proyección de imagen a largo plazo de Drosophila pupa puede ser fácilmente adaptado para el estudio de una variedad de fenómenos relacionados con la inflamación y tiene un alcance potencial para descubrir nuevas características de la respuesta inflamatoria de la herida. La combinación de la proyección de imagen a largo plazo, junto con la solicitud de fluoróforos photoconvertible (como Kaede), son de gran valor para comprender la dinámica del comportamiento de células inmunitarias innatas y en particular, lejos menos entendido la fase de resolución de la respuesta inflamatoria de la herida. Por etiquetado específicamente individual o subpoblaciones de células inmunes (como ésos contratados a una herida) será posible analizar cómo afecta la exposición a una señal ambiental (como un cadáver o lesión) respuesta subsecuente de la célula inmune para un posterior CUE. El comportamiento inflamatorio de hemocitos de Drosophila puede ser modificado por las experiencias anteriores - por ejemplo, está preparados para responder a la lesión del tejido por previa fagocitosis de cuerpos apoptóticos durante desarrollo12 pero queda por ver Si otras señales ambientales inducen eventos similares de cebado. Aunque estudios de pupas heridas hasta el momento se han centrado en la respuesta inflamatoria innata, el modelo de ala pupa también proporciona una oportunidad ideal para ambos vivir-imagen y diseccionar los mecanismos subyacentes de la reparación epitelial de la herida. Además, este método de imagen pupa también podría adaptarse para investigar el comportamiento dinámico de otros linajes celulares en respuesta a tejido daño38, en el ala pupa sí mismo o en otros tejidos pupas fácilmente accesibles (como ojos, piernas o tórax). Finalmente, combinando la maleabilidad genética del Drosophila junto con la facilidad de proyección de imagen de pupa a largo plazo, novela reparación epitelial o reguladores inflamatorios podrían ser descubiertos mediante la aplicación de imparcial genoma-ancha de la precipitación se acerca.

Una respuesta inflamatoria eficiente y eficaz es fundamental para cualquier organismo a combatir las infecciones, limpiar escombros y orquestan la reparación de tejidos lesionados1. Aunque esta respuesta es un resultado inevitable de la mayoría de daño tisular, inflamación requiere una reglamentación estricta debido a una respuesta inflamatoria inadecuada se ha relacionado con una variedad de diferentes enfermedades humanas (incluyendo las heridas no-curativas crónicas, marcar con una cicatriz excesivo y predisposición al cáncer)1,2,3. Dada esta relevancia clínica, es crucial para obtener una comprensión más detallada de los mecanismos moleculares y celulares, conducción de la respuesta inflamatoria con el fin de desarrollar nuevos indicadores pronósticos y estrategias para tratar una variedad de crónicos inflamatoria condiciones, que podrían proteger los tejidos de reparación de la inflamación prolongada e innecesaria.
En los últimos años, la Drosophila se ha convertido en un sistema bien establecido y valioso modelo para disecar rasgos fundamentales de la respuesta inflamatoria que se conservan de insectos para humanos4,5. En la actualidad, Drosophila ofrece maleabilidad genética mucho mayor que en la actualidad en otros modelos experimentales (como ratones o pez cebra), manipulación genética espacio-temporal exacta en vivo (para inactivar o sobre-expresar cualquier gen de interés dentro de los tipos específicos de la célula en un momento definido del desarrollo) y facilidad de genoma pantallas6,7. Tradicionalmente, la mayoría imágenes en vivo de la cicatrización de heridas y la inflamación en Drosophila se han realizado estudios en etapas embrionarias, como los embriones son inmóviles (a diferencia de Drosophila larvas o adultos) y ópticamente translúcido que permite una alta resolución en vivo imagen8. Esto ha permitido a los investigadores visualizar el reclutamiento de células inmunes innatas de Drosophila (hemocitos) rápido y robusto para el sitio de la herida en respuesta a la lesión mecánica o inducida por láser en el epitelio embrionario9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. mediante la combinación de estos estudios de imagen en vivo con la manipulación genética, estudios en embriones de Drosophila han descubierto muchas proteínas importantes células inmunitarias que controlan el comportamiento de célula inflamatoria in vivo. Por ejemplo, el homólogo del CED-1 Draper (una ITAM dominio-que contienen proteína) ha sido identificado como un importante «daños del receptor que interviene en las células inmunes del Drosophila del reclutamiento en un H2O2-forma dependiente a los sitios de daño15. Niveles de Draper dentro de las células inmunes a su vez son regulados por señalización de JNK inducida por calcio y elevadas aguas abajo de apoptotic cadáver absorción12. Aún más la motilidad hemocyte requiere cambios citoesqueléticas complejas para coordinar la migración dirigida hacia la herida y esto depende de la actividad del citoesqueleto reguladores como la agrupación de actina proteína Fascin16 y la familia de Rho pequeñas GTPasas de Rac y de Rho9.
Drosophila es un insectos holometábolos que pasa por las etapas larvarias y de pupas adicionales después de la embriogénesis, antes de alcanzar la edad adulta17. La Drosophila pupa se ha desarrollado como un modelo adicional para vivir no invasivo-imágenes de una variedad de eventos celulares dinámicos, incluyendo desarrollo celular migración18,19de la división de célula, célula crecimiento20y músculo contracción21. Más recientemente, se ha establecido como un modelo novedoso en el que estudiar la dinámica de herida inflamación y reparación en vivo22,23.
Al igual que en etapas embrionarias, Drosophila las pupas son inmóviles y ópticamente translúcido, después de la disección cuidadosa de su opaco pupal casos18. Aprovechando esta transparencia óptica, se puede seguir el comportamiento en vivo de las células inmunes innatas (hemocitos) en respuesta al daño del tejido dentro de los tejidos pupas de Drosophila , como el ala pupa22. El ala pupa existe como una estructura amfifílicas simple, que consta de dos grandes hojas planas epiteliales que se conectan alrededor de la periferia del ala; el espacio extracelular entre estas dos capas epiteliales está lleno de hemolinfa (sangre de insectos) y gran número de hemocitos móviles24. Al igual que en los embriones, lesión mecánica o inducida por láser en el epitelio del ala desencadena un rápido reclutamiento de hemocitos a la lesión sitio23. Sin embargo, esta etapa pupal ofrece algunas ventajas para la proyección de imagen en anteriores etapas embrionarias. Pupas de heridos pueden ser reflejadas sobre períodos mucho más largos (de al menos 5 horas), más área de tejido está disponible para la perturbación experimental (como la generación de múltiples heridas) y hay un número significativamente mayor de hemocitos presentes en esta etapa ( prever más trayectorias de la célula de otras distancias mayor poder estadístico en el análisis matemático). Además, la eficiencia de inactivación de silenciación de genes se mejora considerablemente en etapas de pupal, permitiendo que muchos genes ser 'derribado' en un tejido o en la forma específica de tiempo en comparación con el enfoque más tradicional de todo mutante de embriones.
Con el fin de seguir la dinámica de la reepitelización de la herida y la respuesta inflamatoria que acompaña en este nuevo modelo pupal, deben etiquetarse dos diferentes poblaciones celulares: el pupa epitelio y las células inmunes innatas (Drosophila hemocitos). Un número de diversos marcadores (Tabla de materiales) está disponible para etiquetar estas dos poblaciones celulares diferentes, la elección del marcador depende del proceso particular que se estudiará. Para marcar el epitelio pupal, líneas de Drosophila que contienen ya sea un ubicuo expresada GFP-tagged E-cadherin (que las etiquetas las uniones) se utilizan habitualmente para indicar las posiciones de los márgenes de celda, o alternativamente, un GFP con etiquetas Dominio de unión a actina de moesina (que etiquete el citoesqueleto de actina) para visualizar las protuberancias de anillo y el borde de ataque de borde de la herida contráctiles actina. Etiquetar los hemocitos de Drosophila , hemocyte específicos srp-Gal425 expresión de unidad de RFP nuclear (para seguimiento de nuclear), GFP citoplásmica o moesina GFP-etiquetado (etiqueta el citoesqueleto del citoplasma o actinia, respectivamente) o un se utilizan photoconvertible fluoróforo (como Kaede). De hecho, a menudo es ventajoso utilizar múltiples marcadores de células inmunitarias en combinación, para permitir el análisis simultáneo del movimiento nuclear y la morfología de la célula (véase resultados representativos). Sin embargo, puesto que este protocolo incluye el uso de pupas de Drosophila , sólo las combinaciones de marcadores genéticos son viables hasta mediados-pupal etapas pueden ser utilizadas. Además, las acciones letales embrionarias no será adecuadas. Esto es poco probable que sea un problema al control de la proyección de imagen (o wild type) pupas pero es importantes considerar cuando genes van a ser derribado o overexpressed, para evaluar su efecto sobre el encierro de la herida o inflamación. En el caso de la mortalidad temprana causada por la caída de gene (o sobreexpresión), un Gal80ts construcción se puede utilizar para inducir la caída Gal4-conducido más adelante en el desarrollo (ver discusión).
En nuestros últimos estudios, pasar a la etapa pupal nos ha permitido reunir suficientes datos de trayectoria de la célula inmune para analizar el comportamiento inflamatorio usando sofisticados modelos matemáticos, que a su vez nos ha permitido deducir nuevos detalles de la herida atrayente inflamatoria señales23. Por ejemplo, este acercamiento reveló que la chemoattractant herida se extiende lentamente por el tejido inflamado a 200 μm2/min, un índice mucho más lento que anteriormente moléculas pequeñas candidato como ATP o H2O2 se ha reportado que difuso de26,27,28,29; Estas moléculas pequeñas «daño» en cambio están probables que actúan como señales permisivas. Por otra parte, siguiendo el comportamiento a largo plazo de las células inmunes innatas que resolución de una herida inicial y están expuestos a un segundo (hecho en varios puntos de tiempo después de la primera), hemos descubierto un período temporal 'desensibilización' durante el cuales las células inmunes son ciegos a lesiones posteriores23. Explotando el potencial a largo plazo de la proyección de imagen del modelo pupal, junto con maleabilidad genética de Drosophila , uno puede seguir el comportamiento de las poblaciones de células inmunitarias específicas (por ejemplo, sólo las células inmunes reclutados en el sitio de la herida) en respuesta a los insultos posteriores, usando el photoconvertible fluoróforo30 que puede expresarse exclusivamente en el linaje de células inmunitarias23.
Aquí se describe un protocolo para visualizar la dinámica de la reparación de la herida y la respuesta inflamatoria asociada a alta resolución espacio-temporal mediante vida pupas de Drosophila . Ofrecemos una metodología detallada para cubrir los pasos necesarios para la preparación inicial de pupas (disección y montaje) y el posterior mediada por láser hiriendo a la proyección de imagen de Time-lapse. También describimos el uso de fluoróforos foto convertibles para permitir el etiquetado de los subconjuntos de la célula inmune específica en vivo. En el largo plazo, esperamos que este nuevo modelo pupal de Drosophila se abre interesantes posibilidades para disecar la compleja señalización dinámica subyacente a la respuesta inflamatoria al daño tisular. Mediante la aplicación de análisis estadísticos más sofisticados uno podría descubrir características de la respuesta que de lo contrario permanecerían experimentalmente inaccesibles, mientras que la mejora de la eficiencia ARNi podría prestarse a la aplicación de la detección de genoma en las células inmunes en vivo para identificar nuevos jugadores regular comportamiento de células inmunitarias.

<table><tbody><tr><td>Drosophila stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ubicuo E-cadherin con GFP ; Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)</td><td>Kyoto Stock Center, DGRC#</td><td>109007</td><td>Las secuencias promotoras de Ubi-p63E impulsan la expresión de Drosophila E-cadherina (shotgun) marcadas en el extremo C-terminal con GFP.</td></tr><tr><td>ubicuo E-cadherin etiquetado con GFP ;; Ubi-p63E-shg.GFP (III)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Universidad de Indiana)</td><td>#58742</td><td>Las secuencias promotoras de Ubi-p63E impulsan la expresión de Drosophila E-cadherina (shotgun) marcadas en el extremo C-terminal con GFP.</td></tr><tr><td>ubicuo etiquetado con GFP Moesin P{sGMCA}3.1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Universidad de Indiana)</td><td>#59023</td><td>El promotor/potenciador sqh expresado ubicuamente impulsa la expresión de un fragmento de Moesin (que incluye las secuencias de unión a actina) marcado con GFPS65T.</td></tr><tr><td>hemocitos específicos serpent-Gal4 driver ; SRP-GAL4; </td><td>Generado por Katja Bruckner</td><td>Generado por Katja Bruckner</td><td>La expresión de Scer\GAL4 fusionado a una cola de poliA está bajo el control de 2 secuencias genómicas aguas arriba de la serpiente Drosophila. Ref: Br&uuml; ckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., R&oslash; rth, P., Perrimon, N. El receptor PDGF/VEGF controla la supervivencia de las células sanguíneas en Drosophila. Célula de desarrollo. 7 (1), 73 y ndash; 84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).</td></tr><tr><td>UAS-nuclearRFP w1118;; P{UAS-RedStinger}6</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Universidad de Indiana)</td><td>#8545 o #8547</td> Las <td>secuencias reguladoras de UAS impulsan la expresión de la forma DsRed.T4 de RFP que se marca en el extremo C-terminal con una señal de localización nuclear</td></tr><tr><td>UAS-cytoplasmicGFP ;; P{UAS-GFP. S65T}</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>Múltiples stocks disponibles (p. ej. #1522)</td><td>Expresión de la versión S65T de GFP por secuencias reguladoras de UAS; la variante S65T exhibe un mayor brillo.</td></tr><tr><td>UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#26161</td> La <td>proteína Kaede emite fluorescencia verde brillante después de la síntesis, pero cambia eficientemente a una fluorescencia roja brillante y estable en la irradiación con UV.</td></tr><tr><td>GFP etiquetado como calabaza espagueti w1118;; P{sqh-GFP.RLC}</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#57145</td><td>La región de codificación sqh, que se marca en el extremo C-terminal con una etiqueta T:Avic\GFPS65T, se expresa bajo el control del promotor sqh natural.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ingredients for fly food media</td><td></td><td></td><td>Fly food media se elabora de acuerdo con procedimientos estándar (véase Greenspan, R. 1997. Empuje de moscas: la teoría y la práctica de la genética de Drosophila. Cold Spring Harbor Press. 1-191 págs.)</td></tr><tr><td>maíz</td><td>Wild Oats, Bristol, Reino Unido (o proveedor equivalente)</td><td>Contactar proveedor harina</td><td></td></tr><tr><td>de soja</td> orgánica directa <td>Wild Oats, Bristol, Reino Unido (o proveedor equivalente)</td><td>Contactar proveedor extracto directo</td><td></td></tr> de <tr><td>malta</td> orgánica <td>Wild Oats, Bristol, Reino Unido (o proveedor equivalente)</td><td>Contactar proveedor</td><td></td></tr><tr><td>melaza</td> orgánica directa <td>Wild Oats, Bristol, Reino Unido (o proveedor equivalente)</td><td>Contactar proveedor</td><td>directo orgánico</td></tr><tr><td>Difco agar</td><td>BD Biosciences, Fisher Scientific</td><td>DF0142-15-2</td><td>Para la preparación de alimento para moscas</td></tr><tr><td>Ácido propiónico</td><td>Sigma</td><td>402907</td><td>Para la preparación de alimento para moscas</td></tr><tr><td>Nipagen</td><td>Sigma</td><td>79721</td><td>Para la preparación de alimento para moscas</td></tr><tr><td>Levadura de panadería seca</td><td>Redstar, Dutscher Scientific, Reino Unido LTD</td><td>Redstar, Dutscher Scientific, Reino Unido Ltd</td><td>Para la preparación de comida para moscas</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte</td><td>><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Preparación y montaje de muestras</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>Para la preparación de pegamento de heptano</td></tr><tr><td>Sable fino pincel</td><td>Daler-Rowney (o equivalente)</td><td>#0 o 1</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fisher Scientific (o Fine Science Tools)</td><td>NC9404145</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio para la toma de imágenes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>Sugerimos utilizar placas de Petri de 35 mm, con al menos un micropocillo de 10 mm, 0,085-0,13 mm de vidrio de cubierta, sin recubrimiento. Las placas con micropocillos más grandes permitirán montar y obtener imágenes de un número cada vez mayor de pupas en un solo experimento.</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma</td><td>51730-5ML</td><td>Para la preparación de cola de heptano</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara (por ejemplo, Scotch)</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG263</td><td>Para la preparación de cola de heptano</td></tr><tr><td>Tubo de 50 ml (para cola de heptano)</td><td>Tubos Falcon de Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Para la preparación de cola de heptano</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio</td><td>Agar Scientific</td><td>AGL4244</td><td>Para la disección de Drosophila pupas</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección con campo claro</td><td>Leica (o equivalente)</td><td>M50</td><td>Para la disección de pupas Drosophila</td></tr><tr><td>Microtijeras</td><td>John Weiss International International</td><td>103123</td><td>Miniature Research Tijeras (rectas)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Ablation e imágenes con láser</td>Nitogenic ablation laser Spectra-Physics (o equivalente de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor)</td><td>Modelo VSL-337ND-S</td><td>Para herir, debe conectarse a un sistema de imágenes de campo amplio</td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal multiláser (CLSM)</td><td>Leica (o equivalente)</td><td>TCS AOBS SP8 o SP5-II conectado a un microscopio de epifluorescencia invertida Leica DMi8 (o equivalente)</td><td>Idealmente incluyendo una platina motorizada para el escaneo multisitio y de "mosaico", además de ' híbrido' Detectores de GaAsP (que ofrecen una sensibilidad mucho mayor y un aumento de la señal baja)Servicios de imagen de</td></tr> <tr><td>vida de la cámara ambiental</td><td>(o equivalente)</td><td>"Sistema de control de temperatura del microscopio"</td><td>Adjunto al microscopio confocal para el control de la temperatura durante la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td> Observaciones</td></tr><tr><td>Image Analysis Software Software</td>FRAP módulo de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>software</td><td>Leica (o equivalente)</td><td>CLSM Módulo de software FRAP</td><td>Para realizar la fotoconversión de fluoróforos fotoconvertibles como Kaede</td></tr><tr><td>ImageJ (software de análisis de imágenes)</td><td>Institutos Nacionales de Salud (NIH)</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td>Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 años de análisis de imágenes". Métodos de la Naturaleza 9, 671-675, 2012.</td></tr><tr><td>Complemento de ImageJ "Seguimiento manual"Institutos</td> <td>Nacionales de Salud (NIH)</td><td>https://imagej.net/Manual_Tracking</td><td></td></tr><tr><td>complemento de ImageJ "TrackMate"</td><td>ImageJ, NIH</td><td>https://imagej.net/TrackMate</td><td>Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: Una plataforma abierta y extensible para el seguimiento de una sola partícula", Métodos 115: 80-90, PMID 27713081</td></tr><tr><td>Volocity (software de imágenes 3D de alto rendimiento)</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Para el análisis de imágenes</td></tr><tr><td>IMARIS (software de análisis de imágenes)</td><td>Bitplane</td><td>IMARIS para biólogos celulares</td><td>Para el análisis de imágenes</td></tr></tbody></table>

seguimiento en vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de drosophila

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Durante la rápida respuesta inflamatoria al daño tisular, las células del sistema inmune innato son contratadas rápidamente al sitio de lesión. Una vez en la herida, las células inmunes innatas realizan una serie de funciones esenciales, tales como lucha contra la infección, claro ruina necrótica y estimular la deposición de la matriz. Para entender completamente los diversos eventos de señalización que regulan esta respuesta inmunitaria, es crucial observar comportamientos complejos de (y las interacciones que se producen entre) múltiples de la célula linajes en vivo y en tiempo real, con la alta resolución espacio-temporal. La transparencia óptica y la maleabilidad genética de embriones de Drosophila han establecido Drosophila como un modelo inestimable a imagen viva y diseccionan los aspectos fundamentales del comportamiento de células inflamatorias, incluyendo mecanismos de desarrollo dispersión, separación de cuerpos apoptóticos o patógenos microbianos y reclutamiento a las heridas. Sin embargo, el trabajo más reciente ha demostrado ahora que empleando una etapa mucho más adelante en el ciclo de vida de Drosophila , la Drosophila pupa – ofrece una serie de ventajas, incluyendo mayor eficiencia ARNi, larga períodos, la proyección de imagen y significativamente un mayor número de células inmunitarias. Aquí se describe un protocolo para la proyección de imagen reparación de herida y la respuesta inflamatoria asociada a la alta resolución espacio-temporal en vivo pupas de Drosophila . Para seguir la dinámica de la reepitelización y la inflamación, utilizamos un número de específico en vivo marcadores fluorescentes para el epitelio y las células inmunes innatas. También demostramos la eficacia de fluoróforos foto convertibles, como Kaede, para el seguimiento de los subconjuntos de la célula inmune específica, para el seguimiento de su comportamiento mientras migran y resolver, lesiones en el sitio de.

Este protocolo describe la preparación de Drosophila pupa viva imagen Time-lapse de herida inflamación y reparación en vivo. Usando este método, debe ser posible generar múltiples películas de alta resolución de cierre de herida pupal y reclutamiento de células inflamatorias con facilidad y las pupas durante largo períodos de tiempo (menos de 5 h) post hiriendo sin fotoblanqueo significativa de la imagen.
Un esquema general para la preparación de Drosophila pupa
La figura 1 ilustra el método óptimo para la preparación de pupas de Drosophila para imágenes en vivo . Drosophila blanco 'prepupas' se recogen en '0 h' después de la formación del pupario (APF), como las larvas reptantes Cesar motilidad y adoptan la forma de pupa estereotipada con evertido apéndices respiratorios (espiráculos) visibles en su extremo más anterior ( Figura 1A). El blanco 0 h prepupas APF se permitieron desarrollar durante 18 h a 25 ° C, cuando la mosca se ha convertido en marrón (figura 1B) y son entonces disecaron usando Pinzas finas o microscissors (figura 1, para quitar la envoltura pupal protectora) para revelar la ópticamente translúcido pupa dentro (figura 1). Después de la disección, las alas pupas será visibles en los laterales del tórax pupal (contorneado en color azul, figura 1-D). En esta etapa, otras partes del cuerpo pupa también están fácilmente discernibles, incluyendo los ojos, piernas y abdomen (marcada en la figura 1). Las piernas también son adecuadas para estudios de herida inflamación y pueden ser heridas utilizando el mismo método de láser descrito anteriormente. Múltiples 18 h pupas APF pueden montarse simultáneamente dentro del proyección de imagen plato (Figura 1E, usando pegamento de heptano y un papel de filtro empapado en agua para reducir al mínimo la deshidratación) con la parte más plana del reborde de ala (contorno azul) en contacto con el cubreobjetos ( Figura 1F); Esto es particularmente ventajoso si el microscopio de proyección de imagen está equipado con una platina motorizada para permitir varias pupas a grabar durante un único período de proyección de imagen. Deben desecharse cualquier pupas que han sido dañadas durante la disección o el montaje (por ejemplo, la pupa ubicado tercero en la secuencia, flecha en Figura 1E). Otras partes del cuerpo (por ejemplo, ojos y piernas, contorno rosa) también pueden comunicarse con el cubreobjetos y están disponibles para herir y posterior proyección de imagen (figura 1F). Para experimentos que estudian solo heridas, daños inducida por láser son generalmente mejor infligidos centralmente en el ala (asterisco, Figura 1F), aunque pueden utilizarse otras localizaciones múltiples heridas deban estudiarse.
Heridas estéril activa una respuesta inflamatoria robusta en el ala de Drosophila pupa
Para reparación de la herida y el acompañamiento respuesta inflamatoria in vivo, las alas heridas de pupas APF Drosophila 18 h se reflejada usando microscopia confocal de Time-lapse (figura 2A-H). En esta etapa pupal, el epitelio del ala es simples hojas planas de las células (marcadas aquí con GFP-tagged E-cadherin para marcar límites de la celda individual, margen del ala se indica en la figura 2A). Incluso en las alas unwounded (baja magnificación, figuras 2A y 2A'), gran número de células inmunes innatas migratorias (hemocitos, etiquetados con srp-Gal4 impulsado por GFP citoplásmico, verde y nuclear RFP, magenta) se encuentra en la hemolinfa ( sangre de insectos) ocupando el espacio extracelular interviene (figura 2A y 2A'). Lesión inducida por láser en el epitelio del ala pupa (margen de la herida en blanco, figura 2B-D) estimula una rápida migración de hemocitos en el sitio de la herida (figura 2B-D y núcleos de células inmunitarias en la figura 2B '-D'). Etiquetado los hemocitos con ambos un marcador nuclear (por ejemplo, la RFP nuclear 'rojo-stinger') en combinación con un marcador citoplásmico o citoesqueleto (e.g. GFP citoplásmica o GFP-tagged moesina) es particularmente ventajoso ya que permite la seguimiento simultáneo de núcleos hemocyte (para el análisis automatizado de hemocyte comportamiento por ejemplo migración velocidad y direccionalidad) y la visualización de la morfología hemocyte. Este último es importante ya que nos permite determinar si hemocitos son phagocytosing la ruina necrótica (figura 2, encarte) en el borde de la herida (o microbios en el caso de infección)12,23 y también nos permite seguir su comportamiento sobresaliente como se extiende filopodios finos o lamellipodia a su vanguardia como migran hacia o lejos de la herida.
Simple de seguimiento de trayectorias nuclear hemocyte utilizando el correspondiente software de análisis de imagen32 (Tabla de materiales) demuestra la compleja dinámica espacio-temporal de la respuesta inflamatoria, similar a ése divulgado previamente para herido de9,de embriones36 (pistas de varios colores, figura 2' y D'). Dentro de sólo 30 minutos de herir, hemocitos ubicados más cercano al sitio de lesión iniciar migración dirigida hacia la herida (figura 2'). Sin embargo, con el aumento de la lesión tiempo, hemocitos situados progresivamente más lejos el sitio de la lesión también comienzan migración dirigida hacia la herida (Figura 2D'). De esta manera, se observa una 'ola' de la respuesta inmune celular que se extiende hacia afuera desde el borde de la herida, que imaginamos para reflejar la difusión de la herida chemoattractant lejos del sitio de lesión. Esta dinámica espacio-temporal de la célula inmune proporciona un útil punto de partida para nuestro estudio recientes que emplean sofisticados análisis matemático modelado ('inferencia bayesiana') para deducir nuevas propiedades de la señal de atrayente de herida (métodos detallados Publicado en el23). Por calibrar nuestros modelos computacionales (que relaciona el gradiente atrayente de herida sesgo hemocyte) para ajustar las trayectorias observadas en vivo inmune, uno podría extraer características detalladas del atrayente herida de nuestra trayectoria hemocyte datos (por ejemplo, la tasa de difusión de la señal, la fuente y la duración de la producción de la señal)23.
Por otra parte, por expresión de fluoróforo photoconvertible Kaede dentro del linaje de células inmunitarias con srp-Gal4 (verde, Figura 2E) también hemos podido selectivamente etiqueta una subpoblación de estos hemocitos ala migratorias (como de conducción los reclutaron en el sitio de la herida; E, antes de photoconversion UV-inducida y F, post-photoconversion). Entonces podemos seguir el comportamiento de estos hemocitos con el tiempo (magenta, figura 2-H) como resolver lejos del sitio de la herida (flechas, figura 2 y H) y comparar cómo su comportamiento es diferente de los no-photoconverted células alcanzan el sitio de la lesión. Hemos utilizado este en vivo etiquetado técnica para demostrar que hemocitos reclutadas a un inicial de la herida son desensibilizar temporalmente a una segunda herida generada 90 minutos más tarde23, aunque esta técnica de etiquetado diferencial podría también tienen otras muchas aplicaciones interesantes en el futuro (ver discusión).
Usando este acercamiento, también al mismo tiempo podemos seguir la dinámica espacio-temporal de reparación de la herida o epithelialisation está ' (figura 2B-D). Aquí ubicuo GFP-tagged E-cadherin etiquetas a las uniones adherentes celular en el epitelio del ala y permite las formas de las células epiteliales individuales a seguir con el tiempo. El borde de la herida se identifica fácilmente como la unión entre células epiteliales intactas GFP marcado y escombros sin etiqueta (línea blanca punteada, figura 2B-D). Para la mayoría de las heridas, la herida comienza a volver a epithelialize dentro de 1 h de la lesión y la herida borde avances hacia el interior (Figura 2D); heridas de este tamaño se curan normalmente dentro de 2-3 h de lesión23. Cierre de herida en embriones y pupas es conducido por un cable contráctil actomyosin junto con vanguardia filopodia rica en actina23,37; esta dinámica del citoesqueleto puede visualizarse directamente durante la reparación de la herida usando apropiado en vivo reporteros, como calabaza de espagueti tagged GFP (cadena ligera reguladora del Myosin) o GFP-tagged actinia-que ata moesina23. Para algunas heridas particularmente grandes, sin embargo, el cable de actomyosin y filopodia de vanguardia no persisten - estas heridas se convierten en 'crónicas' y nunca totalmente volver a epithelialize23 incluso después de períodos mucho más prolongados (sobre 24 h) en vivo proyección de imagen. Curiosamente, la respuesta inflamatoria asociada con las heridas no cicatrizan es marcadamente diferente del asociado con heridas agudas normal23 sugiriendo que el comportamiento anormal de células inmune podría ser un marcador pronóstico útil en la clínica . En el futuro, más en vivo análisis de heridas crónicas usando proyección de imagen a largo plazo (más de 24 h) en el modelo de pupa pueden proporcionar importante visión mecanicista de esta condición debilitante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig1.jpg"> Figura 1: Drosophila pupa preparación hiriendo y proyección de imagen en vivo. (A) Drosophila prepupas blanco recogidos en 0 h APF, con extremo anterior indicado por evertido respiración apéndices (espiráculos). (B) después de subir prepupas APF blanco 0 h 18 h a 25 ° C, el pupario aparece marrón. Disección de la envoltura pupal debe comenzar en la región más anterior (flecha), indicada por los espiráculos evertidos como la pupa adecuada está ausente de esta región y pinzas finas o microscissors usado para quitar la funda protectora de la pupa (C). Las alas pupas será visibles en los laterales del tórax pupal (líneas azules). (D) envoltura pupal completamente extraídos 18 h pupa APF, aquí la pupa ha sido laminado en 90 ° para mostrar la parte lateral, con el ala a ser reflejada en azul. (E-F) Cinco pupas APF 18h montan sobre cubreobjetos de cristal dentro de plato usando pegamento de heptano, con papel de filtro empapado en agua para reducir al mínimo la deshidratación (E) la proyección de imagen. Pupa situado tercero en la secuencia (flecha) debe ser descartado como daño durante la preparación. Pupas se montan con la porción más plana del reborde de la ala (contorno azul) en contacto con el cubreobjetos (F) y heridas inducidas por láser son generadas centralmente en el ala (asterisco, F), aunque otros lugares pueden utilizarse si son heridas múltiples para ser estudiado. La imagen en (D) adaptada con permiso de tejedores et al., 201623. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig2.jpg"> Figura 2: Dinámica en vivo análisis de la respuesta inflamatoria al daño de tejido. Pupas de disección de casos de protección de pupas y montado sobre cubreobjetos de cristal (A) están heridos y posteriormente reflejada usando microscopia confocal de Time-lapse (B-H). Bajo la vista de la ampliación del ala pupa unwounded (A, margen del ala en blanco) que contiene gran número de hemocitos migratorias (A'). Lesión inducida por láser en el epitelio del ala pupa (B-D, límites de la celda etiquetadas usando GFP-etiquetado Drosophila cadherina; margen en blanco de la herida) activa una respuesta inflamatoria con la migración de múltiples hemocitos ( SRP-Gal4 impulsado por expresión de RFP nuclear, magenta o citoplasmática de la GFP, verde) hacia el sitio de la herida (B-D; representante de fotogramas de una película Time-lapse en el que cada fotograma es una proyección de 25 rebanadas 3 μm cada uno). Manual seguimiento de trayectorias hemocyte (pistas multicoloras, C' y D') indican la compleja dinámica espacio-temporal de la respuesta inflamatoria, similar al reportado para embriones heridos. Hemocitos también fagocitar detritos celulares necróticos en el sitio de la herida (punta de flecha, C y también de la inserción). Expresión de fluoróforo photoconvertible Kaede en el linaje de células inmunitarias (verde, E, con srp-Gal4) permite reclutó a herida hemocitos (flecha E) diferencialmente con la etiqueta (magenta, F) y seguido con el tiempo como que resolución desde el sitio de la lesión (flechas, G y H). Se utilizaron los siguientes genotipos pupas: (A, D) w1118; ubi-DE-cad-GFP, srp-Gal4 &gt; UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) y (E H) w1118; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Adaptados con permiso de tejedores et al., 201623imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí presentamos un protocolo para la reparación de herida de imágenes en vivo y la respuesta inflamatoria asociada a alta resolución espacio-temporal en vivo. Este método utiliza la etapa pupal de Drosophila desarrollo para permitir la proyección de imagen a largo plazo y seguimiento de poblaciones celulares específicas en el tiempo y es compatible con la inactivación del gene de RNAi-mediada eficiente.

Seguimiento en Vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de Drosophila

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Al explotar el potencial de imagen a largo plazo de este nuevo modelo de pupa, junto con la manejabilidad genética de Drosophila, este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en los campos de la cicatrización de heridas y la inmunidad innata. La etapa de pupa ofrece algunas ventajas distintivas para la obtención de imágenes en vivo en comparación con los modelos más tradicionales de curación de heridas de Drosophila. Por ejemplo, las pupas pueden ser fotografiadas durante períodos de tiempo mucho más largos, hay más área de tejido disponible para la manipulación experimental y hay más hemocitos presentes en esta etapa.Además, la eficiencia de la inactivación génica mediada por ARNi mejora considerablemente durante estas etapas de pupa, lo que permite que muchos genes sean eliminados de una manera específica para el tejido o el tiempo. Para montar la colección de pupas, se prepararon viales con 20 hembras vírgenes y 20 machos. Luego, 18 horas antes de la sesión de imágenes, recoja al menos 10 prepupas blancas recién formadas de los viales.Para recolectar una pupa, use fórceps o un pincel fino para desalojarla de la superficie interior del frasco y transfiérala con cuidado al lado de un nuevo frasco para moscas. Después de que las pupas se hayan desarrollado hasta el punto de tiempo deseado, transfiéralas a un trozo de cinta adhesiva de doble cara montado en un portaobjetos de vidrio. Ahora, bajo un microscopio de disección de campo claro, retire cuidadosamente las pupas de sus envolturas.Coloque las pupas de modo que sus lados ventrales estén firmemente pegados a la cinta. Realice la primera incisión en la región más anterior del pupario con las pinzas. Asegúrese de que la caja de la pupa en esta área sea hueca y desprovista de tejido de la pupa porque la pupa se habrá encogido dentro de la caja durante el desarrollo temprano de la pupa.A continuación, rasgue o corte con cuidado la caja de la pupa en dirección anterior a posterior con pinzas o microtijeras hasta que la pupa esté completamente libre de la cubierta marrón, opaca y quebradiza. Tenga cuidado, estas pupas son muy frágiles. Ahora es crucial que las pinzas y las microtijeras no perforen la superficie de la pupa durante este paso.Trata de evitar tocar la pupa mientras retiras la carcasa circundante. Ahora monte las pupas no dañadas en un plato con fondo de vidrio con pegamento heptano. Primero deposite una línea de cola de heptano preparada a partir de una alícuota de 10 microlitros.Luego, después de cinco segundos de secado, use pinzas para transferir cuidadosamente las pupas disecadas al pegamento. Cuando aprenda, alinee hasta cinco pupas. Se puede preparar más con la experiencia adquirida.Enrolle las pupas con pinzas para montarlas de modo que el ala quede plana sobre el cubreobjetos y la mayor parte de la superficie del ala esté en contacto directo con el cubreobjetos. Por último, para evitar la deshidratación, agregue un trozo de papel de filtro absorbente empapado en agua destilada al costado del plato con fondo de vidrio. A continuación, cubra el plato y proceda con el procedimiento de herida inducida por láser.Transfiera las pupas montadas a un microscopio de campo amplio equipado con un sistema de ablación láser sintonizable. Ajuste el láser de ablación bombeado con nitrógeno refrigerado por aire UV pulsado a la longitud de onda deseada utilizando la celda de tinte adecuada. Para un herido óptimo, ajuste la frecuencia de repetición del pulso a 40 hercios.Ahora, usando 40 o 63 veces los objetivos y el campo claro, ajuste los controles de la platina del microscopio para ubicar el ala de la pupa de la primera pupa que se hiere. Concéntrese en el plano del epitelio del ala de la pupa más cercano al cubreobjetos de vidrio. Alinee el área a herir con el área objetivo conocida del láser de ablación.Para ello, aproveche el marcador de retícula dentro del ocular del microscopio. A continuación, ajuste la potencia del láser ajustando el portaobjetos del atenuador de densidad de energía en el microscopio. Aproveche los topes de clic para hacer que el ajuste sea reproducible.Ahora, para hacer una herida, active el láser de ablación con un clic rápido de control manual. A continuación, compruebe la aparición de la burbuja de aire transitoria en el lugar de la ablación, lo cual es normal en las heridas. Si la herida no tiene éxito, intente variar el plano focal.Alternativamente, aumente gradualmente la potencia del láser utilizando el portaobjetos atenuador hasta alcanzar los tamaños de bobinado deseados. Después de enrollar los márgenes de las alas de la pupa, transfiera rápidamente el plato con fondo de vidrio a un microscopio apropiado para obtener imágenes de lapso de tiempo. A continuación, abra el software de captura de imágenes adecuado.En el software, encienda los láseres apropiados y ajuste su potencia y ganancia/compensación para obtener suficiente señal fluorescente sin saturación de píxeles. Por lo general, la potencia láser más baja posible en el rango de cinco a 20% funciona mejor para minimizar el fotoblanqueo. Concéntrese en todo el ala de la pupa con un aumento bajo o concéntrese en la herida con un aumento alto para investigar la reparación de la herida.Para capturar tanto el epitelio reparador como el reclutamiento de células inflamatorias, primero configure el microscopio para registrar una pila z utilizando el ajuste de enfoque fino en el panel de control. Exploración desde el epitelio herido hasta el espacio extracelular que contiene los hemocitos migratorios. A continuación, configure el software para que registre cortes en Z a través del ala de la pupa cada tres micras o a intervalos aún más estrictos.Para imágenes de lapso de tiempo, grabe pilas z al menos cada 30 segundos durante al menos una hora. Al utilizar las sondas fotoconvertibles para fotoconvertir y etiquetar selectivamente un subconjunto de células durante la obtención de imágenes, abra los módulos apropiados dentro del software de imagen para realizar la conversión fotográfica y activar el láser de 405 nanómetros. A continuación, seleccione las celdas que desea fotoconvertir dentro del software FRAP utilizando una herramienta de selección.A continuación, establezca el curso de tiempo para la conversión de fotos a un solo marco de iteración y configure el láser de 405 nanómetros al 20% de potencia láser. A continuación, haga clic en Iniciar el experimento para realizar la conversión de fotos. Una vez completado, salga del módulo FRAP y regrese a la pantalla de imágenes original.Allí sintoniza los láseres con los fluoróforos en uso y toma imágenes de las células foto-convertidas y no foto-convertidas utilizando grabaciones de lapso de tiempo. Las alas heridas de las pupas de Drosophila a las 18 horas después de la formación del pupario se fotografiaron mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. La lesión inducida por láser en el epitelio del ala de la pupa estimuló una rápida migración de células inmunitarias innatas de Drosophila llamadas hemocitos al sitio de la herida.Los hemocitos se marcaron con un marcador nuclear y un marcador citoplasmático o citoesquelético para permitir el seguimiento y la visualización de su morfología, respectivamente. El seguimiento de las trayectorias nucleares de los hemocitos demuestra la compleja dinámica espacio-temporal de la respuesta inflamatoria. A los 30 minutos de la herida, los hemocitos ubicados más cerca del sitio de la lesión han comenzado la migración dirigida hacia la herida.Eventualmente, los hemocitos ubicados progresivamente más lejos de la lesión comienzan a migrar hacia la herida. Mediante la utilización del fluoróforo convertible fotoconvertible, las subpoblaciones de Kaede de estos hemocitos de alas migratorias se marcaron selectivamente. Este método se ha utilizado para demostrar que los hemocitos reclutados para una herida inicial se desensibilizan temporalmente a una segunda herida generada 90 minutos después.Al marcar la E-cadherina dentro de las uniones celulares adherentes con GFP, el borde de la herida es fácilmente identificable y esto permite el análisis de la dinámica de cicatrización de la herida. La mayoría de las heridas comienzan a reepitelizarse dentro de una hora después de la lesión. El borde de la herida avanza hacia adentro y las heridas finalmente se curan en tres horas.Una vez que se ha dominado esta técnica, se pueden preparar múltiples pupas para obtener imágenes en vivo en solo 10 minutos, pero al intentar este procedimiento, es importante recordar que una vez diseccionadas de su caso de pupa, las pupas de Drosophila son extremadamente vulnerables al daño y la deshidratación. Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la inmunidad innata colaboren con biólogos computacionales y apliquen modelos matemáticos más sofisticados para explorar el comportamiento de las señales atrayentes de heridas que son responsables del reclutamiento de células inflamatorias. E incluso más recientemente, también se han etiquetado tipos de células alternativas para seguir su respuesta a las lesiones inducidas por el láser y esto ha revelado que las células de los adipocitos, las células del cuerpo graso de Drosophila, también responden a las heridas dentro de este sistema.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales...

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

El video demuestra el uso de la fotoconversión para estudiar la dinámica celular inflamatoria en pupas de Drosophila. Los hemocitos verdes son atraídos hacia el epitelio herido, seguido de una migración distante. La fotoconversión cambia ciertos hemocitos de verde a rojo, lo que facilita su seguimiento de movimiento.

La técnica de fotoconversión para explorar la dinámica de las células inflamatorias en pupas de insectos

En este trabajo se demuestra el uso de un microscopio confocal de barrido rápido de comportamiento de las células de imagen directamente a través de la pupa. Al dejar el caso de pupa intacta, este método permite la observación y medición de los procesos dinámicos de célula en una etapa de desarrollo de Drosophila que es difícil de estudiar directamente.

Imaging A través de la envoltura pupal de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

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Este protocolo describe un método detallado para el cultivo a largo plazo ex vivo y de formación de imágenes en vivo de un disco imaginal Drosophila. Esto demuestra la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial dentro del período de 10 horas de imágenes en vivo del ojo de disco. El protocolo es simple y no requiere instalación costosa.

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Aquí, presentamos un protocolo para la visualización, detección, análisis y seguimiento del tráfico endógeno de ARNm en cámara de óvulos Drosophila melanogaster en vivo utilizando balizas moleculares, microscopía confocal de disco giratorio y análisis de código abierto Software.

Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo Drosophila melanogaster en vivo

Este protocolo está diseñado para la toma de imágenes y el análisis de la dinámica de la orientación celular y el crecimiento del tejido en la drosophila epitelia abdominal a medida que la mosca de la fruta sufre metamorfosis. La metodología descrita aquí se puede aplicar al estudio de diferentes etapas del desarrollo, tejidos y estructuras subcelulares en Drosophila u otros organismos modelo.

Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales

Aquí, se presenta un protocolo para la obtención de imágenes en vivo a largo plazo de la pata de Drosophila durante la etapa de pupa, que implica la eliminación completa del pupario. Este protocolo también se puede aplicar a otros tejidos.

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Aprende a realizar imagen en vivo de larga duración en pupas de Drosophila para estudiar la respuesta inflamatoria y la migración de hemocitos hacia heridas. Este método permite analizar la inmunidad innata y la cicatrización tisular con alta resolución.

Seguimiento en Vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de Drosophila

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