Name: Sondeo de la célula mecánica con pinzas ópticas libres de grano en el embrión de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprende a medir fuerzas celulares en vivo en embriones de Drosophila usando pinzas ópticas sin microesferas combinadas con microscopía de hoja de luz. Este método permite cuantificar rigidez y tensión tisular durante la morfogénesis.

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Este trabajo fue apoyado por un FRM Equipe beca FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche de ANR-Blanc de Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (al P.-F.L.). Reconocemos Francia-Bioimagen infraestructura apoyado por el francés Agencia Nacional de investigación (ANR-10-INBS-04-01, «Las inversiones para el futuro»). Agradecemos a Brice Detailleur y Claude Moretti de la infraestructura de PICSL-FBI para asistencia técnica.

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<li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Pinzas ópticas permiten para realizar mediciones mecánicas absolutas directamente en el epitelio embrionario en desarrollo de una manera no invasiva. En ese sentido, presenta ventajas sobre otros métodos como la ablación del laser, que son invasivos y proporcionan mediciones relativas, fuerzas magnéticas, que requieren inyecciones, o fuerza de inferencia, que se basa en suposiciones fuertes y también proporcionan relativa mediciones.
El protocolo incluye algunos pasos críticos. En primer lugar...

Desarrollo embrionario es un proceso altamente reproducible durante el cual las células y los tejidos se deforman para dar forma a los futuros animales. Tales deformaciones han demostrado requerir la generación activa de las fuerzas de la célula nivel1,2. Para entender procesos morfogenéticos durante el cual las células y los tejidos cambian su forma, por lo tanto es clave para evaluar las propiedades mecánicas de las células involucradas y para medir las fuerzas dentro del tejido durante el proceso3,4 . Capas epiteliales, especialmente en Drosophila, se han estudiado ampliamente debido a su geometría de quasi-2D y a su fácil manipulación.
Así, un número de técnicas ha sido desarrollado por nosotros y otros para evaluar mecánica epitelial en vivo durante el desarrollo. Daremos un repaso rápido de las tres principales técnicas utilizadas en los tejidos epiteliales. Ablación con láser, un método ampliamente utilizado, permite revelar la tensión mecánica local en célula ensambladuras5,6,7,8 o en mayor escala9,10,11 mediante la realización de cortes locales que alteran la integridad mecánica del objetivo. La dinámica de la apertura tras el corte proporciona información sobre la ablación previa de estrés tanto en la reología del tejido12,13. Un inconveniente de la ablación láser es que es invasiva, ya que requiere la interrupción local de la corteza de la célula. Por lo tanto, sólo uno puede realizar un número limitado de ablaciones, si quiere preservar la integridad del tejido. Otro inconveniente es que ablaciones sólo proporcionan estimaciones relativas de la tensión en los contactos del celular, ya que la velocidad de apertura depende de la fricción viscosa, que generalmente no se conoce. Manipulación magnética también ha desarrollado y utilizado en Drosophila, que implican el uso de ferrofluidos14 o liposomas ultramagnetic15. Puede proporcionar medidas absolutas16,17, pero también son invasoras en el sentido que requieren la inyección de las puntas de prueba en el lugar deseado. Esto puede ser muy complicado dependiendo del sistema, que no siempre es sensible a las inyecciones precisas. Una tercera técnica, completamente no-invasivo, es fuerza de inferencia18,19,20. Fuerza de inferencia se basa en la suposición de equilibrio mecánico en puntos triples (tricellular nudos o vértices) y permite para deducir las tensiones en todo célula contactos (y posiblemente, las presiones en todas las células) por resolver un problema inverso. Para las tensiones, cada vértice proporciona dos ecuaciones (X e Y). Esto produce un gran sistema de ecuaciones lineales que puede ser invertida bajo ciertas condiciones para evaluar la tensión en todos los contactos de la célula. Mientras que este método es muy atractivo, ya que sólo no requiere una imagen segmentada y experimento adicional o configuración, su exactitud está aún por determinar, y otra vez sólo proporciona valores relativos, a menos que una medida de calibración absoluta se realiza.
Para superar algunas de estas limitaciones, presentamos en este artículo la configuración de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación a aplicar fuerzas controladas a escala celular en el epitelio embrionario de Drosophila melanogaster. Pinza óptica se han utilizado para numerosas aplicaciones biológicas incluyendo las mediciones de proteínas solo y la manipulación de células y organelos21. Aquí, Divulgamos a fuerzas aplicadas en la gama de algunos docena pN, que es pequeño pero suficiente para inducir deformaciones locales de contacto y realizar mediciones mecánicas en vivo. Por lo general, utilizamos desviación perpendicular de contacto, monitoreados a través del análisis de kymographs, relacionarse con fuerza a la deformación. Lo importante, nuestro programa de instalación no requiere la inyección de granos en el lugar deseado en el tejido, pinzas ópticas son capaces de ejercer directamente las fuerzas en los contactos célula-célula. El acoplamiento de las pinzas ópticas para un microscopio de luz hoja permite realizar rápida proyección de imagen (varios fotogramas por segundo), que es muy apreciable para un análisis mecánico en escalas de tiempo corto y con menor fototoxicidad, desde la iluminación de la muestra se limita al plano de proyección de imagen22.
Pinzas en generales, ópticas son una forma no invasiva para aplicar fuerzas controladas en contacto in vivo en el embrión de Drosophila y extraer información mecánica como rigidez y tensión en celular contactos23, propiedades reológicas 24y gradiente o anisotropía de tensión23.

<table><tbody><tr><td>Láser de fibra de iterbio LP, 10 W, CW</td><td>IPG Laser</td><td>YLM-10-LP-SC</td><td>incluyendo colimador LP: haz D = 1,6 mm y láser de guía roja</td></tr> <tr><td>y Oslash; Obturador de haz óptico de 1/2"</td><td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de galvanómetros de diámetro de haz pequeño</td><td>Thorlabs</td><td>GVS001</td><td>1 para desplazamiento X, 1 para desplazamiento Y</td></tr><tr><td>1D o 2D Sistema Galvo Fuente de alimentación lineal</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td>galvanómetros</td></tr> fuente de alimentación <tr><td>2 lentes f = 30 mm</td> Telescopio de relé <td>Thorlabs</td><td>LB1757-B</td><td>entre 2 galvas</td></tr><tr><td>Lente f = 200 mm</td><td>Telescopio Thorlabs</td><td>LB1945-B</td><td>2.5X</td></tr><tr><td>Lente f = 500 mm</td><td>Telescopio Thorlabs</td><td>LB1869-B</td><td>2.5X</td></tr><tr><td>Montura de espejo elíptico cinemático en ángulo recto con orificios de varilla de jaula roscados</td><td>Periscopio</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1E</td></tr><tr><td>Gafas de seguridad láser, lentes verde claro, 59% de transmisión de luz visible, estilo universal</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>45&deg; AOI, 50.0 mm de diámetro, espejo caliente</td><td>Edmund Optics</td><td>#64-470</td><td></td></tr><tr><td>Emisor multifotónico HC 750/S</td><td>AHF</td><td>HC 750/SP</td><td></td></tr><tr><td>Chasis CompactDAQ</td><td>National Instruments</td><td>cDAQ-9178</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de salida de voltaje de la serie C</td><td>National Instruments</td><td>NI-9263 Módulo de</td><td>salida analógica</td></tr><tr><td>Serie C Módulo de entrada de voltaje</td><td>National Instruments</td><td>NI-9215</td><td>Módulo de entrada analógica</td></tr><tr><td>FluoSpheres Microesferas modificadas con carboxilato, 0,5 y micro; m, rojo fluorescente (580/605), 2% de sólidos Cuentas de</td><td>calibración</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F8812</td></tr><tr><td>C++ (Qt) software</td><td></td><td></td> de pinzas ópticas caseras <td>desarrollado por Olivier Blanc y Claire Chard&egrave;s. Solución alternativa: labview</td></tr></tbody></table>

sondeo de la célula mecánica con pinzas ópticas libres de grano en el embrión de drosophila

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morfogénesis requiere coordinación entre patrones genéticos y las fuerzas mecánicas a robusta forma de las células y los tejidos. Por lo tanto, es un reto entender procesos morfogenéticos directamente medir fuerzas celulares y propiedades mecánicas en vivo durante la embriogénesis. Aquí, presentamos un programa de instalación de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación, que permite para aplicar directamente las fuerzas en los contactos de la célula del embrión temprano de Drosophila , mientras que la proyección de imagen a una velocidad de varios fotogramas por segundo. Esta técnica tiene la ventaja que no requiere la inyección de granos en el embrión, generalmente utilizado como sondas intermedias en el cual se ejercen las fuerzas ópticas. Detalle paso a paso la aplicación de la configuración y proponer herramientas para extraer información mecánica de los experimentos. Mediante el control de los desplazamientos de los contactos de la célula en tiempo real, uno puede realizar mediciones de tensión e investigar la reología de los contactos de la célula.

La figura 5 muestra los datos experimentales obtenidos mediante la imposición de un movimiento sinusoidal a la trampa. La trampa produce una desviación de la interfaz, como por las 3 instantáneas que muestran 3 interfaz sucesivas posiciones (figura 5A)23. Películas grabadas se utilizan para generar un kymograph (figura 5B) y además se analizan para determinar la posición de la...

Presentamos una instalación de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación y su aplicación a la punta de prueba mecánica de la célula sin cuentas en el embrión de Drosophila .

Sondeo de la célula mecánica con pinzas ópticas libres de grano en el embrión de Drosophila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la mecánica de tejido, como cómo las propiedades de los contactos celulares cambian en el espacio y el tiempo durante la morfogénesis tisular. La principal ventaja de esta técnica es que es débilmente invasiva y es compatible con imágenes en vivo como la microscopía de láminas de luz. Esta técnica no requiere la inyección de perlas en el tejido.Usualmente se utilizan como sondas demiere en las que conseguir asos, estoy emocionado. Demostrando el proceso estarán Chardes, un ingeniero, y Raphael Clement, científico de investigación de mi nivel de terreno. Para comenzar, configure un microscopio vertical para la microscopía de lámina de luz en la llanura horizontal, luego prepare el láser y la óptica para que actúen como pinzas ópticas.A continuación, canaliza un micro litro de cuentas fluorescentes de 500 nanómetros en una cubeta de vidrio, y agrega 10 mililitros de agua destilada. Coloque la cubeta en el soporte de la cubeta bajo el objetivo, y ajuste el enfoque del objetivo para que el objetivo toque la superficie del agua. Ahora, abra el entorno de desarrollo integrado QT Creator que se utiliza para controlar el software de a

probing-cell-mechanics-with-bead-free-optical-tweezers-drosophila

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo describe el uso de la microinyección y la imagen de alta resolución en...

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

El cinetocoro es donde el SAC inicia su señal de control de la segregación mitótica de las cromátidas hermanas. Se describe un método para visualizar la contratación y la rotación de una de las kinetochore proteínas y su coordinación con el movimiento de los cromosomas...

El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones Sincitial

Se presenta una técnica para el etiquetado de las neuronas individuales en el sistema nervioso central (SNC)...

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

La falta de herramientas para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo impide validar sus papeles durante el desarrollo. Se emplean microscopía de fuerza atómica (AFM) y nanopartículas de seguimiento para cuantificar características mecánicas en la célula de yema de embrión intacto de pez cebra durante epiboly. Estos métodos son fiables y ampliamente aplicables evitando intervenciones intrusivas.

AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra

Las fuerzas mecánicas son importantes para controlar la migración celular. Este protocolo demuestra el uso de hidrogeles elásticos que se pueden deformar utilizando una micropipeta de vidrio y un micromanipulador para estimular las células con un gradiente de rigidez local para provocar cambios en la estructura celular y la migración.

Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

Aquí se presenta un protocolo para microinyecyar y al mismo tiempo la imagen de múltiples embriones Drosophila durante el desarrollo embrionario utilizando un imager basado en placas y alto contenido.

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo realizar un ensayo mejorado para la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila. Utilizamos el ensayo aquí para demostrar que la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia) existe en las larvas de Drosophila.

Un ensayo mejorado y herramientas para medir la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila

Aquí, presentamos un protocolo para investigar las propiedades mecánicas intracelulares de células embrionarias aisladas de pez cebra en confinamiento tridimensional con medición directa de la fuerza mediante una trampa óptica.

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

En el embrión temprano de Drosophila , muchos orgánulos son móviles. En principio, se pueden obtener imágenes en vivo a través de sondas fluorescentes específicas, pero la cáscara del huevo impide la aplicación directa al embrión. Este protocolo describe cómo introducir tales sondas a través de la microinyección, y luego analizar el movimiento de orgánulos a granel a través de la velocimetría de imagen de partículas.

Visualización del tráfico dependiente de citoesqueletos de orgánulos que contienen lípidos en embriones de Drosophila

La contractilidad de la actomiosina juega un papel importante en la morfogénesis celular y tisular. Sin embargo, es difícil manipular la contractilidad de la actomiosina in vivo de forma aguda. Este protocolo describe un sistema optogenético que inhibe rápidamente la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 en embriones de Drosophila , revelando la pérdida inmediata de la tensión epitelial después de la inactivación de la actomiosina in vivo.

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Estos protocolos describen cómo caracterizar la organización y la función de oclusión de las uniones septadas plisadas en epitelios embrionarios de Drosophila de control y mutantes.

Experimentos de inmunotinción y penetración de colorantes para definir proteínas de unión septata plisadas en el núcleo en epitelios embrionarios de Drosophila

Aprende a medir fuerzas celulares en vivo en embriones de Drosophila usando pinzas ópticas sin microesferas combinadas con microscopía de hoja de luz. Este método permite cuantificar rigidez y tensión tisular durante la morfogénesis.

Sondeo de la célula mecánica con pinzas ópticas libres de grano en el embrión de Drosophila

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