In Vitro Cría de las abejas solitarias: una herramienta para evaluar factores de riesgo larvas

Pulverizaciones de fungicidas en plantas con flores pueden exponer a las abejas solitarias a altas concentraciones de residuos de fungicida transmitidas por el polen. Mediante experimentos en laboratorio en vitro-larvas de abeja criados, este estudio investiga los efectos interactivos de consumir polen tratados con fungicida derivado de plantas huésped y anfitrión no.

Las especies de abejas solitarias representan el grupo más diverso de abejas en el planeta, pero puede ser bastante difícil criar con éxito las larvas en condiciones altamente controladas. Hemos creado un método para el cultivo in vitro de especies de abejas solitarias, que nos permite aislar y medir los factores de riesgo asociados a sus simbiontes microbianos. Entre ciertas especies de abejas solitarias que anidan en el tallo, es fundamental que las técnicas de cultivo se adapten a las larvas jóvenes, así como a sus simbiontes microbianos nacidos en el polen.

Aquí hemos iluminado los efectos principales e interactivos de múltiples factores estresantes, lo que nos permite discernir si los factores estresantes actúan en gran medida solos o en conjunto. Molly Bidwell y Prarthana Dharampal, ambas de mi laboratorio, harán la demostración del procedimiento. Con un bisturí esterilizado, diseccione las cañas de anidación de Osmia recién tapadas.

Divida las cañas en dos partes a lo largo para exponer las cámaras individuales. Los nidos suelen contener de ocho a 14 cámaras con un huevo por cámara. Identifique los huevos machos utilizando el método estándar.

En este experimento solo se utilizan huevos machos debido al sesgo sexual en el tamaño de la provisión de polen. Las provisiones masculinas suelen ser más pequeñas que las femeninas. Luego, con un instrumento esterilizado, retire cada provisión de polen junto con el huevo asociado y colóquelos en un bote de pesaje limpio.

En el bote de pesaje, separe suavemente el huevo de la provisión. A continuación, pesa el suministro de polen y el huevo por separado. Trabaja rápidamente con los huevos de Osmia para minimizar su tiempo fuera del polen.

Para las preparaciones de provisión de polen del huésped, primero inspeccione visualmente el polen de la planta huésped recolectado por la madre y excavado de las cámaras de anidación en busca de parásitos. Luego, para reducir cualquier posible sesgo materno, combine las provisiones de polen en una sola masa y mézclelas con una aguja esterilizada. A continuación, divida el polen del huésped en nuevas provisiones de masa estándar.

Para preparar provisiones de polen de plantas no hospederas, pulverize el polen recolectado por abejas melíferas comprado comercialmente hasta convertirlo en un polvo fino utilizando un molino de huesos de laboratorio estándar. Luego, en función del contenido de humedad de las provisiones de polen del huésped, hidrate el polvo de polen con una solución de azúcar esterilizada al 40%. Mezcle esto hasta obtener una consistencia similar a una masa.

A continuación, haga provisiones de polen no huésped que tengan el mismo peso que las provisiones recolectadas por la madre. Para la placa de tratamiento, cubra los pocillos individuales de una placa de cultivo de 48 pocillos con tazas de estaño esterilizadas en autoclave. Prepare placas separadas para los grupos de tratamiento y control.

Luego, con pinzas estériles, ensanchar suavemente el borde superior de las copas para que puedan acomodar la provisión de polen. A continuación, cargue provisiones individuales de polen en las tazas de hojalata. Ahora, dentro de cada masa de polen, haga una depresión colocada en el centro con un palo de madera estéril.

Use un palo nuevo para cada suministro de polen. En la depresión, agregue los volúmenes apropiados de solución de tratamiento, como fungicida y agua estéril para los controles. Después de cada adición, apriete la depresión para cerrarla con pinzas estériles limpias.

Para comenzar, cargue bien cada placa de tratamiento con un óvulo macho seleccionado al azar. Colóquelo encima de la provisión de polen con un pincel fino y limpio. Una vez que se hayan colocado los huevos, asegure la tapa en el plato con cinta adhesiva en las esquinas.

Luego, coloque cada plato preparado en una incubadora que se mantenga a temperatura ambiente. Incluya una placa de seis pocillos cargada con agua estéril para evitar la desecación. Deje las placas intactas dentro de la incubadora.

Revise la placa diariamente bajo un microscopio de disección sin quitar la tapa. Si las larvas están vivas, se moverán. Si no se detecta ningún movimiento, deseche la taza de hojalata que contiene las larvas muertas y el resto de la provisión de polen.

Cuando una larva alcance la etapa de prepupa, retírela de la taza de hojalata y use un cepillo para limpiar los excrementos del capullo de seda. Luego, usando un microscopio de disección, corte cuidadosamente a través del capullo de seda y extraiga la prepupa con pinzas de peso pluma. Manipula la prepupa con cuidado para evitar cualquier daño a su cuerpo.

Ahora registre la masa de la prepupa y el tiempo de desarrollo desde el huevo hasta la etapa de prepupa. La aptitud larvaria se cuantificó utilizando el tiempo de desarrollo larvario y la biomasa prepupal. Hubo una correlación negativa significativa entre el tiempo de desarrollo larvario y la biomasa prepupal entre los grupos tratados con fungicidas y no tratados.

Aunque hubo una correlación negativa significativa para las larvas criadas con polen de no hospedador, no se observó tal relación para las larvas criadas con polen de hospedador. La fuente de polen tuvo un efecto principal significativo en la aptitud de las abejas. Cuando se criaron en polen no huésped, el tiempo de desarrollo de las larvas aumentó significativamente, mientras que la biomasa de prepupa disminuyó significativamente entre los grupos tratados con fungicidas y no tratados en comparación con las larvas criadas con polen huésped.

La exposición a fungicidas no tuvo un efecto principal significativo sobre la aptitud física. No hubo diferencias estadísticamente significativas en el tiempo de desarrollo y la biomasa de prepupa para los tratamientos criados en polen del huésped y del no huésped en los grupos tratados con fungicidas y no tratados. No hubo un efecto interactivo significativo de la exposición a fungicidas y la fuente de polen sobre el tiempo de desarrollo de las larvas y la biomasa de prepupa.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo criar con éxito larvas de abejas solitarias en condiciones in vitro. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para criar abejas en condiciones in vitro desde el huevo hasta la etapa de pupa, al tiempo que causa una mortalidad mínima por estrés de manipulación. Al usar este procedimiento, es importante recordar usar huevos o larvas muy jóvenes.

Esto asegura que las larvas se críen casi en su totalidad con la manipulación prevista de los tratamientos dietéticos. Este protocolo puede extenderse a varias otras especies de abejas y avispas solitarias y puede modificarse fácilmente para probar los efectos principales e interactivos de múltiples factores de riesgo que afectan la salud de los polinizadores. Al proporcionar un medio para el cultivo in vitro de larvas de abejas solitarias, esta técnica puede ayudar a identificar factores de riesgo previamente desconocidos entre las poblaciones de abejas vulnerables.

Por ejemplo, algunos de sus experimentos basados en este protocolo pueden ayudar a determinar el papel del microbioma del polen en la conferir diversos grados de resistencia a los factores estresantes de los xenobióticos. Como técnica accesible y económica, este protocolo representa una herramienta versátil para la prueba de hipótesis que puede ser fácilmente modificada por los investigadores para abordar sus propios objetivos de investigación.