Diferencia de potencial nasal para cuantificar el transporte de iones Trans epitelial en ratones
4 de julio de 2018
Aquí, presentamos un protocolo para medir diferencia de potencial nasal en ratones. La prueba cuantifica la función de transportadores transmembrana de iones tales como el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística y el canal epitelial del sodio. Es valioso para evaluar la eficacia de nuevas terapias para la fibrosis quística.
La diferencia de potencial nasal es un método valioso para caracterizar el fenotipo de ratones transgénicos que modelan fibrosis quística. Permite investigar la eficacia de nuevos tipos de terapias para la fibrosis quística. Las principales ventajas de la técnica son que proporciona mediciones fiables en ratones que se reproducen de forma continua.
Reduce la mortalidad relacionada y permite repetir la prueba en el mismo animal. Para preparar el catéter nasal de doble lumen, mantenga el centro de un tubo de polietileno de 20 centímetros de largo en la llama durante unos 10 a 15 segundos hasta que esté lo suficientemente suave como para tirar de él. A continuación, separe los dos extremos para obtener un tubo capilar muy fino de unos 15 centímetros de largo y un diámetro exterior de 0,1 milímetros para la sonda nasal.
Después, limpie y desengrase los dos capilares con etanol puro. Únelas con cinta adhesiva y pégalas con pegamento de cianoacrilato. Corte el exceso de longitud de las sondas con una cuchilla de afeitar para obtener el catéter de doble lumen de unos ocho centímetros de largo.
Luego, inyecte agua a través de ambos lúmenes para verificar que sean permeables y haga una marca a una distancia de cinco milímetros de la punta. A continuación, prepare una mezcla de crema mezclando la crema de electrolitos y la solución saturada de potasio de tres molares en una proporción de uno a uno, evitando la formación de pequeñas burbujas de aire. Para la configuración experimental, para evitar la hipotermia durante y después de la prueba, utilice dos almohadillas térmicas, una para la configuración de la medición y la otra para la caja en la que se colocará el animal para su recuperación al final de la prueba.
Encienda la computadora, que está conectada a la memoria de datos, alta impedancia de entrada y voltímetro de alta resolución. A continuación, abra el software para la captura de datos. Conecte los electrodos al voltímetro.
Sumerge la punta de los electrodos en la mezcla de crema. Verifique el valor inicial de compensación del electrodo y rechace los electrodos si el valor es mayor que más o menos dos milivoltios. A continuación, encienda la bomba peristáltica e inserte el tubo de la bomba en el lumen de perfusión del catéter nasal.
Llene un lumen del catéter nasal con una mezcla de crema de electrolitos a través de una punta de pipeta de 10 microlitros. Adapte el catéter a un conector de tubo de silicona y llene el conector con mezcla en crema. A continuación, inserte el electrodo positivo en el conector.
Compruebe el valor del desplazamiento del puente del electrodo de medición y rechace los puentes si el valor es superior a más o menos dos milivoltios. A continuación, conecte la salida proximal del tubo de la bomba al vial que contiene la solución seleccionada para la perfusión nasal. A continuación, conecte la salida distal del tubo de la bomba a la luz de perfusión del catéter nasal.
A continuación, llene el segundo lumen del catéter nasal con solución fresca A1. Sumerja la punta del catéter nasal en el vial que contiene la solución A. Invierta la dirección de la bomba peristáltica para llenar la longitud del catéter nasal correspondiente a 10 segundos de perfusión. Posteriormente, dobla una hoja de tejido absorbente para hacer una almohada de tres centímetros de ancho que servirá de soporte para la cabeza del ratón. Cubra la almohadilla térmica con la hoja de tejido absorbente.
Luego, coloque el ratón boca arriba sobre la almohadilla térmica y pegue las extremidades y la cola a la almohadilla. Posteriormente, inserte el catéter intravenoso de referencia en el espacio subcutáneo de una extremidad posterior. Retire la aguja y adáptela en el conector del tubo de silicona.
Llene el catéter y el conector con mezcla en crema. A continuación, conecte el electrodo de medición positivo al catéter nasal y el electrodo de referencia negativo al catéter insertado en el espacio subcutáneo de la extremidad posterior del animal. Luego, fije el catéter y el electrodo con cinta adhesiva según sea necesario para evitar cualquier desplazamiento.
Después de colocar el electrodo de referencia y los puentes, vuelva a verificar el valor de desplazamiento del puente del electrodo de medición sumergiendo la punta del catéter nasal en la mezcla de crema de electrodos dentro del conector del catéter IV. Registre el valor de desplazamiento final y estable. Ahora, fije las orejas del ratón con cinta adhesiva en la almohadilla térmica en un espacio libre entre las dos piezas de tejido absorbente.
Fija la vitalidad sin tocar los ojos. Para absorber el líquido de la cavidad oral, mueva la lengua hacia los lados e inserte una mecha puntiaguda de papel de filtro de aproximadamente un centímetro en la boca. Para absorber el líquido que sale de la fosa nasal perfundida, coloque un segundo trozo de papel de filtro en el toi de la nariz.
Verifique el valor de control positivo del potencial epitelial colocando la punta del catéter nasal en el interior de la boca. Sosteniéndolo con pinzas finas y bajo una buena iluminación directa, introduzca delicadamente el catéter nasal en una fosa nasal, hasta cuatro a seis milímetros de la punta de la nariz. Cinco minutos después de inyectar los medicamentos anestésicos, incline suavemente la almohadilla térmica unos 30 grados con la cabeza del animal hacia abajo.
Monitorizar el valor basal máximo de DP. Cuando esté estable durante 30 segundos, comience a perfundir la mucosa nasal a 10 microlitros por minuto con las cuatro soluciones tamponadas en sucesión. Perfunda la primera solución durante 10 segundos, y cada solución siguiente durante cinco minutos, o hasta que se haya alcanzado un voltaje estable.
Deje de perfundir forskolina cuando la respuesta transitoria de forskolina comience a disminuir. Después de la evaluación, suelte el mouse de la almohadilla térmica. Administre con la mezcla de antagonistas anestésicos y transfiéralo a la caja de recuperación con almohadilla térmica hasta la recuperación completa.
A continuación se muestran los trazados representativos de la EP nasal de un ratón homocigoto normal y un ratón homocigoto para la mutación CFTR de deleción F508, junto con los valores individuales obtenidos para los parámetros de la EP nasal. La respuesta de amilorida es la diferencia entre los valores de DP nasal al final y al principio de la perfusión de la mucosa nasal con solución salina basal tamponada que contiene amilorida. La respuesta libre de cloruro es la diferencia entre los valores de DP nasal al final y al principio de la perfusión de la mucosa nasal con solución salina tamponada sin cloruro, más amilorida.
La respuesta de forskolina es la diferencia entre los valores de DP nasal al final y al principio de la perfusión de la mucosa nasal con solución salina tamponada sin cloruros, más forskolina y amilorida. La respuesta total de cloruro es la suma de los dos últimos parámetros obtenidos bajo perfusión cero de cloruro. El proyecto se puede utilizar para explorar, proporcionar los desertores de transporte en el ratón, pero también en el mocoso, en el grande y en el modelo de fibrosis quística de hurón.
Y desertores del transporte de sodio en el modelo de ratón eunuco. Todos los transportadores pueden ser estudiados adoptando el protocolo. El trabajo en la cavidad nasal de los roedores es extremadamente delicado debido a la pared esencial de entradas sensoriales de la región facial nasal.
La muerte adecuada de la anestesia se dosifica particularmente difícil cuando se opera en la cavidad nasal del ratón.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para medir la diferencia de potencial nasal en ratones, que cuantifica la función de los transportadores iónicos transmembrana. El método es particularmente útil para evaluar terapias novedosas para la fibrosis quística.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Modelos transgénicos
Antecedentes
- La diferencia de potencial nasal es un método para caracterizar ratones transgénicos.
- Ayuda a evaluar la eficacia de nuevas terapias para la fibrosis quística.
- La técnica es ventajosa para la cría continua de ratones.
- Minimiza la mortalidad asociada y permite realizar pruebas repetidas en el mismo animal.
Objetivo del estudio
- Para medir la diferencia de potencial nasal en ratones.
- Para evaluar la función de los transportadores de iones como CFTR y ENaC.
- Para evaluar la eficacia de nuevos tratamientos para la fibrosis quística.
Métodos Utilizados
- Preparación de una cánula nasal de doble luz.
- Medición de la diferencia de potencial nasal en ratones transgénicos.
- Evaluación de la función del transportador iónico.
- Evaluación de la eficacia de la terapia.
Resultados principales
- Mediciones confiables obtenidas de ratones con reproducción continua.
- Reducción de la mortalidad relacionada con los procedimientos de prueba.
- Capacidad para repetir pruebas en el mismo animal.
- Información sobre la eficacia de nuevas terapias para la fibrosis quística.
Conclusiones
- La diferencia de potencial nasal es un método valioso para la investigación de la fibrosis quística.
- El protocolo mejora la fiabilidad de las mediciones en modelos murinos.
- Esta técnica apoya el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición de la diferencia de potencial nasal (NPD) en ratones proporciona una lectura funcional del transporte iónico transepitelial, permitiendo la evaluación preclínica de terapias para la fibrosis quística (CF). Al cuantificar la actividad de CFTR y ENaC in vivo, el método apoya la validación de dianas terapéuticas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. La realización de pruebas repetidas en el mismo animal reduce la variabilidad y mejora la confianza predictiva para tomar decisiones de avance o interrupción en el desarrollo de terapias para la fibrosis quística.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Investiga hipótesis terapéuticas mediante la medición del transporte funcional de cloruro y sodio en modelos de ratón con fibrosis quística.
- Valor operativo: Permite la desactivación biológica de moduladores del CFTR mediante fenotipificación directa del transporte iónico.
- Valor científico: Apoya la confianza predictiva al discriminar entre fenotipos de fibrosis quística y fenotipos silvestres mediante las respuestas a amilorida, ausencia de cloruro y forskolina.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la estandarización de ensayos utilizando catéteres nasales de doble luz y perfusión controlada.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la verificación estable del desplazamiento del electrodo y protocolos consistentes de perfusión de soluciones.
- Valor científico: Permite la evaluación confiable de compuestos mediante la medición de las respuestas de los transportadores iónicos a soluciones de amilorida, libres de cloruro y de forskolina.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia con la enfermedad al cuantificar defectos funcionales en los transportadores CFTR y ENaC en ratones que respiran espontáneamente.
- Valor operativo: Apoya la continuidad traslacional al permitir múltiples pruebas por animal, reduciendo la variabilidad entre animales.
- Valor científico: Informa decisiones de avance con ajuste de riesgo al proporcionar trazados cuantitativos de respuesta farmacodinámica que se correlacionan con el genotipo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método NPD se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica, proporcionando datos funcionales de transporte iónico que informan las evaluaciones de eficacia terapéutica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de diferencias nasales de potencial basales y estimuladas en ratones transgénicos.
- Detección: Proporciona disponibilidad del ensayo mediante la perfusión estandarizada de soluciones tamponadas y lecturas estables de voltaje.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (respuesta a amilorida, respuesta sin cloruro, respuesta a forskolina, respuesta total de cloruro) para la comparación de condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al permitir pruebas repetidas en el mismo animal para monitorear efectos del tratamiento a lo largo del tiempo.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable para la caracterización de modelos de fibrosis quística en múltiples iteraciones terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la fenotipificación cuantitativa del transporte iónico.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante la preparación del catéter, la calibración del electrodo y los controles de perfusión.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo al reducir la ambigüedad mecanicista en la eficacia de los moduladores de CFTR y ENaC.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en la corrección funcional de los defectos de transporte en modelos preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en el manejo de anestesia en roedores y en técnicas de cateterización nasal.
- Instrumentación que incluye voltímetro de alta impedancia, bomba peristáltica y placas calefactoras con control de temperatura.
- Normalización entre equipos en la preparación de soluciones, verificación del desfase de electrodos y temporización de la perfusión.
- Consideraciones de adaptación para diferentes cepas de roedores y modelos de mutaciones del CFTR.
- Las limitaciones prácticas incluyen la delicadeza quirúrgica del acceso a la cavidad nasal y la optimización de la profundidad de la anestesia para prevenir la broncoaspiración.
