Seguimiento en Vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de Drosophila

Al explotar el potencial de imagen a largo plazo de este nuevo modelo de pupa, junto con la manejabilidad genética de Drosophila, este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en los campos de la cicatrización de heridas y la inmunidad innata. La etapa de pupa ofrece algunas ventajas distintivas para la obtención de imágenes en vivo en comparación con los modelos más tradicionales de curación de heridas de Drosophila. Por ejemplo, las pupas pueden ser fotografiadas durante períodos de tiempo mucho más largos, hay más área de tejido disponible para la manipulación experimental y hay más hemocitos presentes en esta etapa.

Además, la eficiencia de la inactivación génica mediada por ARNi mejora considerablemente durante estas etapas de pupa, lo que permite que muchos genes sean eliminados de una manera específica para el tejido o el tiempo. Para montar la colección de pupas, se prepararon viales con 20 hembras vírgenes y 20 machos. Luego, 18 horas antes de la sesión de imágenes, recoja al menos 10 prepupas blancas recién formadas de los viales.

Para recolectar una pupa, use fórceps o un pincel fino para desalojarla de la superficie interior del frasco y transfiérala con cuidado al lado de un nuevo frasco para moscas. Después de que las pupas se hayan desarrollado hasta el punto de tiempo deseado, transfiéralas a un trozo de cinta adhesiva de doble cara montado en un portaobjetos de vidrio. Ahora, bajo un microscopio de disección de campo claro, retire cuidadosamente las pupas de sus envolturas.

Coloque las pupas de modo que sus lados ventrales estén firmemente pegados a la cinta. Realice la primera incisión en la región más anterior del pupario con las pinzas. Asegúrese de que la caja de la pupa en esta área sea hueca y desprovista de tejido de la pupa porque la pupa se habrá encogido dentro de la caja durante el desarrollo temprano de la pupa.

A continuación, rasgue o corte con cuidado la caja de la pupa en dirección anterior a posterior con pinzas o microtijeras hasta que la pupa esté completamente libre de la cubierta marrón, opaca y quebradiza. Tenga cuidado, estas pupas son muy frágiles. Ahora es crucial que las pinzas y las microtijeras no perforen la superficie de la pupa durante este paso.

Trata de evitar tocar la pupa mientras retiras la carcasa circundante. Ahora monte las pupas no dañadas en un plato con fondo de vidrio con pegamento heptano. Primero deposite una línea de cola de heptano preparada a partir de una alícuota de 10 microlitros.

Luego, después de cinco segundos de secado, use pinzas para transferir cuidadosamente las pupas disecadas al pegamento. Cuando aprenda, alinee hasta cinco pupas. Se puede preparar más con la experiencia adquirida.

Enrolle las pupas con pinzas para montarlas de modo que el ala quede plana sobre el cubreobjetos y la mayor parte de la superficie del ala esté en contacto directo con el cubreobjetos. Por último, para evitar la deshidratación, agregue un trozo de papel de filtro absorbente empapado en agua destilada al costado del plato con fondo de vidrio. A continuación, cubra el plato y proceda con el procedimiento de herida inducida por láser.

Transfiera las pupas montadas a un microscopio de campo amplio equipado con un sistema de ablación láser sintonizable. Ajuste el láser de ablación bombeado con nitrógeno refrigerado por aire UV pulsado a la longitud de onda deseada utilizando la celda de tinte adecuada. Para un herido óptimo, ajuste la frecuencia de repetición del pulso a 40 hercios.

Ahora, usando 40 o 63 veces los objetivos y el campo claro, ajuste los controles de la platina del microscopio para ubicar el ala de la pupa de la primera pupa que se hiere. Concéntrese en el plano del epitelio del ala de la pupa más cercano al cubreobjetos de vidrio. Alinee el área a herir con el área objetivo conocida del láser de ablación.

Para ello, aproveche el marcador de retícula dentro del ocular del microscopio. A continuación, ajuste la potencia del láser ajustando el portaobjetos del atenuador de densidad de energía en el microscopio. Aproveche los topes de clic para hacer que el ajuste sea reproducible.

Ahora, para hacer una herida, active el láser de ablación con un clic rápido de control manual. A continuación, compruebe la aparición de la burbuja de aire transitoria en el lugar de la ablación, lo cual es normal en las heridas. Si la herida no tiene éxito, intente variar el plano focal.

Alternativamente, aumente gradualmente la potencia del láser utilizando el portaobjetos atenuador hasta alcanzar los tamaños de bobinado deseados. Después de enrollar los márgenes de las alas de la pupa, transfiera rápidamente el plato con fondo de vidrio a un microscopio apropiado para obtener imágenes de lapso de tiempo. A continuación, abra el software de captura de imágenes adecuado.

En el software, encienda los láseres apropiados y ajuste su potencia y ganancia/compensación para obtener suficiente señal fluorescente sin saturación de píxeles. Por lo general, la potencia láser más baja posible en el rango de cinco a 20% funciona mejor para minimizar el fotoblanqueo. Concéntrese en todo el ala de la pupa con un aumento bajo o concéntrese en la herida con un aumento alto para investigar la reparación de la herida.

Para capturar tanto el epitelio reparador como el reclutamiento de células inflamatorias, primero configure el microscopio para registrar una pila z utilizando el ajuste de enfoque fino en el panel de control. Exploración desde el epitelio herido hasta el espacio extracelular que contiene los hemocitos migratorios. A continuación, configure el software para que registre cortes en Z a través del ala de la pupa cada tres micras o a intervalos aún más estrictos.

Para imágenes de lapso de tiempo, grabe pilas z al menos cada 30 segundos durante al menos una hora. Al utilizar las sondas fotoconvertibles para fotoconvertir y etiquetar selectivamente un subconjunto de células durante la obtención de imágenes, abra los módulos apropiados dentro del software de imagen para realizar la conversión fotográfica y activar el láser de 405 nanómetros. A continuación, seleccione las celdas que desea fotoconvertir dentro del software FRAP utilizando una herramienta de selección.

A continuación, establezca el curso de tiempo para la conversión de fotos a un solo marco de iteración y configure el láser de 405 nanómetros al 20% de potencia láser. A continuación, haga clic en Iniciar el experimento para realizar la conversión de fotos. Una vez completado, salga del módulo FRAP y regrese a la pantalla de imágenes original.

Allí sintoniza los láseres con los fluoróforos en uso y toma imágenes de las células foto-convertidas y no foto-convertidas utilizando grabaciones de lapso de tiempo. Las alas heridas de las pupas de Drosophila a las 18 horas después de la formación del pupario se fotografiaron mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. La lesión inducida por láser en el epitelio del ala de la pupa estimuló una rápida migración de células inmunitarias innatas de Drosophila llamadas hemocitos al sitio de la herida.

Los hemocitos se marcaron con un marcador nuclear y un marcador citoplasmático o citoesquelético para permitir el seguimiento y la visualización de su morfología, respectivamente. El seguimiento de las trayectorias nucleares de los hemocitos demuestra la compleja dinámica espacio-temporal de la respuesta inflamatoria. A los 30 minutos de la herida, los hemocitos ubicados más cerca del sitio de la lesión han comenzado la migración dirigida hacia la herida.

Eventualmente, los hemocitos ubicados progresivamente más lejos de la lesión comienzan a migrar hacia la herida. Mediante la utilización del fluoróforo convertible fotoconvertible, las subpoblaciones de Kaede de estos hemocitos de alas migratorias se marcaron selectivamente. Este método se ha utilizado para demostrar que los hemocitos reclutados para una herida inicial se desensibilizan temporalmente a una segunda herida generada 90 minutos después.

Al marcar la E-cadherina dentro de las uniones celulares adherentes con GFP, el borde de la herida es fácilmente identificable y esto permite el análisis de la dinámica de cicatrización de la herida. La mayoría de las heridas comienzan a reepitelizarse dentro de una hora después de la lesión. El borde de la herida avanza hacia adentro y las heridas finalmente se curan en tres horas.

Una vez que se ha dominado esta técnica, se pueden preparar múltiples pupas para obtener imágenes en vivo en solo 10 minutos, pero al intentar este procedimiento, es importante recordar que una vez diseccionadas de su caso de pupa, las pupas de Drosophila son extremadamente vulnerables al daño y la deshidratación. Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la inmunidad innata colaboren con biólogos computacionales y apliquen modelos matemáticos más sofisticados para explorar el comportamiento de las señales atrayentes de heridas que son responsables del reclutamiento de células inflamatorias. E incluso más recientemente, también se han etiquetado tipos de células alternativas para seguir su respuesta a las lesiones inducidas por el láser y esto ha revelado que las células de los adipocitos, las células del cuerpo graso de Drosophila, también responden a las heridas dentro de este sistema.