Name: Coincidencia de contraste detergente en Small-Angle Neutron Scattering experimentos para el análisis estructural de la proteína de membrana y modelado Ab Initio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a caracterizar proteínas de membrana mediante dispersión de neutrones a pequeño ángulo (SANS) con etiquetado de deuterio. Este método computacional permite determinar el estado oligomérico, tamaño y forma de proteínas en solución.

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La oficina de biológicos y la investigación ambiental apoyan la investigación en el centro del ORNL para Biología Molecular estructural (CSMB) y Bio-SANS utilizando el apoyo de la división de instalaciones de usuario científica, oficina de ciencias básicas de energía, del Departamento de la energía. Trabajo estructural en las proteínas de membrana en el laboratorio de Lieberman ha sido apoyado por los NIH (DK091357, GM095638) y NSF (0845445).

Los autores Volker S. urbano, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss y Ryan C. Oliver son contratados a través de UT-Battelle con nosotros DOE para apoyar el programa de usuario de ciencia de neutrones y Bio-sin instrumentos en el laboratorio nacional de Oak Ridge en este artículo.
Este manuscrito ha sido co-escrito por UT-Battelle, LLC, bajo contrato DE-AC05-00OR22725 con el nosotros Departamento de energía (DOE). El gobierno estadounidense mantiene y el editor, al aceptar el artículo para su publicación, reconoce que el gobierno estadounidense mantiene una licencia no exclusiva, liberada, irrevocable, en todo el mundo para publicar o reproducir el formulario publicado de este manuscrito o permitir otros a hacerlo, para fines del gobierno de Estados Unidos. DOE proporcionará acceso público a estos resultados de la investigación patrocinada por el gobierno federal según el Plan de acceso público DOE. 82

Investigadores de biología estructural, aprovechando técnicas estructurales complementarias como dispersión de la solución para obtener los datos bioquímicos y estructurales (tales como tamaño y forma) de biomoléculas en solución. SANS es una técnica particularmente atractiva para determinar estructuras de proteínas de membrana de baja resolución, un centro de atención de la moderna biología estructural y bioquímica. SANS requiere cantidades de proteínas purificadas comparables a las de los ensayos cristalográficos (1 mg...

Proteínas de membrana están codificadas por aproximadamente el 30% de todos los genes1 y representan una gran mayoría de objetivos de medicamentos modernos. 2 estas proteínas realizan una amplia gama de funciones celulares vitales,3 pero a pesar de su abundancia e importancia — sólo representan alrededor del 1% de estructuras total depositado en la investigación Collaboratory para bioinformática estructural (RCSB) proteína Banco de datos. 4 debido a su naturaleza parcialmente hidrofóbica, determinación estructural de proteínas de membrana-limite ha sido sumamente difícil. 5 , 6 , 7
Como muchas técnicas biofísicas requieren monodispersa partículas en solución para la medición, aislamiento de proteínas de la membrana de las membranas nativas y estabilización de estas proteínas en un imitador soluble de las membranas nativas ha sido un área activa de investigación en los últimos décadas. 8 , 9 , 10 estas investigaciones han llevado al desarrollo de muchas asambleas de novela anfifílicos para solubilizar proteínas de membrana, tales como nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 y amphipols. 16 , 17 sin embargo, el uso de micelas de detergente sigue siendo uno de los enfoques más comunes y sencillos para satisfacer los requisitos de la solubilidad de una proteína determinada. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 por desgracia, no solo detergente mágica mezcla de detergentes actualmente existe o que cumpla con todas las proteínas de la membrana; así, estas condiciones deben ser defendidas empíricamente para los requerimientos únicos de cada proteína. 26 , 27
Detergentes uno mismo-montan en la solución por encima de su concentración micelar crítica para formar estructuras de agregados llamadas micelas. Micelas están compuestas de muchos monómeros detergentes (típicamente entre 20-200) con cadenas alkyl hidrofóbica formando un núcleo micelar e hidrofílicos grupos cabeza dispuestos en una capa de cáscara de micela hacia el disolvente acuoso. El comportamiento de la formación de la micela y los detergentes ha sido clásicamente descrito por Charles Tanford en El efecto hidrofóbico,28 y tamaños y formas de micelas de los detergentes comúnmente usados en estudios de proteínas de membrana han sido caracteriza usando dispersión de ángulo pequeño. 29 , 30 organización de detergente sobre las proteínas de la membrana también se ha estudiado, y se espera la formación de complejos de proteína-detergente (PDC) con las moléculas de detergente que rodean la proteína en un arreglo que se asemeja al detergente limpio micelas. 31
Añade una ventaja en el uso de detergentes es que las propiedades resultantes de la micela pueden manipularse mediante la incorporación de otros detergentes. Muchos detergentes exhiben mezcla ideal, y seleccione Propiedades de micelas mixtas se pueden incluso predecir de los componentes y la relación de la mezcla. 22 sin embargo, la presencia de detergente puede todavía presentar desafíos para caracterizaciones biofísicas contribuyendo a la señal total. Por ejemplo, con rayos x y técnicas de dispersión de la luz, la señal de detergente en el PDC es prácticamente indistinguible de la proteína. 32 investigaciones con microscopia del cryo-electrón de solo-partícula (cryo-EM) normalmente dependen de atrapadas partículas (congeladas); detalles estructurales de la proteína son todavía oscurecidos por ciertos detergentes o una alta concentración de detergente que se añade a un segundo plano. 33 enfoques alternativos para interpretar la estructura PDC completa (incluyendo el detergente) se han hecho a través de métodos computacionales que pretenden reconstruir el detergente alrededor de una proteína de membrana dada. 34
Para el caso de dispersión de neutrones, el arreglo de core-shell de detergente en la micela produce un factor de forma que contribuye a la dispersión observada. Afortunadamente, se pueden alterar componentes de la solución tal que no contribuyen a la dispersión observada neta. Este proceso de "coincidencia de contraste" se consigue sustituyendo el deuterio por hidrógeno alcanzar una densidad de longitud de dispersión que coincide con el del fondo (buffer). Deben considerarse una elección juiciosa del detergente (con contrapartes deuterados disponibles) y su proporción de la mezcla. De micelas de detergente, esta sustitución puede realizarse usando un detergente con el mismo grupo de cabeza pero con una cadena alquil deuterados (d-cola en lugar de h-cola). Puesto que los detergentes están bien mezclados,35 los agregados tendrán una densidad de longitud de dispersión que es la fracción molar ponderada promedio de los dos componentes (h-colas y colas de d). Cuando este contraste promedio es consistente con el grupo de cabeza, las estructuras agregadas uniforme pueden combinarse completamente para quitar todas las contribuciones a la dispersión observada.
Presentamos aquí un protocolo para manipular el contraste de neutrón de micelas de detergente mediante la incorporación de moléculas detergentes químicamente idénticas con cadenas alkyl marcado con deuterio. 19 , 36 , 37 esto permite completo contraste simultáneo que empareja del núcleo micelar y la cáscara, que es una capacidad única de dispersión de neutrones. 35 , 38 este significativamente refinado nivel de detalle, coincidencia de contraste permiten lo contrario inviables estudios de estructuras de proteínas de membrana. Además, este enfoque de contraste de coincidencia se podría extender a otros sistemas con detergente, como intercambio de polímero reacciones39 y aceite-agua dispersantes,40 o incluso otros agentes solubilizantes, como bicelles,41 nanodiscs,42 o bloque copolímeros. Enfoque similar 43 A como se describe en este manuscrito, pero empleando una sola especie de detergente con sustituciones parciales del deuterio en el grupo alquil de cadena o cabeza, se publicó recientemente. 37 mientras que esto puede ser para mejorar la distribución aleatoria de hidrógeno y deuterio en el detergente en comparación con el enfoque presentado aquí, el número limitado de posiciones disponibles en el detergente para sustitución y dos etapas síntesis de detergente necesaria plantea retos adicionales para su consideración.
Pasos 1 y 2 del protocolo que se detallan a continuación a menudo se superponen puesto que el experimento inicial planificación debe hacerse para presentar una propuesta de calidad. Sin embargo, la presentación de propuesta se considera aquí como el primer paso para destacar que este proceso debe comenzar antes de un experimento de neutrones. Cabe señalar que un paso necesario, que debe ser demostrado por la propuesta, es que la caracterización bioquímica y física (incluyendo la pureza y estabilidad) de la muestra apoya la necesidad de estudios de neutrones. Una discusión general de ángulo pequeño neutrón dispersión (SANS) está fuera del alcance de este artículo. Una introducción breve pero exhaustiva está disponible en la obra de referencia de Caracterización de materiales por Kaufmann,44 y una solución integral de libros de texto enfocada en biológico ángulo pequeño dispersión ha sido publicado recientemente. 45 más lectura recomendada es dada en la sección de discusión. Dispersión de ángulo pequeño utiliza el llamado vector de dispersión Q como la cantidad central que describe el proceso de dispersión. Este artículo utiliza la definición ampliamente aceptada Q = 4π pecado (θ) / λ, donde θ es la mitad el ángulo entre la viga entrante y dispersa y λ es la longitud de onda de la radiación de neutrón en Angstroms. Existen otras definiciones que uso diferentes símbolos tales como ' por el vector de dispersión y que puede variar por un factor 2π o mediante nanómetros en lugar de Angstrom (véase también discusión de la figura 10).

<table><tbody><tr><td>Concentrador Amicon Ultra MWCO 50KDa&nbsp;</td><td>EMD Millipore UFC905096</td><td></td><td>material de laboratorio</td></tr><tr><td>Citrato de amonio dibásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A663</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>EMD Millipore</td><td>2150</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Sistema de biorreactor Bioflo 310</td><td>Equipo Eppendorf</td><td>M1287-2110</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Acros</td><td>423525000</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02025</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>EMD Millipore</td><td>3130</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Cloruro de cobalto (II)</td><td>Acros</td><td>AC21413-0050</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II)</td><td>Acros</td><td>AC19771-1000&nbsp;</td><td>Componente medio</td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>756822</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Purificador de gas de drierita</td><td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td><td>27068</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disodio, dihidrato</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Emulsiflex-C3</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td>equipo</td></tr><tr><td>&Auml; purificador kta UPC100</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td>equipo</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR columna</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17116701</tr><tr><td>Imidazol</td><td>VWR</td><td>97064-622</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Teknova</td><td>I3325</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (III) hexahidratado</td><td>MP Biochemicals</td><td>ICN19404590</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Sulfato de manganeso (II) monohidrato</td><td>Acros</td><td>AC20590-5000</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Agitador Incubado/Refrigerado</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7&nbsp;</td><td>equipo</td></tr><tr><td>n-Dodecil-d25-&beta;-D-maltopirranósido</td><td>Anatrace</td><td>D310T</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil-&beta;-D-maltopirranósido</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Centrífuga RC 6 Plus</td><td>Equipo Thermo Scientific Sorvall</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Tabletas de cóctel de inhibidores de proteasa SIGMAFAST, Sin EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa estéril de 25 mm con 0.2&micro; m Membrana PES</td><td>VWR</td><td>28145-501 material de</td><td>laboratorio</td></tr><tr><td>Filtro estéril desechable para botellas con 0.2&micro; m membrana PES</td><td>Thermo Scientific</td><td>596-4520&nbsp;</td><td>Material de laboratorio</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Cuidado de la salud&nbsp;</td><td></td><td></td>17517501</tr><tr><td>Columna Superose-12 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Cuidado de la salud&nbsp;</td><td></td><td></td>17517301</tr><tr><td>Ultrospec 10 Densímetro de celdas GE</td><td>Healthcare&nbsp;</td><td>80211630</td><td>equipo</td></tr><tr><td>Sulfato de zinc monohidratado</td><td>Acros</td><td>AC38980-2500&nbsp;</td><td>Componente medio</td></tr></tbody></table>

coincidencia de contraste detergente en small-angle neutron scattering experimentos para el análisis estructural de la proteína de membrana y modelado ab initio

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

El instrumento de dispersión biológica small-angle neutron en el alto flujo isótopo Reactor de Oak Ridge National Laboratory se dedica a la investigación de materiales biológicos, biocombustible procesado y materiales Bioinspirados cubriendo nanómetro a escalas de la longitud del micrómetro. Los métodos presentados aquí para investigar las propiedades físicas (es decir, tamaño y forma) de proteínas de membrana (aquí, MmIAP, una intramembranosas aspartil proteasa de Methanoculleus marisnigri) en soluciones de formación de micelas son detergentes adecuado de este instrumento de dispersión de ángulo pequeño neutrón, entre otros. Otras técnicas de caracterización biofísica se ven obstaculizados por su incapacidad para abordar las contribuciones detergentes en una estructura compleja de proteína-detergente. Además, el acceso al laboratorio Bio-grado de deuteración ofrece capacidades únicas para la preparación de cultivos a gran escala y expresión de proteínas marcado con deuterio para mayor dispersión de la señal de la proteína. Mientras que esta técnica no proporciona los detalles estructurales en alta resolución, la brecha de conocimiento estructural de proteínas de la membrana contiene muchas zonas direccionables de investigación sin necesidad de resolución atómica cerca. Por ejemplo, estas áreas incluyen la determinación de los Estados, formación de complejos, cambios conformacionales durante la perturbación y eventos plegar/desplegar. Estas investigaciones se pueden lograr fácilmente a través de aplicaciones de este método.

Una propuesta de instrumento y tiempo de viga debe transmitir claramente toda la información necesaria al Comité de revisión para que se puede hacer una evaluación válida del experimento propuesto. Comunicación con un NSS es altamente sugerido para usuarios inexpertos. El SNA puede evaluar viabilidad inicial y presentación de propuesta de guía para enfatizar el potencial para la ciencia de alto impacto, viabilidad y seguridad. La información proporcionada en la propuesta debe incluir info...

Este protocolo muestra cómo obtener un modelo de baja resolución ab initio y detalles estructurales de una proteína de membrana de detergente solubilizado en solución mediante dispersión de neutrones de ángulo pequeño con coincidencia de contraste del detergente.

Coincidencia de contraste detergente en Small-Angle Neutron Scattering experimentos para el análisis estructural de la proteína de membrana y modelado Ab Initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las proteínas de membrana integral como el estado oligomérico, su tamaño, forma general y estructura de baja resolución en solución. Los estudios de soluciones de proteínas de membrana requieren estabilizar moléculas como detergentes. Esta técnica tiene la ventaja de que hace que los detergentes sean invisibles y resalta la señal de la proteína de membrana.Las implicaciones de esta técnica se extienden a muchas preguntas de investigación biológica y médica porque más de 1/3 de proteínas residen en membranas donde realizan muchas funciones celulares vitales. La demostración visual de este método es fundamental ya que el etiquetado de deuterio y los pasos de dispersión de neutrones son difíciles de aprender porque muy pocas instituciones ofrecen capacitación en estas técnicas. Para empezar, determine las densidades de longitud de dispersión de neutrones o SLD utilizando la aplicación web MULCh, módulos para el análisis de datos de variación de contraste.Abra el módulo de contraste haciendo clic en contraste situado en el panel de navegación izquierdo. Proporcione texto para un título de proyecto e introduzca los detalles sigu

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Muchas proteínas realizan su función cuando se unen a las superficies de las membranas. La unión de proteínas extrínsecas en membranas de nanodiscos se puede obtener indirectamente mediante microscopía electrónica de transmisión. Demostramos que el apilamiento característico (rouleau) de los nanodiscos inducido por la tinción negativa de fosfotungstato de sodio se previene mediante la unión de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Estructuras de conjuntos supramoleculares proteína a resolución atómica son de alta relevancia debido a su papel crucial en una variedad de fenómenos biológicos. Adjunto, presentamos un protocolo para llevar a cabo estudios estructurales de alta resolución en asambleas de proteína macromolecular insoluble y no-cristalino magic-angle spinning estado sólido de resonancia magnética nuclear espectroscopia (MAS SSNMR).

Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

Se presenta un protocolo optimizado para realizar una amplia caracterización bioquímica y estructural de una proteína de unión a sustrato de carbohidratos de Streptococcus pneumoniae .

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Este método describe el clonaje, expresión y purificación de Nsa1 recombinantes para la determinación estructural por cristalografía de rayos x y dispersión de rayos-x de ángulo pequeño (SAXS) y es aplicable para el análisis estructural híbrido de otras proteínas que contiene tanto había ordenado y desordenado dominios.

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Se describe un protocolo para la detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana mediante la Unión del receptor de la clasificación, sortilina, para el primer bucle luminal de la proteína del transportador de glucosa, GLUT4, como ejemplo.

Detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana

Aquí, presentamos cómo la dispersión de rayos-x en ángulo pequeño (SAXS) pueden ser utilizados para obtener información en sobres baja representación de las estructuras macromoleculares. Cuando se utiliza en conjunción con alta resolución estructurales técnicas como la cristalografía de rayos x y resonancia magnética Nuclear, SAXS puede proporcionar penetraciones detalladas en dominios múltiples proteínas y complejos macromoleculares en solución.

Estudios estructurales de las macromoléculas en solución mediante dispersión de rayos-x de ángulo pequeño

Aquí se presenta un protocolo para la determinación del estado oligomérico de las proteínas de membrana que utiliza un sistema de nanopartículas de membrana celular nativa junto con microscopía electrónica.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análisis de interacción proteína-proteína de membrana

El presente protocolo describe métodos para investigar la estructura y la dinámica de dos proteínas modelo que tienen un papel importante en la salud humana. La técnica combina la caracterización biofísica de sobremesa con la espectroscopia de eco de espín de neutrones para acceder a la dinámica en escalas de tiempo y longitud relevantes para los movimientos entre dominios de proteínas.

Estudio de la dinámica de proteínas a través de la espectroscopia de eco de espín de neutrones

Este artículo describe los protocolos para la preparación de muestras, la reducción de datos y el análisis de datos en estudios de eco de espín de neutrones (NSE) de membranas lipídicas. El etiquetado juicioso de los lípidos con deuterio permite el acceso a diferentes dinámicas de membrana en escalas de longitud y tiempo mesoscópicas, sobre las cuales ocurren procesos biológicos vitales.

Espectroscopía de eco de espín de neutrones como una sonda única para la dinámica de la membrana lipídica y las interacciones membrana-proteína

La espectroscopia de retrodispersión de neutrones ofrece un acceso no destructivo y sin etiquetas a la dinámica ps-ns de las proteínas y su agua de hidratación. El flujo de trabajo se presenta con dos estudios sobre proteínas amiloides: sobre la dinámica resuelta en el tiempo de la lisozima durante la agregación y sobre la dinámica del agua de hidratación de tau en la formación de fibra.

Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación

Este estudio describe el procedimiento para reconstituir el canal K+ sensible a ácidos relacionado con la proteína de membrana TWIK (Task2) en nanodiscos. El ensamblaje exitoso fue confirmado mediante crio-microscopía electrónica de partícula única, que proporcionó promedios bien definidos de clase bidimensionales.

Una técnica para estabilizar proteínas de membrana en nanodiscos

Aprende a caracterizar proteínas de membrana mediante dispersión de neutrones a pequeño ángulo (SANS) con etiquetado de deuterio. Este método computacional permite determinar el estado oligomérico, tamaño y forma de proteínas en solución.

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