Name: Aislamiento rápido de la Mitoribosome de las células HEK (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende a aislar mitorribosomas de células HEK mediante cavitación con nitrógeno para estudios estructurales. Este método eficiente permite obtener preparaciones de alta calidad para investigar la síntesis de proteínas mitocondriales.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación sueca para la investigación estratégica (futuro líderes Grant FFL15:0325), Ragnar Söderberg Fundación (beca en medicina M44/16), Consejo de investigación sueco (Starting Grant NT × 2015-04107), FEBS a largo plazo beca (SA) , Proyecto H2020-MSCA-ITN-2016 721757 (VS).

Todo trabajo de cultivo de células de mamífero debe realizarse dentro de un gabinete de seguridad biológica. Utilizar equipo estéril si contacto con las células. Usar guantes de nitrilo y una bata de laboratorio y la práctica de la buena cultura de tejido.
1. cultivo celular
<ol><li>Mantener las células HEK293S suspensión en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal libre de tetraciclina (FBS), 5 μg/mL blasticidin y azitromicina, de 200 μg/mL a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Escala hasta 9 frascos de x T175. En el 90% de confluencia, las células de la cosecha y los hace girar hacia abajo a 500 x g durante 5 min resuspender las células sedimentadas en Freestyl suplementado con 5% FBS libre de tetraciclina. Contar las células usando un contador de células automatizado y ajustar la concentración celular de 1.5 x 106 células/mL en un matraz de agitación ventilado. Nota: Normalmente esto corresponderá a un volumen a partir de 300 mL en un matraz de 1.000 mL con ventilación.</li>
	<li>Incubar las células en un incubador de agitación a 37 ° C y 5% de CO2 a 120 rpm (agitación de 50 mm de diámetro).</li>
	<li>Después de 2 días, contar las células y proceder a dividir las celdas si la densidad celular está por encima de 3.0 x 106 células/mL. Dividir las celdas girando por cultivo celular de 2 x 150 mL en botellas cónicas 2 x 250 mL a 500 g durante 5 min Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos en medios frescos 2 x 10 mL y transferir a un 2 x 1, 000 mL frascos ventilados que contiene el volumen adecuado para una densidad final de la célula de 1.5 x 106 células/mL, por ejemplo, 2 x 300 mL de una densidad celular inicial de 3.0 x 106 células/mL.</li>
	<li>Incubar las células en un incubador de agitación a 37 ° C y 5% de CO2 a 120 rpm (agitación de 50 mm de diámetro).</li>
	<li>Después de dos días, contar las células y proceder a dividir las celdas si la densidad celular está por encima de 3.0 x 106 células/mL. División de las células por giro por cultivo celular de 4 x 150 mL en botellas cónico 4 x 250 mL a 500 g durante 5 min resuspender las células en medios frescos 2 x 10 mL y transferir a matraz de ventilación de 2 x 2.000 mL que contiene el volumen adecuado para una densidad de célula final de 1,5 x 106 células/mL, por ejemplo 2 x 700 mL de una densidad celular inicial de 3.0 x 106 células/mL.</li>
	<li>Incubar las células en un incubador de agitación a 37 ° C y 5% de CO2 a 120 rpm (agitación de 50 mm de diámetro).</li>
	<li>Después de dos días, contar las células y proceder a dividir las celdas si la densidad celular está por encima de 3.0 x 106 células/mL. Dividir las células vertiendo 2 x 700 mL cultivo celular en 2 x 2800 mL ventilación frascos y rellenado con medios frescos 2 x 300 mL para alcanzar un volumen de 2 x 1 L.</li>
	<li>Incubar las células en un incubador de agitación a 37° C y 5% de CO2 a 120 rpm (agitación de 50 mm de diámetro).</li>
	<li>Después de 24 h cuentan las células y las células de la cosecha si la densidad celular es entre 3.0-4.0 x 106 células/mL.</li>
</ol>2. las mitocondrias aislamiento
<ol><li>Almacenadores intermediarios necesarios Nota: Las cantidades se dan para una preparación de células de 2 L. Preparar las siguientes soluciones stock antes de tiempo para buffer de aislamiento mitocondrial (MIB), buffer de sacarosa/manitol (SM4), tampón experimental (MIBSM), buffer de resuspensión (SEM).<ol>
<li>Hacer 0,5 L de tampón de MIB: 50mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1.5mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM TDT, inhibidores de la proteasa.</li>
		<li>Hacer 100 mL SM4 de tampón: 280 mM sacarosa, manitol 840 mM, 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 m M TDT, inhibidores de la proteasa.</li>
		<li>Hacer 160 mL MIBSM tampón: tampón MIB 120 mL + 40 mL SM4 de tampón.</li>
		<li>Almacenar 200 mL PBS a 4 ° C.</li>
		<li>Hacer SEM de 5 mL de tampón: sacarosa 250 mM, 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 mM EDTA.</li>
		<li>Soluciones stock de 4 x 10 mL para el gradiente de sacarosa paso a paso que contiene 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 mM EDTA y 60% / 32% 23% y el 15% de sacarosa, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislamiento de las mitocondrias Nota: Es importante trabajar rápidamente y guardar todo en el hielo durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Preenfriar el nitrógeno cavitación cámara antes de usarla.<ol>
<li>Cosechar las células L de 2 x 1 (3-4 x 109 células por tubo de centrífuga) por centrifugación a 1.000 x g por 7 min, 4 ° C.</li>
		<li>Decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender las células pildoradas rápidamente en 2 x 100 mL PBS. Las células de la piscina.</li>
		<li>Centrifugar las células resuspendidas en 1.200 x g durante 10 min, 4 ° C.</li>
		<li>Decantar cuidadosamente el sobrenadante y pese el precipitado (~ 20 g).</li>
		<li>Resuspender el precipitado en 120 mL de tampón de MIB.</li>
		<li>Permitir que las células se hinchan agitando suavemente en una cámara fría durante 10 minutos.</li>
		<li>Coloque la cámara de cavitación de nitrógeno sobre el hielo y transferir las células hinchadas a la cámara de cavitación de nitrógeno. Agregar 45 mL SM4 de tampón (1/3 del volumen final de células resuspendidos, 140 mL, dando una concentración final de manitol de sacarosa y 210 mM de 70 mM).</li>
		<li>Sujete la cámara de cavitación de nitrógeno y se llenan de nitrógeno hasta que la presión alcanza 500 psi. Cerrar grifos y mantener aislado en hielo por 20 min.</li>
		<li>Liberar la presión en la cámara de cavitación de nitrógeno lentamente y recoger el lisado (aproximadamente 185 mL).</li>
		<li>Centrifugar el material sometidas a lisis para eliminar los restos celulares y núcleos a 800 x g durante 15 min, 4 ° C.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante, vertiendo a través de la gasa en un vaso de precipitados se mantuvo en hielo. Deseche los pellets.</li>
		<li>Resuspender el precipitado en tampón MIBSM de 90 mL (1/2 el volumen anterior). Homogeneizar con homogenizador de vidrio Teflon Dounce y repita la centrifugación a 800 x g durante 15 min, 4 ° C.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante, vertiendo a través de la gasa en un vaso de precipitados se mantuvo en hielo. Combinar este sobrenadante con el sobrenadante del paso 2.2.11.</li>
		<li>Centrifugar el sobrenadante combinado a 1.000 x g durante 15 min, 4 ° C.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante, vertiendo a través de la gasa en un vaso de precipitados se mantuvo en hielo.</li>
		<li>Deseche los pellets y centrifugar el sobrenadante que contiene mitocondrias crudas a 10.000 x g durante 15 min, 4 ° C. Nota: La pastilla normalmente consistirá en dos partes: flojo y apretado.</li>
		<li>Lavar cuidadosamente el sedimento suelto sin molestar a la parte estrecha. Resuspender el precipitado apretado en 10 mL de tampón de MIBSM.</li>
		<li>Realizar un análisis de la concentración de proteína usando un Kit comercial de ensayo de proteína o método similar. Concentración típicos rendimientos de 2 L a partir de la cultura son ~ 2 mg/mL.</li>
		<li>Agregar 200 unidades de Rnasa DNasa libre y dejar que gire en un rodillo en el cuarto frío por 20 minutos mezclar uniformemente la ADNasa para la extracción de la DNA genomic.</li>
		<li>Centrifugar a 10.000 x g durante 15 min, 4 ° C y resuspender el precipitado en 2 mL SEM de tampón. Homogeneizar suavemente utilizando un homogeneizador de vidrio Teflon Dounce pequeño para suspender cualquier agregados restantes. Realizar no más de cinco pasos arriba y abajo para evitar la rotura. Mantener en hielo.</li>
		<li>Para preparar el gradiente de sacarosa en 14 mL SW40 tubos cuidadosamente Pipetear 1,5 mL de tampón stock de 60% de sacarosa en la parte inferior del tubo. Con cuidado agregar 4,5 mL de la solución stock de sacarosa de 32% sobre la banda de 60% sin perturbarla. Repita con 1,5 mL de tampón stock 23% de sacarosa y otra vez con 1,5 mL de tampón stock 15% de sacarosa.</li>
		<li>Cargar la suspensión mitocondrial entera (aproximadamente 3 mL) en la parte superior del gradiente de sacarosa.</li>
		<li>Centrifugue en rotor SW40 en 139, 065 x g durante 60 minutos.</li>
		<li>Recoger cuidadosamente la banda marrón a la interfaz de 32% y el 60% de sacarosa utilizando una pipeta de transferencia, normalmente 2-3 mL.</li>
		<li>Las mitocondrias purificadas Snap-congelación en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Mitoribosome preparación
<ol><li>Almacenadores intermediarios necesarios Nota: Preparar las siguientes soluciones stock anticipación de tampón de lisis, amortiguador/gradiente de sacarosa y buffer de resuspensión.<ol>
<li>Tomar 10 mL de tampón de lisis: 25 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM KCl, 50mM MgOAc, 2% polietilenglicol éter de Octylpheny, 2 mM DTT, inhibidores de la proteasa.</li>
		<li>Tomar 10 mL del tampón de amortiguador de la sacarosa: sacarosa de 1 M (34% w/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM KCl, 20 mM MgOAc, 1% polietilenglicol éter de Octylpheny, 2 mM TDT.</li>
		<li>Tomar 5 mL de tampón de resuspensión: 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM KCl, 20mM MgOAc, 2 mM TDT</li>
		<li>Hacer 15% - 30% gradientes de sacarosa lineal con buffer de resuspensión en TLS-55 tubos de policarbonato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mitoribosome purificación<ol>
<li>Se descongelan las mitocondrias congeladas en el hielo.</li>
		<li>Añadir 2 volúmenes de la solución de lisis,por ejemplo, agregar 6 mL de tampón de lisis a las mitocondrias de 3 mL. Mezclar inmediatamente por inversión del tubo varias veces.</li>
		<li>Homogeneizar con un pequeño vidrio Teflon dounce homogeneizador para ayudar a la lisis e incube durante 5-10 min en hielo para completar la lisis.</li>
		<li>Centrifugar el material sometidas a lisis (aproximadamente 9 mL) a 30.000 x g por 20 min, 4 ° C para eliminar el material insoluble. Decantar el sobrenadante cuidadosamente de la pelotilla y descartar el precipitado.</li>
		<li>Repetir la centrifugación a 30.000 x g por 20 min a 4 ° C para aclaración del sobrenadante. Decantar el sobrenadante cuidadosamente de la pelotilla y descartar el precipitado.</li>
		<li>Preparar el colchón de sacarosa en TLA 120.2 tubos (muy claros): colchón de sacarosa 0,4 mL por tubo. Preparar un tubo de material sometidas a lisis por mL.</li>
		<li>Capa de mitocondrias sometidas a lisis en los cojines de la sacarosa: aproximadamente 1 mL por tubo, dando por resultado un lisado: cociente del cojín del 2.5:1.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 231, 550 x g durante 45 minutos en el rotor TLA120.2 a 4 ° C.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y lavar los tubos secuencialmente con 100 μl del buffer de resuspensión para extraer la sacarosa residual.</li>
		<li>Resuspender el pellet en total 100 μl de tampón de resuspensión.</li>
		<li>Vórtice en baja velocidad por 30 s para disolver los agregados restantes y centrifugue a 17.949 x g por 10 min en microtubo centrifugar a 4 ° C.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante y repetir la centrifugación.</li>
		<li>Medir la absorción de mitoribosome en A260. Nota: El rendimiento típico es 7 A260, con A260: unratio de280 de 1.3.</li>
		<li>Toda la muestra en un tubo de gradiente de sacarosa lineal único de carga. Centrífuga de rotor TLS-55 en el 213, 626 x g durante 120 min a 4 ° C.</li>
		<li>Fraccionar el gradiente, determinar la densidad óptica a260 de la Ay la fracción correspondiente al pico de ácido nucleico a la piscina. Nota: La Atípica260: es unratio de280 del pico > 1.6.</li>
		<li>Intercambiar el buffer si es necesario, utilizando un método de elección. Calcular la concentración final utilizando la conversión 1 A260 = 0.1 mg/mL.</li>
		<li>Snap freeze la muestra purificada mitoribosome en el buffer de resuspensión y conservar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Con respecto a la fuente de material, de partida aunque la relativamente fácil disponibilidad de los tejidos animales que se sabe que son una fuente rica en mitocondrias, es una opción popular para mitoribosomes3,5,12, 13, no puede ser genéticamente modificados y reproducidos fácilmente en el laboratorio. Por lo tanto, hay una necesidad clara práctica para el desarrollo de protocolos que implican líneas de células humanas cultivadas homogéneo. La principal diferencia entre los protocolos de ocuparse de los tejidos y células cultivadas es el modo de lisis y homogeneización. Para las células cultivadas que se cultiva como una monocapa, un método típico es vidrio Teflon dounce homogeneización14. Los protocolos de preparación original mientras que eficiente fueron desarrollados para pequeñas escalas15. Una ampliación directa utilizando un homogenizador con capacidad de 500 mL es posible11, sin embargo, se requiere ~ 2 h de mano de obra para lograr la lisis del 80%. Esto introdujo por lo menos tres cuestiones: agregación de orgánulos debido a largos tiempos de espera, lisis no homogéneo debido a material pesado que se hunde hasta el fondo de un vaso grande, calefacción de la muestra debido a la necesidad de múltiples golpes. Por lo tanto, un método preferible de lisis utiliza cavitación de nitrógeno, que se basa en la descompresión de un recipiente a presión16,17. En este método, las células primero se hinchó en la cámara fría para ablandar las células y hacerlas más susceptibles a la lisis. Como se colocan en el aparato de cavitación de nitrógeno se añade un tampón que contiene sacarosa y manitol para mantener una presión osmótica que ayudará a mantener las mitocondrias intactas. El aparato de cavitación de nitrógeno presurizado entonces con un gran volumen de nitrógeno libre de oxígeno, que se disuelve en las células. Como la presión de las burbujas de nitrógeno liberado de la solución, dando por resultado la ruptura de las membranas celulares. Este método ofrece varias ventajas sobre los métodos de homogeneización mecánicos que implica tensiones de cizallamiento y fricción como sigue: 1) es evitar cualquier estrés físico externo en las células; 2) una expansión adiabática que se enfría la muestra asegura no hay daño por calor a organelos; 3) componentes de la célula están protegidos de la oxidación por el gas inerte nitrógeno; 4) sin alteración del pH del medio de suspensión; 5) el proceso es uniforme y reproducible, ya que las mismas fuerzas disruptivas se aplican dentro de cada célula y a lo largo de la muestra; 6) el proceso es rápido y puede terminar dentro de 20-30 min.
Aislamiento de las mitocondrias de las células cultivadas y los tejidos se ha descrito ampliamente en la literatura, y se basa en una alteración de la célula suave seguida por una serie de centrifugados diferencial. La mayoría de los protocolos utilizados actualmente siga los procedimientos originales desarrollados en el medio siglo anterior18. Mientras que los enfoques bioquímicos básicos son correctos, hay varios conceptos erróneos que se destacó en la literatura y permaneció sin ser detectada. Para optimizar el protocolo para mitoribosomes, sistemáticamente investigado los principios generales divulgados y concluir que: 1) inclusión de Mg2 + y K+ en el buffer no son crucial. Se ha argumentado que la KCl, ayuda a prevenir la formación de un gel de19, sin embargo, proteínas citoplasmáticas proporciona una dilución suficiente como se describe en nuestro protocolo, este fenómeno no ocurre. Además, es útil para reducir la contaminación por los ribosomas citoplasmáticos20; exclusión de Mg2 + 2) no hay necesidad para mantener el cociente del máximo volumen posible de células al medio para proteger los organelos lanzados desde el entorno de hypo-osmótica. El apoyo osmótico en nuestro protocolo es suficientemente proporcionado por buffers que contengan sacarosa y la dilución de las células con buffer de aislamiento de las mitocondrias (paso 2.II.5) es esencial para la eficiente separación de organelos en una preparación a gran escala.
El pH del buffer de aislamiento de las mitocondrias está cerca de los valores fisiológicos, es decir, 7.5, que es el pH óptimo para la siguiente preparación de mitoribosome. Agentes EDTA y EGTA se añaden a los medios de aislamiento a quelar iones contaminantes y quelato magnesio libre y calcio, respectivamente. Se ha discutido que la inclusión de EDTA puede conducir al daño de la membrana mitocondrial interna14, por lo tanto, la concentración está limitada a 1 mM como medida de precaución. No hemos observado ninguna diferencia cuando se utiliza EDTA de 5 mM en el paso de la purificación final del gradiente de densidad de sacarosa.
El protocolo descrito en el presente documento utiliza células humanas derivadas de HEK293S para la purificación de la mitoribosome. La calidad de la preparación permite la muestra obtenida ser investigada bioquímicamente y estructuralmente a resolución atómica. Esto permite aplicar el método a mitoribosomal humano traducir complejos, conjuntos de control de calidad y productos intermedios de subunidades de mitoribosomal. Por otra parte, puesto que las células cancerosas han amplificado capacidad OXPHOS y traducción proteína mitocondrial elevada en comparación con tejido estroma adyacente21, mitoribosomes son blancos de drogas establecido para cáncer22. Por lo tanto, usando este protocolo para la purificación específica de mitoribosomes en presencia de inhibidores tendrá aplicaciones médicas. Además, las mutaciones mitoribosomal se han relacionado con enfermedades hereditarias mitocondriales23. Puesto que estas mutaciones tienen efectos directos sobre la estructura, el enfoque presentado aquí será útil para su caracterización estructural. El protocolo puede ser experimentalmente ampliado y aplicado a una variedad de cuestiones científicas para abordar la comprensión fundamental de la traducción en la mitocondria humana y su importancia médica.

El proceso de síntesis de proteínas mitocondriales se basa en 13 mt-mRNAs esenciales que se traducen por una mitoribosome unida a membrana especializada para formar el núcleo catalítico de la cadena respiratoria. El genoma mitocondrial alterado y la necesidad de las proteínas insertar co-translationally en la membrana sustancialmente han moldeado la arquitectura de los ribosomas mitocondriales1. Estructuras de alta resolución reciente de lo mamífero mitoribosome mostraron un aspecto general muy diferente a la contraparte bacteriana2,3. Particularmente, se agregan proteínas específicas de las mitocondrias por lo menos 36, aportando masa molecular extra de la MDa de ~ 1, mientras que mt-rRNA es reducido por doble y altamente divergieron. Los cambios estructurales alteran casi todas características funcionales que previamente fueron aceptadas generalmente ser universalmente conservado4.
Nuevos elementos principales han sido adquiridos por cada una de las subunidades de la mitoribosomal, por ejemplo, la subunidad pequeña ha incorporado una intrínseca GTPasa proteína mS29 en su región de 'cabeza'. Actividad GTPasa no ha sido encontrado en otros sistemas de traducción, y la estructura indica que la GTPasa puede tener un papel en subunidad Asamblea2. El rRNA 5S que se consideraba un hito de subunidades grandes ribosomales conocidos todos, formando la base de la protuberancia central, falta en lo mamífero mitoribosome y ha adoptado a mt-tRNA-Val como un bloque de construcción integral en vez de eso2. Ban y sus colegas demostraron que la mitoribosome porcina tiene mt-tRNA-Phe y no – Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk y colegas seguimiento a estos datos y encontraron que mitoribosomes de pacientes con estabilidad mt-tRNA-Val comprometido en principio caben Phe-tRNA-mt6,7. Por ello los mitoribosomes han incorporado estos elementos específicos y vías y transporte-factores se requieren para estas asambleas únicas siguen siendo desconocidas.
En general, la alta complejidad de la mitoribosome humano, nuevos componentes de la proteína y la asociación única de la mt-tRNA como elemento estructural implica la implicación de factores aún desconocidos mitocondria específica trans. Sin embargo, porque muchas de las características de este sistema son únicas a las mitocondrias, que tradicionalmente han sido difíciles de investigar8, poco se sabe sobre el mecanismo molecular y control de calidad. Con el desarrollo de análisis de alta resolución sola partícula electrón crio-microscopía (cryo-EM)20, ahora surgen oportunidades para estudiar exhaustivamente los mecanismos moleculares subyacentes a la Asamblea, acción y control de calidad del ser humano mitoribosome. Nuestro informe de la primera estructura de la Asamblea de la mitoribosome humana intermedia proporciona el reconocimiento de que es posible visualizar cómo se forma la mitoribosome humana y muestra que cryo-EM es fundamental para la identificación de nuevas trans- Asamblea actuando factores de9.
Para ampliar este esfuerzo inicial, se describe un protocolo rápido para la purificación del mitoribosome humano en detalle. En la primera parte del Protocolo, se describe un aislamiento a gran escala de las mitocondrias intactas altamente puros de las células de suspensión. Este procedimiento requiere 9 h y puede ser fácilmente modificado y adaptado a escalas y diferentes tipos de células. Un paso importante en este protocolo es el uso de la cavitación de nitrógeno para romper las células. La segunda parte del protocolo fue desarrollada para purificar mitoribosomes. Este procedimiento requiere de 7 h y produce una cantidad suficiente de mitoribosomes para estudios bioquímicos y estructurales. Uso de mitocondrias puras como materia prima ofrece preparativos finales de alta calidad y puede ser extrapolada a otras macromoléculas mitocondriales.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) alto contenido de glucosa, suplemento GLUTAMAX, piruvato</td><td>Thermo Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina S HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de selección Zeocin</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25001</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Freestyle 293 Medio de expresión</td><td>Thermo Matraz</td><td></td> de cultivo de tejidos Scientific 12338026 <td></td></tr><tr><td>T175 con tapón ventilado</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.002</td><td></td></tr><tr><td>Matraces agitadores con tapón ventilado</td><td>Thermo Scientific</td><td>4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de frasco cónicos de 250 ml, estériles</td><td>Contador de células automatizado Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Eve</td><td>NanoEnTek</td><td>E1000</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de disrupción celular de cavitación de nitrógeno</td><td>Parr Instruments</td><td>4635, 4639</td><td>volumen de seguridad: 40 ml, 600 ml respectivamente</td></tr><tr><td>Dnasa (sin ARN)</td><td>HT Biotechnology</td><td>N401a</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizadores de teflón/vidrio</td> Cambridge <td>Glassblowing Limited</td><td></td><td>Tamaño diseñado bajo pedido</td></tr><tr><td>Tubos SW40 para gradiente mitocondrial</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td>Polipropileno, pared delgada</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171</td><td></td></tr><tr><td>Tubos TLA 120.2 para cojín</td><td>Beckman</td><td>343778</td><td>Policarbonato, tubos</td></tr><tr><td>TLS-55 de pared gruesa para gradiente</td><td>Beckman</td><td>347356</td><td>Estación de</td></tr><tr><td>gradiente</td> ultraclara IP <td>BioComp</td><td>153-002</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento rápido de la mitoribosome de las células hek

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Las mitocondrias humanas poseen un conjunto dedicado de los ribosomas (mitoribosomes) que se traducen en 13 componentes de proteína esencial de los complejos de la fosforilación oxidativa codificados por el genoma mitocondrial. Puesto que todas las proteínas sintetizadas por mitoribosomes humanos son proteínas integrales de membrana, mitoribosomes humanos están atados a la membrana interna mitocondrial durante la traducción. En comparación con el ribosoma citosólico el mitoribosome tiene un coeficiente de sedimentación de 55 años, mitad del contenido de rRNA, no rRNA 5S y 36 proteínas adicionales. Por lo tanto, un cociente más alto de la proteína al RNA y una estructura anormal hacen el mitoribosome humano substancialmente diferente de su contraparte citosólica.
A pesar de la importancia central de la mitoribosome a la vida, no hay protocolos estaban disponibles para purificar el complejo intacto de líneas celulares humanas. Tradicionalmente, mitoribosomes fueron aislados de los tejidos animales ricos en mitocondrias que requirió kilogramos de material de partida. Razonamos que las mitocondrias en la división de las células humanas derivadas de HEK293 cultivadas en medio rico en nutrientes expresión tendrían una traducción mitocondrial activa y, por tanto, podrían ser una fuente adecuada de material para los estudios estructurales y bioquímicos de la mitoribosome. Para investigar su estructura, hemos desarrollado un protocolo para la purificación a gran escala de mitoribosomes intacta de células HEK. Adjunto, presentamos el método de cavitación de nitrógeno como un más rápido, menos intensivo y más eficiente alternativa a la tradicionales mecánicos esquileo métodos de lisis celular. Esto dio lugar a preparativos de la mitoribosome que permitió su determinación estructural de alta resolución, revelar la composición de la mitoribosome humana intacta y sus intermediarios de la Asamblea. Aquí, nos dar seguimiento a este trabajo presentar un optimizado y más rentable método requiere solamente ~ 1010 cultivadas las células HEK. El método se puede emplear para purificar humano mitoribosomal traducir complejos, mutantes, conjuntos de control de calidad y mitoribosomal subunidades intermedios. La purificación puede ser linealmente aumentada diez veces si es necesario y también se aplica a otros tipos de células.

Las células divisorias y altamente viables es un punto de partida esencial para la purificación del mitoribosomes activo. Este protocolo es aplicable a todas las células de suspensión HEK293. Estamos utilizando línea de celular interno T501, que estable es expresión de un transportador bajo control inducible por tetraciclina. La línea celular parental es– HEK293S-GnTI células (Tabla de materiales)10. Durante el crecimiento celular y la expansión en el medio de expresión de 293 FreeStyle la densidad mínima debe conservarse en 1.5 x 106 células/mL, con el fin de garantizar una tasa de duplicación cada dos días, mientras que la máxima densidad de la célula no debe exceder ~ 5 x 106 células / mL. al llegar a una densidad celular por encima de 3 x 106 células/mL, las células son peleteadas y suspendidas en un medio fresco, precalentado en un volumen mayor para alcanzar la densidad mínima célula de 1.5 x 106 células/mL. Esta división se realiza varias veces cada 2-3 días hasta logra una masa celular deseada para el procedimiento. La densidad celular final puede variar en el rango de 3-4.5 x 106 células/mL y menos de 2 L se requiere como punto de partida para el aislamiento de las mitocondrias. La viabilidad de las células generalmente se mantenga &gt; 90% y para la cultura final que se cosecha &gt; 95%. No se recomienda el tratamiento de la cultura de células a gran escala con los antibióticos.
Después de la serie de centrifugados diferencial, el volumen de la suspensión mitocondrial después de paso 2.2.20 es típicamente en el rango de 3 a 5 mL. Las mitocondrias se separan en el gradiente de sacarosa (figura 1) de otros organelos. El gradiente de sacarosa paso a paso se prepara tal que el volumen de la pendiente y el volumen de la suspensión mitocondrial junto llenan el tubo de centrifugación hasta su capacidad máxima. Aquí se necesita especial cuidado para recoger la banda marrón migrar al 60% 32% interfaz con contaminación mínima de amortiguamiento circundante. Esto es importante para mantener la relación constante de proteína: detergente en el siguiente paso de solubilización de las mitocondrias. Se recomienda evaluar la concentración de proteína mitocondrial en esta etapa, y se espera un rendimiento típico de la proteína mitocondrial total 15-20 mg de ~ 1010 cultivada HEK células.
Aislamiento exitoso de las mitocondrias, son lisis por la adición de polietilenglicol éter de Octylpheny, y mitoribosomes se separan a través de un colchón de sacarosa (figura 2). Para separar el mitoribosomes de la sustancia membranosa hidrofóbica, pellets se resuspendió en buffer no contiene detergente, y complejos hidrofóbicos son peleteados por centrifugación. Este procedimiento se repite, y se cuantifica el grado de purificación de mitoribosomes por A260/unratio de280 , que se espera que sea ~ 1.3. Rendimiento típico es 7 A260 de 2 L a partir de la cultura. Esta fracción de mitoribosomal también contiene adicionales complejos mitocondriales solubles grandes, tales como piruvato deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa. Para separar el mitoribosomes de los complejos mitocondriales solubles, el sobrenadante se aplica a un gradiente de densidad de sacarosa. Fracciones que contienen lo mitoribosome son generalmente situados en la parte inferior tercera del tubo. El fraccionamiento de la gradiente de sacarosa puede hacerse con un pistón automatizado o manual cuidadosamente tomando 50 fracciones μl con pipeta o la parte inferior del tubo de perforación con una aguja de 21 G y recogiendo las gotas.
En el gradiente se identifican dos poblaciones principales mitoribosomal: monosome de 55 años y subunidad grande 39S, como ilustrado en figura 3 y figura 4. La presencia de la fracción subunidad grande sugiere que las células se cosechan en una divisoria muy activo estado11. Puede cambiar la relación entre los monosome y los picos de la subunidad grande. Un pico adicional localizado más cerca a la parte inferior puede aparecer en las preparaciones con contaminar los ribosomas citoplasmáticos de los años 80. Por favor nota que el gradiente de sacarosa pequeños usando el balanceo cubo rotor TLS-55 permite la purificación rápida de ~ 1 mL de mitoribosomes en una densidad óptica de 0.4-1 A260. La separación de los monosome y los picos de la subunidad grande puede variar ligeramente dependiendo del fraccionamiento, pero generalmente existe cierta superposición de los dos picos. Por lo tanto, que fracciones de recoger, y piscina debe tenerse en cuenta para asegurar la mayor proporción de monosome o subunidad grande como alternativa, en la muestra. Estudios de alta resolución cryo-EM, la separación entre las dos poblaciones mitoribosomal no es absolutamente necesaria (debido a operaciones adicionales en silico ). Sin embargo, si mejor separación es necesario, se recomienda utilizar tubos más grandes y correspondiente veces.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig1.jpg"> Figura 1 : Purificación de la mitocondria en un gradiente de sacarosa. Orgánulos subcelulares de una 2 L a partir de la cultura fueron fraccionadas mediante una serie de centrifugados diferencial como se describe en el protocolo, y las mitocondrias fueron separadas en un gradiente discontinuo de sacarosa. Las mitocondrias purificadas se encuentran en la banda inferior en la interfaz de 32-60%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig2.jpg"> Figura 2 : Purificación de mitoribosomes sobre un cojín de la sacarosa. Mitoribosomes crudos de una cultura a partir de 2 L son sedimentadas a través del colchón de sacarosa de 1 M. Los pellets se resuspendió en solución tampón libre de detergente, y mitoribosomes se clarifican por dos centrifugados como se describe en el protocolo. La absorbancia se registra para evaluar la calidad de la preparación y el típico A260/280 deunratio de ~1.3 (panel derecho) certifica una fracción rica de mitoribosome. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig3.jpg"> Figura 3 : Fina purificación de mitoribosomes en un gradiente de sacarosa. Rastro de la absorbancia de un 2 L a partir de la cultura. Fracciones se numeran desde la parte superior a la parte inferior de la gradiente. Se identifican dos poblaciones principales mitoribosomal: subunidad grande (pico 1) y monosome de 55 años (máximo 2). Puede cambiar la relación entre las poblaciones. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig4.jpg"> Figura 4 : Micrografía electrónica, clases de 2D y 3D reconstrucción. Panel de la izquierda: una micrografía con la muestra del pico de monosome 2 a un calibrado aumento de 1.23 A / pixel. Panel de centro: Unas representante datos post-proceso (clases 2D) revelando monosomes intactas. Panel de la derecha: reconstrucción 3D. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Las mitocondrias han especializado los ribosomas que divergieron de sus contrapartes bacterianas y citoplasmáticas. Aquí mostramos cómo mitoribosomes puede obtenerse su compartimiento nativo en las células HEK. El método implica el aislamiento de las mitocondrias de las células de suspensión y consiguiente depuración de mitoribosomes.

Aislamiento rápido de la Mitoribosome de las células HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

El objetivo general de este procedimiento es purificar los ribosomas de las mitocondrias de las líneas celulares humanas a gran escala que es suficiente para los estudios estructurales. Este método de purificación ribosoma mitocondrial permite caracterizar complejos de traducción, mutantes, conjuntos de control de calidad e intermedios de subunidades mitoribosomales. Estos se pueden utilizar para responder preguntas clave sobre la síntesis de proteínas en las mitocondrias.La principal ventaja de esta técnica es que la cavitación de nitrógeno se utiliza para la lelisis celular y sólo se necesitan de 10 a las 10 células de cultivo para preparar los mitoribosomas para la determinación de la estructura de alta resolución. Esta técnica puede dar lugar al descubrimiento de nuevos componentes de la maquinaria de traducción de las mitocondrias y puede utilizarse más para el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento del cáncer. Después de cultivar las células HEK293S de acuerdo con el protocolo de texto, cosecha dos tubos de células de un litro por centrifugación a 1.000 veces g y cuatro grados centígrados durante siete minutos.Decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspend rápidamente cada pellet en 100 mililitros de PBS. Luego, afila las células y centrifuga la suspensión a 1.200 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, después de decantar cuidadosamente el sobrenadante, pesar el pellet.Luego, utilice 120 mililitros de búfer MIB para resuspendarlo y dejar que las células resuspendidas se hinchen en la sala fría durante 20 minutos. Transfiera las células hinchadas a una cámara de cavitación de nitrógeno preenfriada sobre hielo. Luego, agregue 45 mililitros de búfer SM4 a las células.Fije la cámara de cavitación de nitrógeno y llénelo con nitrógeno hasta que la presión alcance 500 PSI. Luego, cierra los grifos y mantenlo en hielo durante 20 minutos. El método de lysis de células de cavitación de nitrógeno previene el estrés físico externo en las células, evita el daño por calor a los orgánulos y el gas nitrógeno protege las células de la oxidación.Además, es un método altamente reproducible. Suelte lentamente la presión en la cámara y recoja el izado. Luego, para eliminar los desechos celulares y los núcleos, centrifugar el material desnuspado a 800 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Recoger el sobrenadante vertiéndolo a través de un pedazo doblado de tela de muselina en un vaso de precipitados mantenido en hielo. No deseche el pellet. Resuspender el pellet en 90 mililitros de tampón MiBSM.Luego, usando un homogeneizador de vidrio de teflón hacia abajo, homogeneizar la muestra y repetir la centrifugación a 800 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Una vez más, recoger el sobrenadante vertiéndolo a través de un pedazo doblado de tela de muselina en un vaso de precipitados mantenido en hielo. A continuación, combine este sobrenadante con el primer sobrenadante.Centrifugar la muestra a 1.000 g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Luego, recoge el sobrenadante como antes. Después de desechar el pellet, centrifugar el sobrenadante que contiene mitocondrias brutas a 10.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos.Lave cuidadosamente cualquier pellet suelto sin alterar la porción apretada. A continuación, utilice 10 mililitros de tampón MiBSM para resuspend el pellet apretado. Agregue 200 unidades de RNase-Free DNase a la muestra para extraer el ADN genómico y girar el tubo sobre un rodillo en la sala fría durante 20 minutos para digerir uniformemente la muestra.Centrifugar la muestra a 10.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos y utilice dos mililitros de tampón SEM para resuspender el pellet. Cargue toda la suspensión mitocondrial en la parte superior del gradiente de sacarosa. Después de girar el degradado de acuerdo con el protocolo de texto, utilizando una pipeta de transferencia, recoja cuidadosamente la banda marrón migrando en la interfaz de 32% y 60%sacarosa.Este protocolo utiliza cavitación de nitrógeno para romper las células. Una vez dominado, un aislamiento a gran escala de las mitocondrias intactas y altamente puras se puede hacer en un plazo de nueve horas y se puede modificar y adaptar fácilmente para diferentes tipos y escalas celulares. Después de descongelar las mitocondrias congeladas sobre hielo, agregue dos volúmenes de tampón de lelisis a tres mililitros de mitocondrias.Mezcle inmediatamente invirtiendo el tubo varias veces. Utilice un pequeño homogeneizador de vidrio de teflón para ayudar con la lelisis e incubar el homogeneato sobre hielo durante cinco a 10 minutos para completar la reacción. Centrifugar el izado a 30.000 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos para eliminar el material insoluble.A continuación, recoja cuidadosamente el sobrenadante y deseche el pellet. Repita la centrifugación para asegurar la clarificación del sobrenadante. A continuación, recoja cuidadosamente el sobrenadante y deseche el pellet.Para cada mililitro de material de lesido, prepare un cojín de sacarosa en un tubo ultra claro TLA-120.2 añadiendo 0,4 mililitros de cojín de sacarosa a los tubos. Capa de aproximadamente un mililitro de mitocondrias de lezado en cada cojín de sacarosa dando como resultado una relación de izado a cojín de 2,5 a uno. Luego, centrifuga la muestra en un rotor TLA-120.2 a 231, 550 veces g y cuatro grados Celsius durante 45 minutos.Deseche el sobrenadante y utilice 100 microlitros del tampón de resuspensión para enjuagar el tubo y eliminar la sacarosa residual. Resuspender los pellets y combinarlos en un total de 100 microlitros de tampón de resuspensión. Mientras resuspender el pellet del cojín, es esencial realizar sobre hielo para evitar el calentamiento de la muestra y también para evitar la formación de espuma de la muestra con el fin de garantizar la integridad estructural de los ribosomas mitocondriales.Vórtice la muestra a velocidad lenta durante 30 segundos para disolver los agregados restantes y centrifugar los tubos a 17, 949 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Recoja cuidadosamente el sobrenadante y repita la centrifugación. Después de medir la absorción mitoribosoma en A260, cargue toda la muestra en un solo tubo de gradiente de sacarosa lineal.Centrifugar la muestra en un rotor TLS-55 a 213, 626 veces g y cuatro grados Celsius durante 120 minutos. Para fraccionar el gradiente, perfore la parte inferior del tubo y recoja la muestra en una placa de 96 pozos. La purificación del mitoribosoma no debe tardar más de siete horas en una cantidad suficiente de mitoribosomas.Como se demuestra en este gradiente discontinuo de sacarosa, las mitocondrias purificadas migran a la banda inferior marrón en la interfaz 32-60%. Tras la separación de los mitoribotos de los complejos mitocondriales solubles en un gradiente de sacarosa, se identifican dos poblaciones mitoribosomales principales, el monosoma 55S y la subunidad grande 39S. La presencia de la fracción de subunidad grande sugiere que las células se cosechan en un estado de división activa.Este panel muestra una micrografía con la muestra del pico monosoma dos en un aumento calibrado de 1,23 angstroms por píxel. Aquí se muestran datos después del procesamiento inicial que revelan monosomas intactos. Por último, en este panel se ilustra una reconstrucción 3D monosoma.Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo preparar mitoribotosomas humanos intactos para estudios estructurales y bioquímicos. Nuestro protocolo ofrece preparaciones finales de alta calidad que podrían extrapolarse a otras macromoléculas mitocondriales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

Un paso a paso el protocolo para aislar e identificar los complejos de ARN asociados a través de RIP-Chip.

Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

Se describe aquí una técnica que ahora se utilizan habitualmente para aislar de forma estable consolidados complejos ribosoma cadena naciente (RNC). Esta técnica aprovecha el descubrimiento de que un joven de 17 aminoácidos de longitud SecM "secuencia de la detención" puede detener la elongación de la traducción en un procariota...

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

La comparación del potencial de membrana mitocondrial entre muestras proporciona información valiosa sobre el estado celular. Se describen los pasos detallados para aislar las mitocondrias y evaluar la respuesta a los inhibidores y desacopladores mediante fluorescencia. El método y la utilidad de este protocolo se ilustran mediante el uso de un cultivo celular y un modelo animal de estrés celular.

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

Presentamos un protocolo de dos pasos para el aislamiento de mitocondrias de alta calidad que es compatible con el descubrimiento y cuantificación de proteínas a escala de proteoma. Nuestro protocolo no requiere ingeniería genética y, por lo tanto, es adecuado para estudiar las mitocondrias de cualquier célula y tejido primario.

Aislamiento de dos pasos sin etiquetas de las mitocondrias para mejorar el descubrimiento y la cuantificación de proteínas

Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Aprende a aislar mitorribosomas de células HEK mediante cavitación con nitrógeno para estudios estructurales. Este método eficiente permite obtener preparaciones de alta calidad para investigar la síntesis de proteínas mitocondriales.

Aislamiento rápido de la Mitoribosome de las células HEK

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