Administración exógena de alfa-sinucleína asociada a microsomas agregados a las neuronas primarias como un modelo de celular de gran alcance de la formación de las fibrillas de

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la alfa-sinucleína, como dilucidar el mecanismo de propagación de la agregación y la toxicidad de la alfa-sinucleína in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere la purificación de las fibrillas preformadas de alfa-sinucleína, que requiere mucho tiempo. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Lucía Rota, estudiante de posgrado del Laboratorio COLA.

Para comenzar el procedimiento, prepare el tampón de homogeneización y manténgalo en hielo. A continuación, homogeneice el tejido fresco o congelado en un volumen de uno a 10 volúmenes de tampón de homogeneización helado utilizando un homogeneizador de mortero de teflón con 10 a 15 golpes. Posteriormente, transfiera todo el homogeneizado inicial a un tubo de microcentrífuga y centrifugue a 1.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los núcleos y las células intactas en el pellet resultante.

Posteriormente, deseche el pellet resultante. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio y centrifugue a 10.000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados utilizando una centrífuga refrigerada para obtener el segundo sobrenadante y el pellet. A continuación, transfiera este sobrenadante a una botella de policarbonato y centrifugue a 100.000 veces G durante una hora a cuatro grados centígrados utilizando una ultracentrífuga y un rotor de ángulo fijo.

Vuelva a suspender el pellet crudo P100 con 500 microlitros del tampón de homogeneización. Transfiera el pellet crudo P100 a un tubo de microcentrífuga limpio y centrifugue a 10.000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados en una centrífuga refrigerada. Después de 20 minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender P100 con 100 microlitros de tampón de homogeneización.

A continuación, sonique la muestra durante dos segundos en hielo y guárdela a menos 80 grados centígrados. Para realizar Western Blot, coloque un gel de poliacrilamida de tris-glicina con un gradiente de cuatro a 20% en un aparato de electroforesis vertical. Disuelva un microgramo de fracciones de alfa-sinucleína asociadas a microsomas en el tampón de muestra desnaturalizante y cárguelo en el gel.

En un pocillo diferente, cargue cinco microlitros de marcador estándar de proteína. Ejecute el gel a 100 voltios en un tampón de funcionamiento SDS de tris-glicina hasta que el marcador de proteínas llegue al final del gel. A continuación, transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa utilizando un tampón de carbonato básico.

Mantenga la muestra durante la noche en la cámara frigorífica con una potencia constante establecida en 200 miliamperios. Al día siguiente, bloquee la membrana con PBS-T con leche en polvo descremada al 5% en un agitador orbital durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, enjuague brevemente la membrana con PBS-T.

Incubar la membrana con SIN-1 a uno a 5.000, o el anticuerpo P-Ser129 alfa-sinucleína a uno a 5.000 en leche en polvo descremada al 2,5% en PBS-T durante la noche en la cámara frigorífica o en el refrigerador a cuatro grados centígrados en un agitador orbital. Al día siguiente, lave la membrana durante 10 minutos a temperatura ambiente con PBS-T en un agitador orbital. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado HRP anti-ratón o anti-conejo de uno a 3.000 en leche en polvo descremada al 2,5% en PBS-T durante una hora a temperatura ambiente en un agitador orbital.

A continuación, lave la membrana durante 10 minutos a temperatura ambiente con PBS-T en un agitador orbital durante tres veces. Obtenga la señal a través del kit de quimioluminiscencia regular. Para tratar las neuronas, se extraen los agregados de alfa-sinucleína asociados a los microsomas obtenidos de la médula espinal de tres ratones transgénicos enfermos diferentes para obtener una solución de un microgramo por microlitro diluida con el tampón de homogeneización original.

A continuación, retire un tercio del medio y reemplácelo suavemente con medio de neuronas frescas. Agregue un microgramo de agregados alfa-s asociados a microsomas agrupados al medio celular. Regrese las neuronas en la incubadora a 37 grados centígrados.

Agregue un tercio de medio fresco a la muestra sin reemplazar el medio una vez cada tres días durante una semana. Después de una semana de tratamiento, retire un tercio del medio y reemplácelo suavemente con un medio fresco que contenga 2% de B27, gentamicina de 10 microgramos por mililitro y dos milimolares de glutamina. Repita cada tres días durante una semana antes de fijar las celdas.

Para realizar la inmunofluorescencia, en una campana de gases químicos, fije las neuronas con paraformaldehído al 2% y PBS en una solución de sacarosa al 5% durante 15 minutos a temperatura ambiente sin agitar. Después de 15 minutos, retire la solución de fijación y lave brevemente las neuronas con PBS tres veces. A continuación, permeabilice las neuronas con un 0,3% de surfactina no iónica en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Luego, lave brevemente las neuronas con PBS tres veces. Incubar las neuronas con 3%FBS y PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital para bloquear sitios de unión inespecíficos. A continuación, incubar las neuronas con el anticuerpo primario adecuado disuelto en FBS al 3% y PBS durante la noche en la cámara frigorífica o en el refrigerador durante la noche a cuatro grados centígrados en un agitador orbital.

Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos y lave las células brevemente con PBS tres veces. A continuación, incubar las neuronas con el anticuerpo secundario fluorescente adecuado disuelto en 3%FBS y PBS durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital. Retire la solución de anticuerpos y lávese brevemente con PBS tres veces.

A continuación, tiñe las neuronas con una solución de DAPI durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital. Después de 15 minutos, retire la solución de anticuerpos y lávese brevemente con PBS tres veces. Monte los cubreobjetos en la corredera utilizando un medio de montaje antidecoloración.

En este estudio, la administración de un microgramo de agregados de alfa-sinucleína asociados a microsomas combinados de ratones transgénicos A53T enfermos al medio de cultivo de neuronas corticales o hipocampales induce una formación dependiente del tiempo de inclusiones de alfa-sinucleína, positivas para anticuerpos alfa-sinucleína específicos del agregado. Después de dos días de tratamiento, estos agregados aparecen como pequeños puntos dispersos que se volverán más abundantes en puntos de tiempo posteriores. Después de dos semanas, las inclusiones de alfa-sinucleína se asemejan a estructuras largas y maduras en forma de cuentas muy dispersas por los cultivos neuronales que siguen un patrón de neuritas y se colocalizan parcialmente con marcadores presinápticos y de neuritas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar ajustar la proporción de microgramos de agregados de alfa-sinucleína asociados a microsomas a la densidad de neuronas plateadas y aislar los agregados de alfa-sinucleína asociados a microsomas del tejido rico en inclusiones de alfa-sinucleína. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar agregados de alfa-sinucleína asociados a microsomas de ratones transgénicos enfermos, para usarlos como tratamiento para que las neuronas primarias induzcan la formación de inclusiones de alfa-sinucleína.