Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

El objetivo general de este procedimiento es observar el ensamblaje dinámico de complejos proteicos en diferentes entornos de pH utilizando interferometría de biocapas y confirmar los componentes mediante microscopía electrónica y espectrometría de masas. Identificar y comprender la especificidad que gobierna la formación y el ensamblaje de complejos de proteínas es de sumo interés para los investigadores bioquímicos. La metodología de la que hablamos hoy permite a los investigadores ensamblar, visualizar y validar los complejos macromoleculares predichos.

La naturaleza compleja de la superficie del biosensor permite a los investigadores liberar fácilmente complejos ensamblados en pequeños microvolúmenes para el análisis de microscopía electrónica y espectrometría de masas. En esta demostración, seguimos la cinética de los reordenamientos estructurales inducidos por el pH del complejo de toxina del ántrax y verificamos estos reordenamientos mediante métodos de microscopía electrónica y espectrometría de masas, evitando la agregación. Alexandra Machen y Pierce O'Neil, estudiantes graduados de mi laboratorio, demostrarán el ensamblaje de la toxina del ántrax en la superficie del biosensor BLI, la liberación de macromuestras y los procedimientos de tinción EM negativos.

El Dr. Antonio Artigues es fundamental en el análisis e identificación de las micromuestras liberadas por BLI, utilizando el espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos. Para empezar, hidrata una punta de biosensor BLI de segunda generación reactiva a las aminas sumergiéndola en 250 microlitros de agua e incubándola durante 10 minutos. En el software Blitz, programe los tiempos de paso como se indica en esta tabla.

Comience la ejecución de BLI sumergiendo la punta del biosensor en 250 microlitros de agua durante 30 segundos para medir una línea de base inicial del grosor y la densidad del biosensor. A continuación, active el biosensor sumergiendo la punta en 250 mililitros de NHS de 50 milimolares y EDC de 200 milimolares durante siete minutos. A continuación, sumerja el biosensor activado en 50 milimolares de PDEA disuelto en tampón de borato 0,1 molar, pH 8,5, durante cinco minutos para generar una superficie biorreactiva activada.

Ahora, sumerja el biosensor biorreactivo activado en 250 microlitros de una solución que contenga 100 nanomolares E126C LFn en 10 milimolares de acetato de sodio pH cinco, 100 milimolares de tampón de cloruro de sodio durante cinco minutos. Sumerja la punta LFn en L-cisteína 50 milimolares, cloruro de sodio 1 molar, acetato de sodio 0,1 molar pH cinco durante cuatro minutos para apagar los grupos reactivos tioles libres restantes. Después de sumergir la punta de LFn templada en 50 milimolares de Tris, 50 milimolares de cloruro de sodio para establecer la línea de base del tampón, sumerja la punta en 0,5 micromolares de antígeno protector prepore, 50 milimolares de Tris, 50 milimolares de cloruro de sodio durante cinco minutos para crear el complejo LFn PA-prepore.

Una vez que se haya asociado el preporo de PA, retire la punta de la solución de prepore de PA y sumerja la punta en cloruro de sodio Tris de 50 milimolares y 50 milimolares durante 30 segundos para lavar cualquier prepora de PA no unida específicamente. Sumerja el complejo LFn PA-prepore en CMG2 de 0,5 micromolares en 50 milimolares de Tris, 50 milimolares de cloruro de sodio durante cinco minutos. Sumerja el complejo CMG2 LFn PA-prepore en 50 milimolares de Tris, 50 milimolares de cloruro de sodio durante 30 segundos para lavar cualquier CMG2 no unido y formar un complejo preendosomal.

Para el análisis EM, libere el complejo LFn PA-prepore CMG2 de la punta del biosensor sumergiendo la punta en un tubo de PCR que contenga cinco microlitros de 50 milimolares de DTT, 50 milimolares de Tris y 50 milimolares de cloruro de sodio. Para el análisis MS en tándem de los péptidos del complejo, libere el complejo LFn PA-prepore CMG2 de la punta del biosensor sumergiendo el biosensor en un tubo de PCR que contenga cinco microlitros de DTT de 50 milimolares, clorhidrato de guanidina sin queratina de seis molares y bicarbonato de amonio de 25 milimolares, pH ocho. Para ver el complejo después de la transición de pH, ensamble el complejo LFn PA-prepore CMG2 en el biosensor, como se acaba de demostrar.

Sumerja la punta del biosensor en acetato de 10 milimolares pH cinco durante cinco minutos para iniciar la transición del preporo de PA al poro de PA. Esta transición está indicada por un aumento de la amplitud, seguido de una mayor disminución de la amplitud que se supone que es sustancial para la disociación completa del receptor debido a la disminución de la afinidad de unión. Para el análisis EM, sumerja la punta del biosensor en una solución que contenga 1,25 micelas milimolares durante cinco minutos, para evitar la agregación en la solución después de la liberación de disulfuro.

Para llevar a cabo la microscopía electrónica de tinción negativa, comience descargando una rejilla de cobre 300 recubierta de carbono a una presión de atmósfera estable de 0,38 milibares y menos 15 miliamperios durante 20 segundos, luego ventile el dispositivo con aire. Asegure la rejilla entre un par de pinzas limpias. A continuación, pipetee cuatro microlitros de la muestra compleja liberada en la rejilla y permita la adsorción durante 60 segundos.

Con una cuña de papel de filtro, absorba el líquido restante. A continuación, tiñe la rejilla pipeteando cinco microlitros de formiato de uranilo filtrado de dos micras al 0,75% punto cero y, después de cinco segundos, absorbe el exceso de mancha. Deje que la rejilla se seque a temperatura ambiente mientras está cubierta.

A continuación, utilice el microscopio electrónico de transmisión para ver la muestra. Finalmente, después de preparar las muestras para la espectrometría de masas de acuerdo con el protocolo de texto, opere el espectrómetro de masas utilizando CID y una energía de colisión normalizada de 35 bajo control automático para realizar continuamente un escaneo MS, seguido de tantos escaneos MS-MS en tándem como sea posible en un período de tres segundos. El rastro del sensograma BLI es una lectura en tiempo real de los cambios de amplitud debidos a la adición específica de los componentes de la toxina del ántrax.

La primera subida es la carga de LFn en la punta. Después del enfriamiento y la línea de base, PA-prepore se une a LFn, seguido de la adición de CMG2 soluble, lo que da como resultado el complejo preendosomal ensamblado. A continuación, el complejo se somete a un pH bajo que debilita la unión al receptor y da lugar a la transición del preporo a su confirmación de poro extendido que se confirma mediante la adición de micelas.

Aquí se muestran imágenes EM de tinción negativa de complejos al liberarse del biosensor. Las cuadrículas de muestras preendosomales mostraron densidades consistentes con complejos ternarios intactos que consisten en LFn PA-prepore CMG2. Las rejillas complejas posteriores a la acidificación muestran PA en transición a poro y solubilizado por inclusión de micelas sin una densidad obvia de CMG2.

Según lo visto por MS, que confirmó los complejos de proteínas, las muestras de MS preendosomales contenían péptidos de los tres componentes de la toxina con una cobertura del 60,46, 67,97 y 54,15% para LFn, PA y CMG2 respectivamente. Las muestras postendosomales solo contenían péptidos de LFn y PA. La falta de CMG2 es consistente con la disminución nanométrica de BLI observada durante la formación de poros. La capacidad de monitorear y validar el ensamblaje de grandes complejos de macromoléculas es un paso crucial hacia la comprensión de la especificidad y funcionalidad de grandes ensamblajes biomoleculares.

Nuestra capacidad de liberar complejos macromoleculares preensamblados de biosensores en microvolúmenes para la visualización de microscopía electrónica será extremadamente útil para el análisis de estructuras. Nuestro análisis de la composición de los complejos de ensamblaje de biosensores solo utilizó 0,04 femtomoles del complejo de liberación para identificar sus componentes antes y después de la acidificación endosomal asimilada. El protocolo de liberación del ensamblaje de biosensores se puede adaptar para seguir las transiciones endosomales naturales pero elusivas inducidas por el pH de otras toxinas bacterianas en las estructuras de proteínas virales, con la ventaja adicional de evitar la agregación de proteínas.