Reversión química de células madre pluripotentes humanas convencionales a un estado ingenuo con potencia mejorada del Multilineage diferenciación

El método LIF-3i reconvierte las células madre pluripotentes humanas convencionales en un estado pluripotente más primitivo con características bioquímicas, transcripcionales y epigenéticas del epiblasto humano pre-implantación. Este método mejora la funcionalidad de las células madre pluripotentes humanas convencionales al disminuir la expresión génica de linaje pre-primado y eliminar la variabilidad entre líneas de células madre pluripotentes humanas (hPSC) independientes comúnmente observada en la diferenciación dirigida. Utilizando este método, las células madre pluripotentes humanas revertidas químicamente mantienen la estabilidad karyotípica y epigenómica después del paso extendido, incluso en loci impresos y pueden diferenciarse directamente con mayor eficiencia sin requerir un paso de re-priming.

El método LIF-3i abrirá nuevas vías de investigación en la biología del desarrollo humano temprano y puede avanzar la medicina regenerativa mejorando la diferenciación de células madre pluripotentes humanas, el direccionamiento génico y la generación de quimeras interespecies. Para comenzar el protocolo, mantenga y expanda células madre pluripotentes humanas convencionales o hPSC con cariotipos normales validados en co-cultivos con un fibroblasto embrionario de ratón o sistema de cultivo alimentador basado en MEF o en un sistema de cultivo libre de alimentadores. Prepare alimentadores MEF en una placa de seis pozos gelatinizada preparada previamente al menos un día antes de pasar las culturas hPSC convencionales adaptadas a LIF-5i.

Después de que las culturas hPSC convencionales hayan alcanzado aproximadamente el 50% de confluencia, reemplace el medio de cultivo hESC estándar con dos mililitros por pozo de medio de Factor Inhibidor de Leucemia 5i o LIF-5i. Cultive y mantenga las hPSC convencionales y MEF hasta por dos días en LIF-5i en un incubador de CO2. Cambie el medio LIF-5i diariamente para adaptarlos a su pasaje posterior y reversión estable en LIF-3i.

Para los cultivos convencionales libres de alimentadores, cultive hPSC en LIF-5i solo durante una noche antes de pasar al día siguiente. Antes de pasar, lave las hPSC convencionales adaptadas a LIF-5i una vez con PBS y agregue un mililitro de reactivo de disociación celular a cada pozo. Luego, incube la placa durante cinco minutos a 37 grados Celsius en un incubador de CO2.

Después de la incubación, triture suavemente las células con una pipeta en una suspensión de células individuales. Recolecte la suspensión celular en el medio hESC en al menos una dilución de dos veces en un tubo cónico estéril de 15 mililitros y triture suavemente las células pipeteándolas para obtener una suspensión de células individuales. Centrifugue las células a 300 g durante cinco minutos.

Después del centrifugado, aspire y descarte el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en uno a dos mililitros de medio LIF-5i. Luego, cuente las células. Lave la placa MEF pre-plaqueada de seis pozos dos veces con dos mililitros de PBS por pozo.

Distribuya de uno a dos veces 10 al sexto células en dos mililitros de medio LIF-5i en un pozo de la placa MEF lavada con PBS. Coloque la placa en un incubador de CO2. Al día siguiente, agite suavemente la placa para levantar todas las células no adheridas y aspire el medio y reemplace el medio con dos mililitros de medio LIF-5i.

Repita este paso diariamente durante tres a cinco días o hasta que las células estén entre 60 y 70% confluentes. Este protocolo soporta una reversión rápida y masiva similar a la inocencia de un amplio rango de líneas de células madre pluripotentes embrionarias y pluripotentes inducidas humanas siempre que las preparaciones de células madre pluripotentes humanas con diferenciación marcada o cariotipos anormales se excluyan meticulosamente. Después de la adaptación inicial a LIF-5i, pase las culturas LIF-3i estables subsiguientes cada tres a cuatro días en un gabinete de bioseguridad o cuando las culturas alcancen entre el 60 y 70% de confluencia.

Deseche el medio de cultivo y lave cada pozo de las culturas LIF-5i-LIF-3i agregando suavemente dos mililitros de PBS. Deseche el PBS y agregue un mililitro de solución de desprendimiento celular. Incubar las células durante cinco minutos a 37 grados Celsius en un incubador de CO2.

Después de la incubación, recolecte la suspensión celular, agregue medio hESC no tratado en una dilución de dos veces y triture suavemente las células pipeteándolas para obtener una suspensión de células individuales. Transfiera la suspensión a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Centrifugue las células a 300 g durante cinco minutos y aspire y deseche el sobrenadante.

Resuspenda el pellet en medio LIF-3i, luego cuente las células. A continuación, plaque dos veces 10 al quinto células por pozo en el MEF irradiado en la placa de seis pozos gelatinizada para el pasaje rutinario de las culturas LIF-3i. Para las culturas adaptadas inicialmente a LIF-5i, coloque una densidad inicialmente más alta antes del primer pasaje en MEF LIF-3i.

Las líneas individuales de células madre pluripotentes humanas deben optimizarse y ajustarse a altas densidades de placado inicial si es necesario para mantener el pasaje continuo masivo durante los primeros pasajes de la cultura de reversión LIF-3i. Vuelva a plaquear y distribuya las hPSC adaptadas a LIF-5i en placas alimentadoras MEF irradiadas frescas lavadas con PBS en el medio LIF-3i. Reemplace el medio LIF-3i diariamente.

Pase N-hPSC durante al menos cuatro a siete pasajes continuos masivos en el medio LIF-3i antes de usar N-hPSC en estudios funcionales o criopreservación. Registre el número de pasajes de N-hPSC en medio convencional o LIF-3i. Las tinciones inmunofluorescentes y los western blot detectaron la expresión de los isoformas activados fosforilados y totales de STAT3 y Erk1/2, marcadores clave de pluripotencia molecular.

Las tinciones de hematoxilina y eosina de las microsecciones de teratoma revelaron una diferenciación robusta en las tres capas germinales con linajes de ectodermo, mesodermo y endodermo bien estructurados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo revertir eficientemente las células madre pluripotentes humanas convencionales en masa a un estado similar a la inocencia utilizando el método químico secuencial universal LIF-5i a LIF-3i. Antes de intentar este protocolo, es importante comenzar con una baja pasaje de líneas de células madre pluripotentes humanas convencionales que se ajusten a cariotipos normales.

Las culturas de células madre pluripotentes humanas convencionales deben estar en su mayoría indiferenciadas y contener pocas células diferenciadas espontáneamente antes de comenzar. El paso inicial y breve de adaptación a LIF-5i mejora significativamente la expansión clonal de las células madre pluripotentes humanas convencionales y permite que sean revertidas posteriormente a la inocencia con LIF-3i solo en cantidades masivas, obviando así la necesidad de seleccionar o subclonar colonias raras de células madre pluripotentes humanas inocentadas más adelante. La optimización adicional de este método químico que utiliza inhibidores de tankirasa en condiciones de cultivo GMP definidas y libres de alimentadores facilitará la generación eficiente y clínicamente útil de una amplia gama de tipos celulares funcionales y engraftables para uso terapéutico.