Name: Un modelo murino de osteogénesis de la distracción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T12:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Aprenda osteogénesis por distracción en ratones usando un distractor personalizado para regeneración ósea. Este modelo permite analizar en detalle los mecanismos de curación de tejidos duros y blandos.

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Los autores agradecen a la Sra. Makiko Kato para proporcionar estímulo a completar este estudio. También agradecemos a la división de animales de experimentación e investigación médica ingeniería, Nagoya University Graduate School of Medicine, para la vivienda de los ratones.

Todos los experimentos se llevaron a cabo según los protocolos aprobados por el cuidado Animal y el Comité de uso de nuestra institución. Esterilizar todos los instrumentos antes del procedimiento.
1. preparación de un molde para crear el Distractor a medida
<ol><li>Hacer dos anillos incompletos (diámetro exterior, 20 mm; diámetro interior, 10 mm), que forman parte del distractor, con una hoja de cera de parafina (145 mm x 74 mm) utilizando un carver cera de Evans.<ol>
<li>Hacer 4 de las mismas piezas. Use una espátula de cera calentada con un mechero de gas. Pila de los cuatro aros para un espesor de 5 mm proporciona espacio para el tornillo de la extensión y la aguja, 8 x 2 mm y 5 mm x 2 mm respectivamente con el escultor de cera Evans (figuras 1A, 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incorporar patrones de cera en el material de impresión de silicona y crear un molde para los aros de resina (figura 1C).</li>
	<li>Después de curado el material de impresión de silicona (aproximadamente 5 min a temperatura ambiente), quite los patrones de cera.</li>
</ol>2. producción del Distractor a medida
<ol><li>Aplique petrolato fino y uniformemente en el molde de silicona. 3 g de la resina dental de polimerización de la mezcla y viértala inmediatamente en el molde de silicona. Set de 5 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Desmoldar el anillo de la resina polimerizada y pulirlo con una barra de carburo y un micromotor dental para quitar las rebabas (1 min.). Dos anillos de resina se requieren para cada distractor por encargo.<ol>
<li>Repita el procedimiento para crear la cantidad necesaria de anillos de resina (figura 1D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deje una separación de unos 2 mm para fijar los anillos de resina con cera de utilidad y fije el tornillo de expansión totalmente con resina transparente. Establecer la resina por 5 min a TA. Cuando la polimerización se completa, quite la perilla de tornillo de expansión (figura 1E).</li>
</ol>3. protocolo quirúrgico
<ol><li>Uso de ratones machos de 8 semanas de edad.</li>
	<li>Inducir la anestesia con una inyección intraperitoneal de hidrocloruro de medetomidina en 0.3 mg/g, midazolam a 4 mg/kg y el tartrato de butorfanol en 5 mg/kg de peso corporal.<ol>
<li>Cuidadosamente afeitado y desinfectar la zona quirúrgica con solución de yodo al 10% y luego, administrar clorhidrato de lidocaína 0.5% en el miembro inferior derecho.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hacer una incisión cutánea longitudinal (aproximadamente 15 mm de longitud) en la parte derecha inferior de la pierna con un bisturí no. 15. Sin rodeos se separan los músculos, teniendo cuidado de no para quitar todos del periostio. Acercarse desde el exterior para llegar en el peroné. Corte el peroné con tijeras.</li>
	<li>Sujete el tobillo con estrechas finas pinzas estériles y utilizar una aguja de 27 G estéril hacer un orificio en el hueso alrededor de 5 mm desde el talón. La aguja debe penetrar en la piel, hueso y piel en ese orden. Cuando la aguja penetra, cortar la punta y la raíz con una pinza para que la aguja es de unos 15 mm.<ol>
<li>Hacer otro agujero de la misma manera, unos 2 – 3 mm proximal. Mantenga alrededor del tobillo y pasar dos agujas 25 G debajo de la rodilla de la misma manera. Después de que las agujas penetran, cortar las puntas y las raíces con una pinza (figura 1F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el distractor a medida que sea paralelo a la dirección de extensión. Fijar las agujas y el dispositivo con suficiente resina dental de polimerización para llenar las ranuras del aparato. Espere la polimerización completar (aproximadamente 5 min) (figura 1G).</li>
	<li>Tenga cuidado de no dañar los tejidos circundantes. Cortar la mitad de la diáfisis de la tibia utilizando un disco de corte muy fino mientras se aplica una solución salina (1 – 2 mL).</li>
	<li>Cerrar la herida con una sutura de nylon 4-0.</li>
	<li>Dar inyecciones subcutáneas de buprenorfina (0.1 mg/kg) para la analgesia inmediatamente después de la operación. Continuar cada 12 h por día postoperatorio 7 y, según sea necesario después de eso la buprenorfina.</li>
</ol>4. distracción protocolo
Nota: Hay diversos informes sobre la tasa de distracción y período de latencia, pero aquí, se muestran los protocolos de representante.
<ol><li>Después de un período de latencia de 5 días, iniciar la distracción a un ritmo de 0.2 mm/12 h. Para la extensión, utilice el perno conectado al tornillo de expansión rápida. Mueva el pasador en la dirección de la flecha amarilla conectada al tornillo de extensión (figura 1E).</li>
	<li>No es necesaria anestesia durante la extensión. Sujete la cola con el dedo meñique y la palma y fije el dispositivo de extensión con el índice y el pulgar.</li>
	<li>Realizar extensión (0,2 mm para 1/4 vuelta). Continuar alargando durante 8 días, que dará como resultado un espacio total de 3,2 mm.</li>
</ol>5. Análisis
<ol><li>Análisis de la radiografía: después de la terminación de la extensión, evaluar la regeneración ósea con tomografía computada bajo anestesia general mediante el uso de isoflurano de 2.0%. Nota: Si se ha cuidado en cuanto a la posición del dispositivo de extensión, es posible evaluar con la radiografía simple aún con el dispositivo conectado.</li>
	<li>Análisis histológico: Retire el aparato con cuidado para no causar un sitio de distracción de la fractura durante el muestreo. Fijar la muestra en formalina tamponada neutra 10% durante 24 h a temperatura ambiente. Descalcificación con solución de Morse (citrato de sodio 10%, 20% de ácido fórmico) durante la noche a 4 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Watson, J. T. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/jaaos/Fulltext/2006/00001/Distraction_Osteogenesis.37.aspx">Distraction osteogenesis.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).</li>
<li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues%3A+Part+II.+The+influence+of+the+rate+and+frequency+of+distraction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).</li>
<li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18184809">Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).</li>
<li>Fujio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1+enhances+distraction+osteogenesis-mediated+skeletal+tissue+regeneration+through+the+recruitment+of+endothelial+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors.</a> Bone. 49 (4), 693-700 (2011).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+expression+during+mandibular+distraction+osteogenesis%3A+evidence+for+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction.</a> Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).</li>
<li>Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-+related+kinase+and+bone+morphogenetic+protein+expression+during+distraction+osteogenesis+of+the+mandible%3A+in+vivo+evidence+of+mechanotransduction+mechanism+for+differentiation+and+osteogenesis+by+mesenchymal+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).</li>
<li>Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11062353">A murine model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 27 (5), 661-665 (2000).</li>
<li>Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+and+molecular+analyses+of+distraction+osteogenesis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model.</a> Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).</li>
<li>Carvalho, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+angiogenesis+in+a+murine+tibial+model+of+distraction+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 34 (5), 849-861 (2004).</li>
<li>Osawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+FGFR3+promotes+bone+formation+via+accelerating+endochondral+ossification+in+mouse+model+of+distraction+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 105, 42-49 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cuando un animal de gran tamaño se utiliza como un modelo experimental, puede usarse un dispositivo de extensión del ready-made, y es fácil de obtener buena fijación y evaluar la operación de extensión sí mismo y la cantidad de extensión. Sin embargo, cuando un ratón se utiliza como un modelo experimental, es necesario desarrollar algunos o todo el equipo. Isefuku et al. y Tay et al dispositivo y crearon un ratón modelo7,8. Carvahjo et al.</...

Distracción osteogénica (DO) es un método de tratamiento establecido para una variedad de trastornos esqueléticos, tales como las discrepancias de longitud de extremidades, defectos óseos y deformidades de extremidades1. Esta estrategia de tratamiento único se basa en el "principio de tensión-estrés" propuesto por Ilizarov. El método requiere varios días de latencia, distracción activa varias semanas y varios meses para la consolidación de hasta el hueso maduro formado2.
Las condiciones hipóxicas locales debido a la obstrucción de sangre flujo3,4 y5,de estimulación mecánica6 son particularmente importantes en el proceso de. Angiogénesis inducida por la hipoxia lleva oxígeno, nutrientes, factores solubles y células necesarias para la reparación de los tejidos localmente a través del flujo de sangre. Estimulación mecánica por la operación de extensión provoca reacciones biológicas como la diferenciación de células madre mesenquimales, formación del hueso, calcificación y remodelación. Tratamiento serial permite la formación de tejidos duros, sino también los tejidos blandos, incluyendo los nervios, músculos, vasos sanguíneos y tejidos de la piel, sin necesidad de trasplante de células madre. Por lo tanto, un modelo se considera un excelente modelo para el análisis de la regeneración de diversos tejidos.
Perros y conejos son los animales más utilizados en la investigación básica para hacer; sin embargo, hay algunas herramientas de análisis disponibles para estos animales. El uso de un modelo del ratón facilita un análisis más detallado. Es particularmente conveniente para los experimentos con ratones knockout. Sin embargo, al usar un ratón como un animal experimental, se debe crear un dispositivo de extensión. Aquí, presentamos un ratón tibial modelo desarrollado utilizando un distractor a medida creado utilizando una herramienta de laboratorio dental y técnica, que se ha utilizado en un estudio anterior.

<table><tbody><tr><td>Cera de parafina</td><td>YAMAHACHI DENTAL MFG. CO.</td><td>-</td><td>Para la preparación un molde para anillos de resina</td></tr><tr><td>Masilla Labocone</td><td>GC</td> <td>Corporation-Para</td> <td>la preparación un molde para anillos de resina</td></tr><tr><td>Cera utilitaria</td><td>GC</td> <td>Corporation-Para</td> <td>la preparación un molde para anillos de resina</td></tr><tr><td>Tornillo de expansión</td><td>Ortho Dentaurum</td><td>600-301-30</td><td>Componente de distractor a medida</td></tr><tr><td>Unifast III</td><td>GC Corporation</td><td>-</td><td>Resina de polimerización inmediata Componente de distractor a medida</td></tr><tr><td>Ortho Crystal</td><td>NISSIN-Resina</td><td></td> <td>transparente Componente de distractor a medida</td></tr><tr><td>aguja de 25 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2516R</td><td>Para distractor a medida</td></tr><tr><td>aguja de 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>Para distractor a medida</td></tr><tr><td>Ratón ICR</td><td>Chubu Kagaku Shizai</td> <td>Corporation-Experimental</td><td> animal</td></tr><tr><td>Somnopentyl</td><td>Kyoritsu</td> Seiyaku-Pentobarbital <td></td><td>sal sódica</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>099-06571</td><td>Solución de inhalación de isoflurano</td></tr></tbody></table>

un modelo murino de osteogénesis de la distracción

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

Distracción osteogénica (DO) es un procedimiento quirúrgico que implica la regeneración de los tejidos esqueléticos sin trasplante de la célula. Un modelo consta de las siguientes tres fases: la fase de latencia después de la osteotomía y colocación del distractor externo; la fase de distracción, en donde los extremos del hueso separado son gradualmente y continuamente distraídos; y la fase de consolidación. Este distractor por encargo usado para hacer está compuesto por dos anillos de resina acrílica incompleta y un tornillo de expansión. El proceso fue iniciado por hacer un molde con material de impresión de silicona y luego crear el distractor a medida. Resina dental fue vertida en el encofrado hecho de material de impresión de silicona, y fue permitido para polimerizar para crear los anillos de resina incompleta para el distractor a medida. Estos anillos se fijaban con un tornillo de expansión con resina transparente. El distractor a medida creado a través de este enfoque fue unido a la tibia de los ratones. La tibia era fijo al dispositivo usando un par de agujas de 25 G proximalmente, un par de agujas de 27 G distalmente y resina acrílica. Después de un período de latencia de 5 días, la distracción se inició a una velocidad de 0.2 mm/12 h. La prolongación fue continuada por 8 días, resultando en un espacio total de 3,2 mm. Los ratones fueron sacrificados 4 semanas después de la distracción. La formación del hueso en el hueco de distracción fue confirmada mediante radiografía y la histología.

Figuras 1A y 1B presentan anillos incompletos (exterior de diámetro, 20 mm interior de diámetro, 10 mm; espesor, 5 mm) con cera de parafina. Dos patrones de la cera fueron embebidos en material de impresión de silicona, y se formó un molde para los aros de resina (figura 1C). Resina polimerizada se vierte inmediatamente en este molde, y anillos de resina fueron obtenidos (figura 1</strong...

Se presenta un modelo de osteogénesis de distracción tibial de ratón desarrollado utilizando un distractor por encargo. El uso de un ratón como un objetivo de análisis es ventajoso para el avance de la investigación.

Un modelo murino de osteogénesis de la distracción

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de regeneración de tejidos duros y blandos. La principal ventaja de esta técnica es que el uso de un ratón permite un análisis detallado de la regeneración ósea. Comience con un ratón adulto completamente anestesiado.Afeita y desinfecta cuidadosamente el área quirúrgica con una solución de 10% de yodo. Luego, administrar 0.5%hidrocloruro de lidocaína en la extremidad inferior derecha. Luego, después de hacer una incisión longitudinal de la piel de 15 milímetros en la parte inferior derecha de la pierna con un bisturí número 15, separe sin rodeos los músculos subyacentes, teniendo cuidado de no eliminar todo el periosteo.Luego, corta el peroné con tijeras. Sujete el tobillo con fórceps estrechos y delgados, y use una aguja del calibre 27 para hacer un agujero en el hueso, a unos cinco milímetros del talón. La aguja debe penetrar la piel, el hueso y la piel en ese orden.Cuando la aguja penetre completamente, corte la punta y la raíz con un pinza para que la aguja sea de unos 15 milímetros. Hacer otro agujero de la misma manera, de dos a tres milímetros proximal. A continuación, sostenga alrededor del tobillo y pase una aguja del calibre 25 debajo de la rodilla de la misma manera.Después de que la aguja penetre, corte la punta y la raíz con un mordisqueo. Hacer otro agujero de la misma manera, de dos a tres milímetros distal. Coloque el distractor personalizado de modo que sea paralelo a la dirección de la extensión.Fije las agujas y el dispositivo con suficiente resina dental de polimerización para llenar las ranuras del dispositivo. Espere a que se complete la polimerización, que debe tardar aproximadamente cinco minutos. Luego, mientras tenga mucho cuidado de no dañar los tejidos circundantes, corte la mitad de la diáfisis de la tibia utilizando un disco de corte muy delgado mientras aplica una solución salina.Cierre la herida con una sutura de nylon 4-0. Dar inyecciones subcutáneas de buprenorfina para analgesia inmediatamente después de la cirugía. Hay varios informes sobre el período de latencia y la tasa de distracción, pero aquí se muestran los protocolos representativos.Después de un período de latencia de cinco días, comience el procedimiento de distracción. Para la extensión, utilice el pasador conectado al tornillo de expansión rápida. Mueva el pasador en la dirección de la flecha amarilla unida al tornillo de extensión.Sostenga la cola con el dedo meñique y la palma, y fije el dispositivo de extensión con el dedo índice y el pulgar. Realice la extensión moviendo el pasador en la dirección de la flecha amarilla 0,2 milímetros para un giro de un cuarto. Continúe alargando a una velocidad de 0,2 milímetros cada 12 horas durante ocho días, lo que resultará en una brecha total de 3,2 milímetros.Esta imagen muestra los hallazgos típicos de la radiografía a las cuatro semanas después de la distracción en el modelo. El hueso recién formado se ve en el sitio de distracción. Aquí se observan los resultados de tinción de hematoxilina y eosina.Se observó un puente óseo recién formado, y el hueso recién formado se podía distinguir fácilmente del hueso nativo. Presentamos un modelo DO tibial de ratón desarrollado usando un distractor hecho a medida. El uso de un modelo DO de ratón facilita un análisis más detallado.Es particularmente adecuado para experimentos con ratones knockout.

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Creación de fracturas rígidamente estabilizados para la evaluación de osificación intramembranosa, la distracción osteogénica, o la curación de los defectos críticos de tamaño

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