Name: Una medida cuantitativa de especies reactivas de oxígeno y senescencia asociada a fenotipo secretor en fibroblastos humanos normales durante la senescencia inducida por el oncogén (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Aprende a medir especies reactivas de oxígeno y el fenotipo secretor asociado a senescencia en fibroblastos humanos WI-38 mediante citometría de flujo, PCR en tiempo real y ELISA.

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Este trabajo fue financiado por una beca de la Fundación Nacional de investigación de Corea (2015R1D1A1A01060839) (a Young Yeon Kim) y por una beca de la National Research Foundation de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea (MSIT) (no. 2016R1A2B2008887 no. 2016R1A5A2007009) (a Jeanho Yun).

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li>
<li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li>
<li>Collado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+biology%3A+senescence+in+premalignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour biology: senescence in premalignant tumours.</a> Nature. 436 (7051), 642(2005).</li>
<li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+senescence+secretome+under+control%3A+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Lu, T., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Free radicals and senescence.</a> Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).</li>
<li>Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+telomere+shortening+is+slowed+down+by+enrichment+of+intracellular+vitamin+C+via+suppression+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress.</a> Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).</li>
<li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+proteins+induce+senescence+by+altering+the+intracellular+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li>
<li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+faces+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li>
<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype%3A+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li>
<li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li>
<li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos presentado para el monitoreo de los niveles ROS intracelulares durante la senescencia inducida por el H-Ras en fibroblastos humanos normales WI-38. Niveles ROS intracelulares en células vivas pueden medirse cuantitativamente utilizando el reactivo permeable a la célula DCF-DA y citometría de flujo. Absorción celular, DCF-DA es desacetilado por esterasas intracelulares y, posteriormente, oxidado por ROS para formar altamente fluorescente 2', 7'-Diclorofluoresceína (DCF). La fluorescencia DCF puede detectarse m...

Más de 50 años, Hayflick y Moorhead revelaron que las células normales entren la detención de crecimiento irreversible sobre el agotamiento de su potencial proliferativo después de un cierto número de divisiones celulares1. Este fenómeno se conoce como senescencia replicativa y se cree que correlaciona fuertemente con la envejecimiento2. Aunque la erosión progresiva de los telómeros es considerada una de las principales causas de la senescencia replicativa, varias tensiones celulares, tales como daño del ADN, activación oncogénica y estrés oxidativo, se han divulgado para inducir a otro tipo de senescencia celular se llama "envejecimiento prematuro" o "senescencia inducida por estrés". Curiosamente, senescencia prematura desempeña un papel supresor de tumor potente sobre la activación de oncogenes como H-Ras y BRAF. Estudios de modelos de ratón y de tejidos humanos han producido evidencia que eran predominante presentes en las lesiones premalignas donde oncogénica Ras y BRAF se activan pero fueron disminuidos en cánceres malignos que se convirtió de biomarcadores de la senescencia celular Estas lesiones3,4,5. Más allá de su papel en el envejecimiento y la supresión tumoral, senescencia celular se ha demostrado en estudios anteriores para jugar un papel en varios procesos fisiológicos, incluyendo la cicatrización de heridas, reparación de tejidos, vigilancia inmune y desarrollo embrionario6.
Aunque la detención de crecimiento ha sido estudiada extensivamente como un sello de senescencia celular7, un importante cuerpo de evidencia sugiere que esa especie intracelular de oxígeno reactivo (ROS) también contribuye a la senescencia celular8. La elevación de los niveles ROS durante varios tipos de senescencia celular, senescencia replicativa como senectud oncogene-inducida (OIS), originalmente se informó hace décadas9,10. Más directamente, el tratamiento exógeno con una dosis subletal de H2O2 induce senescencia11,12. La inhibición de enzimas barrido ROS como SOD1, también causa senescencia prematura13. En contraste, bajo condiciones de oxígeno ambiente y el aumento de retardo barrido ROS el inicio de la senescencia10,14,15. Sin duda, estos resultados indican que los ROS son mediadores importantes o determinantes de la inducción de senescencia celular. Sin embargo, cómo ROS contribuyen a la inducción de senescencia celular y cómo se elevan los niveles ROS durante la senescencia celular requieren una investigación adicional.
Estudios recientes han revelado que las células senescentes tienen actividades paracrinas potente sobre vecinos células y tejidos a través de una spas16,17. En el tejido envejecido, las células senescentes promoción disfunciones relacionadas con la edad del tejido mediante muchas vías a través de spas además de una disminución Autónoma de las células proliferativas. Factores proinflamatorios como la IL-6, IL-8, TGFβ y metaloproteinasas de matriz (MMPs), secretadas por las células senescentes, causan disfunciones relacionadas con la edad del tejido a través de la alteración de la homeostasis del tejido, destrucción de la arquitectura del tejido, senescencia de las células vecinas e inflamación estéril18,19. Sin embargo, SASPs puede tener efectos beneficiosos dependiendo el contexto biológico. Además, la naturaleza heterogenetic del SASPs depende del tipo de células senescentes y la etapa de la célula, haciendo hincapié en la necesidad de más investigación19.
Aquí, describimos técnicas basadas en citometría rápidos y sensibles para evaluar los niveles ROS intracelulares durante infecciones oportunistas. Además, se introducen métodos para el análisis de los factores de spas mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qPCR) y ELISA.

<table><tbody><tr><td><REACTIVOS > FUERTE</></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>poli-lisina</td><td>fuerte Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>wellgen</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil y beta; D-galactopiranósido (X-gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>ferrocianuro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>ferricianuro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>pozo</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Transcriptasa inversa</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Verde PCR master 2x mezcla</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación aleatoria</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo ELISA IL-6 humano</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo ELISA IL-8 humano</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>EQUIPOS</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m filtro de jeringa</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>BEMIS&nbsp;</td><td>Microscopio PM-996</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Lector</td><td>Molecular Devices</td> Lector <td></td>de <td>microplacas EMax</td></tr></tbody></table>

una medida cuantitativa de especies reactivas de oxígeno y senescencia asociada a fenotipo secretor en fibroblastos humanos normales durante la senescencia inducida por el oncogén

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Senescencia celular se ha considerado un estado de detención del crecimiento irreversible sobre agotamiento de la capacidad proliferativa o la exposición a tensiones diferentes. Estudios recientes han ampliado el papel de la senescencia celular a varios procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo, la cicatrización de heridas, vigilancia inmune y la disfunción relacionada con la edad del tejido. Aunque la detención del ciclo celular es una característica crítica de senescencia celular, una producción de aumento intracelular de oxígeno reactivo (ROS) las especies también se ha demostrado que juegan un papel importante en la inducción de senescencia celular. Además, estudios recientes revelaron que las células senescentes exhiben actividades potente paracrina sobre vecinos células y tejidos a través de un fenotipo secretorio asociada a la senescencia (spas). Fuerte aumento de interés sobre estrategias terapéuticas contra la senescencia celular hace hincapié en la necesidad de un entendimiento preciso de los mecanismos de la senescencia, incluyendo ROS intracelular y el SASP. Aquí, describimos protocolos para evaluar cuantitativamente los niveles ROS intracelulares durante la senescencia celular inducida por el H-Ras utilizando colorante fluorescente sensible al ROS y citometría de flujo. Además, presentamos las técnicas sensibles para el análisis de la inducción de la expresión del mRNA y la secreción de factores de spas. Estos protocolos pueden aplicarse a diversos modelos de senescencia celular.

En la figura 1se muestra un ejemplo de la senescencia inducida por el H-Ras. Una infección de fibroblastos humanos normales de WI-38 con el retrovirus de H-RasV12 indujo dramáticos cambios morfológicos (figura 1B). Además, como se muestra en la figura 1, actividad tinción de β-gal SA se incrementó notablemente al H-RasV12 expresión. Más del 70% de las células demostraron SA β-gal tinción actividad 6 ...

ROS intracelular se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la inducción de senescencia celular. Aquí, describimos un análisis sensible para cuantificar los niveles ROS durante la senescencia celular. También ofrecemos protocolos para evaluar el fenotipo secretor asociados a senescencia, que supuestamente contribuye a diferentes disfunciones relacionadas con la edad.

Una medida cuantitativa de especies reactivas de oxígeno y senescencia asociada a fenotipo secretor en fibroblastos humanos normales durante la senescencia inducida por el oncogén

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar técnicas sensibles para monitorear los niveles intracelulares de ROS y el fenotipo secretor asociado a la senescencia, o SASP, durante la senescencia celular. Aquí, demostramos que estos métodos revelan con éxito los aumentos en los niveles de ROS intracelulares y los factores SASP IL-6 e IL-8 durante la senescencia inducida por H-Ras en fibroblastos humanos normales WI-38. Estas técnicas permiten monitorizar los cambios en los niveles de ROS intracelulares durante la senescencia celular y el análisis de la expresión de los factores SASP.La principal ventaja de este método es que se pueden aplicar a muchos modelos diferentes de senescencia celular. Por lo tanto, este método puede ayudarnos a comprender el papel de ROS y SASP en la senescencia celular y a estudiar los mecanismos reguladores subyacentes. Demostrando el procedimiento estarán Young Yeon Kim y Jee-Hyun Um de mi laboratorio.Comience este procedimiento preparando el retrovirus H-Ras. En primer lugar, siembre células ecotrópicas de BOSC en una placa de cultivo recubierta de poli-L-lisina y cultive a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos durante un día. Al día siguiente, transfecte las células BOSC con ADN retroviral H-Ras y empaque el ADN utilizando reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Después de ocho horas de transfección, retire el medio de transfección y agregue ocho mililitros de medio fresco. Recoja los medios que contienen partículas virales 48 horas después y elimine los desechos celulares mediante centrifugación. A continuación, filtre los medios que contienen virus con un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros.Coloque las células WI-38 en una placa de cultivo de 60 milímetros un día antes de la cosecha del retrovirus H-Ras, y cultive durante un día a 37 grados Celsius en una incubadora. Al día siguiente, retire el medio de crecimiento y agregue un mililitro de medio del virus H-Ras. Agregue un mililitro adicional de medio de crecimiento que contenga dos microlitros de solución madre de polibreno e incube durante un día en la incubadora de CO2.A las 24 horas después de la infección, retire el medio viral, lave las células dos veces con PBS y agregue el medio de crecimiento. Para eliminar las células no infectadas, trátelas durante dos días con dos microgramos por mililitro de puromicina. Prepare una solución de tinción fresca de beta-gal SA diluyendo la solución madre.Retire el medio de cultivo y lave las células una vez con PBS. Agregue la solución de fijación que contenga formaldehído e incube durante cinco minutos. Retire la solución de fijación de las células y lávese con PBS.Agregue una solución de tinción de beta-gal SA recién preparada para cubrir el plato. Sellar la placa con Parafilm para evitar que la muestra se seque, e incubar a 37 grados centígrados en una incubadora sin CO2. Comprobar el estado de tinción de las células al microscopio al día siguiente.Las células SA beta-gal positivas aparecerán de color azul en la región perinuclear. Adquiera una imagen de la tinción de SA beta-gal con una cámara CCD y calcule el porcentaje de células SA teñidas con beta-gal contando el número de células SA beta-gal positivas entre al menos 200 células en total. Coloque dos veces 10 a la quinta células WI-38 en una placa de cultivo de 60 milímetros e induzca la senescencia infectando las células con el retrovirus H-Ras como se describió anteriormente.En el punto de tiempo deseado para la medición de ROS, retire el medio de crecimiento y lave una vez con PBS. Separar las células mediante tratamiento con solución de tripsina/EDTA y determinar el recuento de células. Transfiera una vez 10 a la quinta celda en un tubo cónico de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación.Retire el medio de crecimiento con cuidado y agregue un mililitro de medio de tinción DCF-DA recién preparado. Vuelva a suspender con cuidado el pellet de celda e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos en la oscuridad. Recoja las células por centrifugación y lávelas una vez con PBS.Vuelva a suspender las células con un mililitro de PBS y transfiera las muestras a un tubo FACS. La señal de fluorescencia DCF-DA se puede medir utilizando un citómetro de flujo equipado con un láser azul de 488 nanómetros. En primer lugar, examine una muestra de célula de control no teñida.En el diagrama de puntos de la dispersión directa frente a la dispersión lateral, seleccione las células vivas y elimine las células muertas y los restos de células mediante una herramienta de compuerta. A continuación, en el histograma que muestra la señal de fluorescencia DCF-DA, ajuste el voltaje del láser azul para colocar el pico de las celdas de control en el borde izquierdo. Ahora, ejecute cada muestra teñida con DCF-DA y registre al menos 10.000 eventos.Inducir la senescencia infectando las células con el retrovirus H-Ras como se describió anteriormente. Un día antes de la cosecha, lave las células dos veces con PBS. Agregue tres mililitros de DMEM sin FBS y cultive las células a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo de tejidos durante un día.Después de 24 horas, recoja el medio acondicionado y guárdelo a menos 80 grados centígrados para el ELISA posterior. Tripsinizar las células y recolectar las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por centrifugación. Prepare el ARN total utilizando el método convencional de extracción de ARN y genere ADNc a partir de dos microgramos de ARN total a través de una reacción de transcripción inversa.Para la PCR en tiempo real, prepare la mezcla maestra de PCR verde SYBR para todas las reacciones que contengan los cebadores directos e inversos para IL-6 o IL-8. Prepare la mezcla de reacción para cada muestra que contenga cebadores de actina como control interno. Agregue 48 microlitros de Master Mix y dos microlitros de productos de ADNc diluidos de uno a tres a cada pocillo en una placa de qPCR óptica de 96 pocillos.Realice cada reacción por triplicado. Configure el programa de reacción de PCR en tiempo real en el termociclador y realice PCR en tiempo real. Al finalizar la ejecución, recopile los valores del ciclo umbral, o valores de CT, y calcule los niveles de ARNm de IL-6 o IL-8 después de la normalización a los niveles de actina.Descongelación de medios condicionados recolectados previamente de células WI-38 senescentes. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 500 g durante cinco minutos. Concentre el medio acondicionado en 10 veces utilizando un filtro centrífugo con un tamaño de poro de 3.000 dalton.Realice el ELISA con el kit de ELISA IL-6 o IL-8 adecuado. Primero, cubra bien la placa ELISA con anticuerpos IL-6 o IL-8 diluidos incubando la placa durante la noche a temperatura ambiente. Después de lavar cada pocillo cuatro veces, agregue tampón de bloqueo a cada pocillo e incube durante una hora.Lave el plato cuatro veces. Agregue patrones ELISA diluidos en serie o muestras concentradas de medio condicionado, e incube durante dos horas. Después de lavar la placa, incubar las muestras con un anticuerpo secundario y un conjugado estreptavidina-HRP de forma secuencial.Añadir 100 microlitros de solución de sustrato de TMB a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir el desarrollo del color. Detenga la reacción agregando una solución de parada. Lea la absorbancia de cada pocillo con un lector ELISA a 450 nanómetros.Trace la curva estándar para los estándares generados. Calcular las concentraciones de IL-6 e IL-8 en el medio acondicionado según las curvas estándar. Represente los resultados después de la normalización en el recuento de celdas.La infección de fibroblastos humanos normales WI-38 con retrovirus H-Ras indujo cambios drásticos en la morfología celular. Se observó actividad de tinción de SA beta-gal en más del 70% de las células, lo que indica que la expresión de H-Ras induce senescencia celular en las células WI-38 en seis días. El análisis de tinción de DCF-DA revela que la expresión de H-Ras también induce un aumento significativo en los niveles de ROS intracelulares.El aumento en los niveles intracelulares de ROS se observa tan pronto como dos días después de la expresión de H-Ras y se mantiene hasta el punto de tiempo de seis días. El análisis de PCR en tiempo real de los factores secretores representativos asociados a la senescencia IL-6 e IL-8 revela que la expresión de ARNm de IL-6 e IL-8 aumenta notablemente en las células senescentes WI-38. Los ELISA del medio condicionado confirmaron que la secreción de IL-6 e IL-8 también aumenta en las células senescentes inducidas por H-Ras.La inducción de la senescencia celular a través de la expresión de oncogenes, el daño en el ADN o el estrés oxidativo suele tardar entre seis y ocho días. Una vez que las celdas están listas, la medición de ROS se puede realizar dentro de las dos horas si se realiza correctamente. Después del dominio de estas técnicas, el análisis de los niveles de ARNm y proteínas de los factores SASP se puede completar en un día.Al analizar los niveles de ROS y la inducción de SASP, es importante confirmar la senescencia celular mediante la tinción de SA beta-gal y un método adicional si es necesario. Además, es fundamental recordar que el aumento de ROS ocurre en la fase temprana de la senescencia, mientras que el desarrollo de SASP es detectable solo después de que la senescencia se haya establecido por completo. Estas técnicas se pueden aplicar a una amplia variedad de modelos de senescencia celular.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar los niveles de ROS y la inducción de SASP durante la senescencia celular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video ilustra un ensayo basado en citometría de flujo para cuantificar células cancerosas senescentes inducidas por la terapia con marcadores de senescencia duales. La detección y cuantificación de células senescentes implica el uso de un sustrato de β-galactosidasa. El sustrato es escindido por la β-galactosidasa lisosomal activa dentro de las células senescentes, produciendo un producto fluorescente que, junto con gránulos de lipofuscina autofluorescente, marca las células cancerosas...

Cuantificación basada en citometría de flujo de células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Si senescencia previene o promueve la tumorigénesis sigue siendo controvertido. Como los fármacos quimioterapéuticos pueden inducir a las células cancerosas a la senescencia, el estudio de la senescencia es esencial para proponer nuevas terapias. Sin embargo, el ensayo de β-galactosidasa estándar y ampliamente utilizado presenta importantes inconvenientes. Proponemos aquí un ensayo de citometría basada rápido y sensible para cuantificar el flujo de la senescencia.

Un método sensible para cuantificar las células cancerosas senescentes

La senescencia celular, el estado irreversible de la detención del ciclo celular, puede ser inducida por diferentes tipos de estrés celular. A continuación, describimos protocolos para inducir senescencia y métodos celular para evaluar marcadores de senescencia.

Técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar

Aquí, discutimos una serie de protocolos para la inducción y validación de senescencia celular en células cultivadas. Nos enfocamos en diferentes estímulos de inducción de senescencia y describir la cuantificación de los marcadores comunes asociados a senescencia. Proporcionamos detalles técnicos utilizando fibroblastos como modelo, pero los protocolos se adaptan a varios modelos de celulares.

Inducción y validación de senescencia celular en las células humanas primarias

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Ensayo de cribado basado en sA-Galactosidasa para la identificación de medicamentos senoterapéuticos

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Medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Se presenta un protocolo para la cuantificación citométrica de flujo fluorescente de células cancerosas senescentes inducidas por fármacos de quimioterapia en cultivo celular o en modelos tumorales murinos. Los procedimientos opcionales incluyen la co-inmunotinción, la fijación de muestras para facilitar el análisis de lotes grandes o puntos de tiempo, y el enriquecimiento de células senescentes viables mediante clasificación citométrica de flujo.

Sonda de β-galactosidasa asociada a senescencia fluorescente de color rojo lejano para la identificación y el enriquecimiento de células tumorales senescentes mediante citometría de flujo

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Detección de senescencia usando luz reflejada en la fracción vascular estromal adiposa

Este artículo presenta un protocolo LysoTracker de células vivas para medir la remodelación lisosomal durante la senescencia en fibroblastos humanos IMR-90.

Perfilado lisosomal con LysoTracker para la evaluación cuantitativa de la senescencia celular en fibroblastos humanos

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Novedosa combinación de antioxidantes para restaurar una comunicación intercelular saludable en un modelo in vitro utilizando un medio condicionado de células senescentes

Aprende a medir especies reactivas de oxígeno y el fenotipo secretor asociado a senescencia en fibroblastos humanos WI-38 mediante citometría de flujo, PCR en tiempo real y ELISA.

Una medida cuantitativa de especies reactivas de oxígeno y senescencia asociada a fenotipo secretor en fibroblastos humanos normales durante la senescencia inducida por el oncogén (Video) | JoVE Journal

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