Protocolo experimental para examinar los perfiles de respuesta conductual en peces larvales: aplicación a la Neuro-estimulantes cafeína
July 24th, 2018
Aquí, presentamos un protocolo para examinar larvales pez cebra y fathead minnow locomotoras actividades y respuestas fotomotor (PMR) utilizando un software de rastreo automatizado. Incorporando en común pruebas biológicas de toxicología, análisis de estos comportamientos ofrecen una herramienta de diagnóstico para examinar productos químico bioactividad. Este protocolo se describe usando cafeína, un neuroestimulante modelo.
Los modelos de peces tienen muchas ventajas y, por lo tanto, se están utilizando cada vez más en las ciencias biomédicas. Desde el desarrollo hasta el descubrimiento de fármacos y los estudios de toxicología. De manera similar, el comportamiento de los modelos de peces se está utilizando cada vez más para la investigación ambiental y biomédica.
Aquí es particularmente importante aprovechar décadas de experiencia en investigación en toxicología acuática y ecología del comportamiento para avanzar en las ciencias biomédicas ambientales. Nuestro método podría utilizarse para comprender las bioprestaciones de los productos químicos y los beneficios y peligros que pueden presentar. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona un enfoque sensible y rápido para comprender diagnósticamente las actividades químicas de utilidad para las ciencias ambientales y biomédicas.
Las implicaciones de esta técnica están destinadas a apoyar el diagnóstico de las bioatividades comerciales y los efectos conductuales. La mayoría de estos productos químicos a menudo carecen de información importante sobre la toxicidad. Sin embargo, también se puede aplicar para comprender los efectos de otros productos químicos, como los productos farmacéuticos y los pesticidas.
Es importante tener en cuenta este aspecto, ya que a menudo faltan datos comparativos de farmacología y toxicología ambiental para los compuestos industriales. Además de medir la actividad locomotora de las larvas durante los períodos fotomotores de luz y oscuridad alterados, este protocolo se puede utilizar para medir las respuestas fotomotoras de las larvas. Que examina eficazmente la magnitud de la diferencia de movimiento entre las transiciones de luz a oscuridad y de oscuridad a luz.
Para empezar, disuelve la cafeína en agua dura reconstituida. A continuación, realice diluciones en serie para producir niveles más bajos de tratamiento con cafeína. Para preparar las cámaras de exposición individuales, vierta 20 mililitros de solución en cuatro vasos de vidrio de 100 mililitros para el pez cebra.
Vierta 200 mililitros de solución en tres vasos de vidrio de 500 mililitros para los pececillos gordos. A continuación, utilice una pipeta de transferencia para colocar 10 embriones de pez cebra de cuatro a seis horas después de la fertilización en cada uno de los vasos de precipitados. Con una pipeta de transferencia modificada, coloque 10 larvas de pececillos gordos envejecidas dentro de las 24 horas posteriores a la eclosión en cada una de las cámaras de exposición.
Coloque las cámaras de pececillos de pez cebra y cabeza gorda en una incubadora. Después de 96 horas, cargue los peces individuales en pozos separados de placas de 48 y 24 pocillos. Coloque una placa de pocillo con al menos un pez larvario en la cámara de registro.
Luego, en el software de seguimiento de video, haga clic en el protocolo de generación de archivos. En el campo de recuento de ubicaciones del cuadro de diálogo, introduzca el número de pocillos individuales de la placa de pocillos. Y haga clic OK.At la parte superior de la pantalla, haga clic en ver pantalla completa.
Para mostrar una vista de la cámara aérea de la placa del pozo. A continuación, haga clic en el icono de dibujar áreas. Seleccione el icono de círculo en el campo etiquetado áreas.
Con el cursor, delinee el área de seguimiento de video circular del pozo superior izquierdo de la placa. Seleccione la marca superior derecha y delinee el área de visualización del cuadro superior derecho. A continuación, seleccione la marca inferior para delinear el pozo inferior derecho.
Después de definir las áreas de seguimiento de pozos, haga clic en compilar para solicitar al software que delinee las áreas de visualización de los pozos restantes. En el área de calibración, haga clic en dibujar escala y dibuje una línea horizontal a través de la placa. Una vez que se dibuja la línea, aparecerá un cuadro de diálogo con la etiqueta medición de calibración.
Ingrese la longitud de la placa del pozo en este cuadro y haga clic en Aceptar. Haga clic en Aplicar al grupo en el área de calibración. Para salir del administrador de dibujos, haga clic en el icono de áreas de dibujo. A continuación, haga clic en el icono de mosaicos.
Con el cursor, resalte todas las casillas que aparecen en la pantalla de visualización para que cada casilla sea verde. Haga clic en ver y pantalla completa. A continuación, en el cuadro del umbral de detección, haga clic en bkg y utilice la barra de ajuste de umbral para establecer el umbral de detección de píxeles.
Una vez seleccionado el umbral adecuado, haga clic en Aplicar al grupo. En el cuadro denominado umbral de movimiento, introduzca los parámetros de seguimiento de la velocidad de movimiento deseados. Una vez establecidos los parámetros de velocidad, haga clic en Aplicar al grupo.
A continuación, haga clic en Parámetros de protocolo en el menú desplegable. En el cuadro de diálogo, seleccione la pestaña de tiempo e introduzca los tiempos de observación e integración. Haga clic en Aceptar y abra el cuadro de diálogo de configuración del controlador de luces seleccionando Conducción ligera en el menú desplegable de parámetros.
Establezca la luz, la oscuridad, los tiempos del período de foto y la intensidad de la luz para cada período de foto. A continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, guarde el protocolo de observación.
Primero coloque la placa de pocillo que contiene los peces experimentales en la cámara de registro de comportamiento. A continuación, abra el protocolo de seguimiento desarrollado anteriormente. En el visor de seguimiento de vídeo, asegúrese de que todas las larvas estén visibles, de que solo haya una larva en cada pocillo y de que los pocillos estén alineados con las áreas de observación definidas.
A continuación, haga clic en experimentar y ejecutar. Especifique el nombre y la ubicación de almacenamiento de los datos. Y haga clic en el icono de varias imágenes en vivo para resaltar todas las áreas de visualización predefinidas.
Finalmente, cierre el panel de la cámara de grabación y haga clic en fondo seguido de inicio en el monitor de la computadora. Después de 96 horas de exposición a la cafeína, la respuesta fotomotora de las larvas de pececillo cabeza gorda se vio alterada por la cafeína a niveles más bajos que el pez cebra. Sin embargo, un número notablemente mayor de puntos finales fotomotores se vieron afectados en el pez cebra.
Además, se analizó la actividad locomotora clara y oscura a través de tres umbrales de velocidad para la distancia recorrida, el número de movimientos y la duración de los movimientos. En ambas especies, la cafeína inhibió la actividad en todos los puntos finales locomotores significativamente afectados. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe relacionar los ensayos de comportamiento con una ventana de tiempo específica y estrecha.
Porque la hora del día puede influir en el comportamiento de las larvas de los peces. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar métodos a pautas estandarizadas en otros productos químicos para responder preguntas adicionales relacionadas con el comportamiento de los peces. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo observar los comportamientos y las respuestas fotomotoras de los modelos de peces larvales al realizar bioensayos de toxicidad con pautas estandarizadas de relevancia para las ciencias ambientales y biomédicas.
No olvide que trabajar con ciertos productos químicos puede ser peligroso, así que asegúrese de usar el equipo de protección personal adecuado al realizar este protocolo.
Visión general
Este artículo presenta un protocolo para examinar las actividades locomotoras y las respuestas fotomotoras de larvas de pez cebra y pececillos de cabeza plana utilizando software de seguimiento automatizado. El método tiene como objetivo mejorar los bioensayos toxicológicos al proporcionar información sobre la bioactividad química, ejemplificado a través del uso de la cafeína como un neuroestimulante modelo.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Ecología del comportamiento
- Toxicología acuática
- Investigación biomédica
Antecedentes
- Los modelos de peces se utilizan cada vez más en las ciencias biomédicas.
- Los estudios de comportamiento en peces pueden informar la investigación ambiental y biomédica.
- Comprender las bioactividades químicas es crucial para evaluar sus beneficios y peligros.
- A menudo carecen datos comparativos sobre farmacología y toxicología ambiental.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método sensible y rápido para evaluar las actividades químicas.
- Apoyar el diagnóstico de bioactividades comerciales y efectos conductuales.
- Proporcionar un enfoque estandarizado para evaluar los efectos de varios químicos.
Métodos utilizados
- Disolución de cafeína en agua dura reconstituida para la exposición.
- Uso de software de seguimiento automatizado para analizar las respuestas locomotoras y fotomotoras.
- Realización de diluciones seriadas para evaluar diferentes concentraciones de cafeína.
- Monitoreo del comportamiento de peces larvales durante ciclos de luz y oscuridad.
Principales resultados
- La cafeína alteró las respuestas fotomotoras en pececillos de cabeza plana a niveles más bajos que en peces cebra.
- Los peces cebra exhibieron un mayor número de endpoints fotomotores afectados.
- Ambas especies mostraron actividad inhibida en todos los endpoints locomotores.
- La hora del día influye significativamente en los comportamientos de los peces larvales.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un marco para evaluar los efectos conductuales de los químicos.
- Los métodos pueden estandarizarse para otros químicos para explorar preguntas adicionales.
- Este enfoque mejora la comprensión del comportamiento de los peces en estudios toxicológicos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid behavioral profiling of larval fish to assess neuroactive compound effects, supporting early-stage target validation in neuropharmacology. By quantifying photomotor and locomotor responses, it provides mechanistic insights that aid in de-risking CNS-active compounds before mammalian testing. The comparative sensitivity between zebrafish and fathead minnows offers a translational advantage for species-specific behavioral screening in environmental and biomedical contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring neurostimulant-induced behavioral changes in larval fish models.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantifiable photomotor and locomotor endpoints.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with significant behavioral effects at environmentally relevant concentrations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated behavioral assays for downstream compound screening using automated tracking.
- Quantitative Outputs: Generates measurable locomotor and photomotor data across speed thresholds for hit confirmation.
- Reproducibility: Standardizes light/dark cycle protocols to ensure consistent behavioral readouts across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models neuropharmacological responses relevant to CNS disorder target engagement.
- Translational Continuity: Bridges behavioral ecotoxicology with biomedical screening through conserved behavioral endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by highlighting species-specific sensitivity differences in neuroactive compound responses.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing and lead identification through behavioral phenotyping of larval fish exposed to neuroactive compounds.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by linking compound exposure to altered photomotor and locomotor behaviors.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible behavioral readouts for compound effect comparison.
- Analytics: Provides quantitative movement thresholds and photomotor response metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects behavioral ecotoxicology to preclinical neuropharmacology via conserved behavioral assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable behavioral profiling platform applicable to diverse chemical libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neuroactive compound screening.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability of behavioral assays across species and laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS-active compounds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization based on quantitative behavioral effect thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in larval fish husbandry and behavioral tracking software operation.
- Dependent on automated video tracking systems and controlled environmental incubators.
- Necessitates cross-team standardization of exposure protocols and behavioral endpoint definitions.
- Must account for diurnal behavioral variability when scheduling assays.
- Limited to behavioral endpoints; does not replace mechanistic or molecular target validation.
