Name: Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a caracterizar subconjuntos de monocitos humanos mediante citometría de flujo en sangre completa. Este protocolo estandarizado permite evaluar marcadores M1 y M2 con células en estado nativo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Citometría de flujo se realizó en las instalaciones de centrales de citometría de flujo que es apoyado por el Instituto de Westmead para médico investigación, Westmead Hub, cáncer Instituto de investigación New South Wales y nacional de salud y Consejo de investigación médica. Este estudio fue apoyado por el fondo de educación e investigación de química clínica.

Este estudio ha sido aprobado por el Comité de ética de investigación humana WSLHD (HREC) (aprobación AU rojo HREC/15/WMEAD/289).
1. preparación para citometría de flujo de sangre
Nota: Como sangre humana potencialmente infecciosa, el montaje de la muestra debe realizarse en una campana de biohazard.
<ol><li>Recoger las muestras de sangre de los participantes en tubos con 3 mL etileno diamina tetra acético (EDTA).</li>
	<li>Determinar el número de glóbulos blancos (WBC) utilizando un analizador de la hematología o hemocitómetro.</li>
	<li>Diluir con tampón fosfato salino (PBS) (pH ~ 7.4) para ajustar la concentración a ~ 5 x 10 6/mL WBC.</li>
	<li>Preparar mezcla principal suficiente para el número de tubos (por ejemplo, para tubos de 14 preparar 16 x mix master) combinando 16 x volúmenes de sangre μl 50, 0,75 μl anti CD14-V450, 0,5 μl anti CD16-APC y 0,625 μl anti HLA-DR-PerCP. Vórtice y pipeta 51,9 μl de la mezcla en cada tubo (tabla 1). Nota: Anticuerpos deben titularse para determinar concentraciones de tinción óptima para los anticuerpos fluorescentes utilizados.</li>
	<li>Añadir marcador superficial (control M1 y M2 o isotipo, ficoeritrina (PE) etiquetado) anticuerpos (ejemplo según tabla 2) y PE etiquetado marcadores de células T (CD3), linfocitos B (CD19), neutrófilos (CD66b) y células de asesino natural (NK) (CD56) (tabla 3). Vortex e incubar por 30 min, 4 ° C en la oscuridad. Nota: Los marcadores de los linfocitos, neutrófilos y células NK se incluyen sólo para la validación del método bloquea.</li>
	<li>Añadir 250 μl de solución de fijación combinado glóbulos rojos leucocitos lisis, vortex suavemente inmediatamente e incubar por 10 min en la oscuridad a 4 ° C.</li>
	<li>Añadir 250 μl de PBS y vuelta células abajo a 260 x g por 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante, resuspender las células en 300 μL de formaldehído al 1%. Nota: El formaldehído es tóxico. Use guantes de nitrilo y en campana.</li>
	<li>Almacenar a 4 ° C protegido de la luz hasta que se realizaron el análisis. Nota: Análisis de flujo se recomienda realizarse dentro de las 48 h de preparación de la muestra.</li>
</ol>2. citometría de flujo
<ol><li>Verificar registro de citómetro de flujo para personal de la institución han realizado controles de calidad. Nota: Para garantizar la coherencia entre el análisis, control de calidad de instrumentos y mantenimiento constante se recomiendan intensidades de fluorescencia blanco con perlas de control.</li>
	<li>Para configurar el experimento de citometría de flujo, haga clic en "nuevo experimento entonces"nueva muestra"y"nuevo tubo"para agregar tubos. Seleccionar parcelas bivariados haciendo clic en el icono y utilice los menús desplegables para seleccionar los parámetros de eje. Garantizar la inclusión de una parcela de CD16/CD14 y un diagrama mostrando un detector junto a tiempo para supervisar la adquisición.</li>
	<li>Inserte el tubo y haga clic en "Adquirir". Compruebe los ajustes del voltaje del instrumento asegurando que las señales del detector no son escala.</li>
	<li>Observar las células en la puerta del monocito de la trama de CD14/CD16. Ajuste umbral de grabación a 5.000 eventos para la puerta clásica monocito y clic en "Registro".</li>
	<li>Siguen datos de registro para los tubos restantes. Después de que se ha registrado datos para todos los tubos, exportar datos de flujo como .fcs archivos de análisis. Nota: Para asegurar la precisión, controles de compensación de color solo deben registrarse. Una matriz de compensación puede ser calculada y aplicada a los datos antes del análisis para tener en cuenta derrame espectral sobre15,16.</li>
</ol>3. monocitos Gating
<ol><li>Abrir archivos en el software de análisis. Haga doble clic en nombre del tubo y seleccionados parámetros desde el menú desplegable para visualizar las células en un área de dispersión hacia adelante FSC (A) reenviar la trama de FSC(H) de altura de dispersión. Crear una puerta de exclusión doblete haciendo clic en el icono de la herramienta de polígono puerta y adjuntando las células como en la (figura 1A).</li>
	<li>Seleccione las celdas cerradas (haciendo doble clic sobre la región cerrada) en la nueva pantalla de caja ajuste de parámetros del menú desplegable para mostrar las celdas de un FSC (A) y diagrama de dispersión lateral SSC(A). Haga clic en el icono rectangular puerta y generosamente seleccionar la población de monocitos basada en las propiedades de dispersión hacia delante y lateral para excluir a la mayoría de los linfocitos, las células NK y los granulocitos (figura 1B).</li>
	<li>Seleccione las celdas cerradas y volver a mostrar en una parcela de CD14/CD16, seleccionando los parámetros usando los menús desplegables. Haga clic en la puerta del polígono para seleccionar monocitos basados en su forma característica "┐" (figura 1).</li>
	<li>Seleccione las celdas cerradas y mostrar los monocitos en una parcela de CD16/HLA-DR usando los menús desplegables para seleccionar parámetros. Haga clic en la puerta del polígono para seleccionar las células del positivo HLA-DR y excluir cualquier restante NK neutrófilos y células17 (figura 1).</li>
	<li>Seleccione las celdas cerradas y mostrar las células del positivo HLA-DR en una parcela de CD14/HLA-DR con menús desplegables para seleccionar parámetros. Haga clic en la puerta de la poligonal y dibuja una puerta para excluir el HLA-DR alta/CD14 bajo las células (linfocitos B expresan altos niveles de HLA-DR pero no CD14) (Figura 1E). Nota: contaminación de células B puede ocurrir y por lo tanto deben ser investigada. Si la población no clásica en la figura 1 no es distinta de las células a su izquierda, es probable la contaminación. Paso 3.5 puede omitirse si las células de B no se solapan con monocitos no clásica.</li>
	<li>Seleccione las celdas cerradas y utilizar menús desplegables para mostrar en una parcela de CD16/CD14. Seleccione opciones de trama de la "Trama de cebra" que permitirá a puertas de subconjunto de monocitos que se adopte para determinar proporciones de subconjunto (Figura 1F). Nota: si trama de cebra está disponible en el software de análisis, pseudo color (liso) o trama de contorno puede ser adecuado.</li>
	<li>Haga clic en el icono rectangular puerta y seleccione los monocitos clásicos dibujando una puerta rectangular aproximada en la población de alta/CD16 bajos, clásico monocitos CD14. En "Pantalla" seleccione "Mostrar medias" para mostrar la intensidad de fluorescencia media para monocitos clásicos. Ajustar la puerta de tal manera que la población tiene una distribución igual de la mediana en la izquierda y derecha que abarca todas las celdas a la izquierda.</li>
	<li>Seleccione la población intermedia por una puerta rectangular que engloba a las células a la derecha de la puerta clásica de dibujo. Ajustar la parte inferior de la puerta para excluir las células no clásicas por alinear la puerta con la parte inferior de los círculos concéntricos que están completamente dentro de la puerta clásica de monocitos, que asegura que la parte intermedia tiene una expresión de CD14 comparable a la principal población clásica consistente con la nomenclatura actual.</li>
	<li>Puerta el subconjunto no clásicas dibujando una caja rectangular hacia abajo desde el borde inferior de la parte intermedia, seleccionar todas las celdas en la parte inferior de la población (Figura 1F).</li>
	<li>En "Pantalla" seleccione "Mostrar frecuencias de puerta" para determinar el porcentaje de cada subconjunto de monocitos.</li>
</ol>4. validación del método que bloquean
<ol><li>Para determinar si los tipos de células potencialmente contaminantes están efectivamente cerrada, primero identificar diferentes poblaciones celulares con anticuerpos contra las células T (CD3), linfocitos B (CD19), neutrófilos (CD66b) y las células NK (CD56) (figura 2). Nota: Aquí T células neutrófilos no se siente cerca de la forma "┐" de monocitos y está cerrados hacia fuera en la figura 1.</li>
	<li>Confirman que las células NK se quitan en el paso 3.4 (figura 1), y las células de B se quitan en el paso 3.5 (Figura 1E) como se muestra en la figura 3. Si las células NK o células de B no fuera cerrada, vuelva a ajustar las puertas.</li>
</ol>5. expresión de marcadores de monocitos fenotípica
<ol><li>Seleccione celdas de cada subconjunto de monocitos. Modificar parámetros de lista desplegable para crear un histograma para cada subconjunto de monocitos (Figura 1F) mostrando cada marcador y su isotipo que empareja (figura 4).</li>
	<li>Calcular el grado de expresión de cada marcador (mediana o media geométrica) en comparación con el control de isotipo correspondiente.</li>
</ol>

<ol><li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).</li>
<li>Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD14%28bright%29+CD16%2B+monocyte+subset+is+expanded+in+rheumatoid+arthritis+and+promotes+expansion+of+the+Th17+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population.</a> Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).</li>
<li>Wildgruber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3BIntermediate%26%2334%3B+CD14%2B%2BCD16%2B+monocyte+subset+increases+in+severe+peripheral+artery+disease+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The &#34;Intermediate&#34; CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans.</a> Scientific Reports. 6, 39483(2016).</li>
<li>Heine, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+subpopulations+and+cardiovascular+risk+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease.</a> Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B%2BCD16%2B+monocytes+independently+predict+cardiovascular+events%3A+a+cohort+study+of+951+patients+referred+for+elective+coronary+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li>
<li>Bories, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+alternative+macrophage+differentiation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+obese+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Vascular+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).</li>
<li>Fadini, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbalanced+monocyte+polarisation+in+peripheral+blood+and+bone+marrow+of+patients+with+type+2+diabetes+has+an+impact+on+microangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy.</a> Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).</li>
<li>Satoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbalanced+M1%2FM2+phenotype+of+peripheral+blood+monocytes+in+obese+diabetic+patients%3A+effect+of+pioglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone.</a> Diabetes Care. 33 (1), 7(2010).</li>
<li>Chen, X., Devaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+from+metabolic+syndrome+subjects+exhibit+a+proinflammatory+M1+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Syndrome+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).</li>
<li>Williams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+classical+monocytes+display+unbalanced+M1%2FM2+phenotype+with+increased+atherosclerotic+risk+and+presence+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Angiology%22%5BJournal%5D)">Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease.</a> International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).</li>
<li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical%2C+intermediate%2C+and+nonclassical+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li>
<li>Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+human+intermediate+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of human intermediate monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 4, 339(2013).</li>
<li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+different+strategies+for+human+monocyte+subsets+gating+within+the+large-scale+prospective+CARE+FOR+HOMe+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study.</a> Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).</li>
<li>Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+inflammatory+profile+is+specific+for+individuals+and+associated+with+altered+blood+lipid+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels.</a> Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).</li>
<li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).</li>
<li>Szaloki, G., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Compensation in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).</li>
<li>Abeles, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2C+CD16+and+HLA-DR+reliably+identifies+human+monocytes+and+their+subsets+in+the+context+of+pathologically+reduced+HLA-DR+expression+by+CD14%28hi%29+%2FCD16%28neg%29+monocytes%3A+Expansion+of+CD14%28hi%29+%2FCD16%28pos%29+and+contraction+of+CD14%28lo%29+%2FCD16%28pos%29+monocytes+in+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).</li>
<li>Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Classical+monocytes+display+inflammatory+features%3A+Validation+in+Sepsis+and+Systemic+Lupus+Erythematous%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous.</a> Scientific Reports. 5, 13886(2015).</li>
<li>Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+CD11b%2FCD18+and+CD62L+on+human+monocytes+after+cell+preparation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).</li>
<li>Appleby, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+heterogeneity+in+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Sources of heterogeneity in human monocyte subsets.</a> Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).</li>
<li>Dagur, P. K., McCoy, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDagur%2C+PK+%22Current+protocols+in+cytometry%22">Current protocols in cytometry</a>. Robinson, J. P. 73, 5.1.1-5.1.16 (2015).</li>
<li>Einwallner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+matters%3A+Red+cell+lysis+with+FACS+Lyse+affects+the+flow+cytometric+enumeration+of+circulating+leukemic+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).</li>
<li>Tsujioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Heterogeneity+of+Human+Peripheral+Blood+Monocyte+Subsets+on+Myocardial+Salvage+in+Patients+With+Primary+Acute+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).</li>
<li>Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+of+lymphocyte%2C+monocyte+and+dendritic+cell+subsets+in+normal+rhesus+macaques+by+12-color+flow+cytometry%3A+Clarification+on+DC+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity.</a> Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).</li>
<li>Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+protocol+for+enumeration+of+endothelial+progenitor+cells+and+monocyte+subsets+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood.</a> Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).</li>
<li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+heterogeneity+in+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease.</a> Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).</li>
<li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SuperSAGE+evidence+for+CD14%2B%2BCD16%2B+monocytes+as+a+third+monocyte+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset.</a> Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).</li>
<li>Heimbeck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+single-platform+assay+for+human+monocyte+subpopulations%3A+Lower+CD14%2BCD16%2B%2B+monocytes+in+females%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females.</a> Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+Refined+Definition+of+Monocyte+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets.</a> Frontiers in Immunology. 4, 23(2013).</li>
<li>Weber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+analysis+of+monocyte+subsets+in+cardiovascular+disease.+Joint+consensus+document+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29+Working+Groups+%22Atherosclerosis+%26+Vascular+Biology%22+and+%22Thrombosis%22%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis & Vascular Biology" and "Thrombosis".</a> Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).</li>
<li>Shantsila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+characterization+of+human+monocyte+subsets%3A+possible+implications+for+cardiovascular+disease+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).</li>
<li>Hofer, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slan-defined+subsets+of+CD16-positive+monocytes%3A+impact+of+granulomatous+inflammation+and+M-CSF+receptor+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation.</a> Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. 29, 886(2011).</li>
<li>Thomas, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Blood+Monocyte+Subsets%3A+A+New+Gating+Strategy+Defined+Using+Cell+Surface+Markers+Identified+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Citometría de flujo de la sangre total es un enfoque ideal para el estudio de monocitos, las células se examinan en condiciones cerca de su microambiente fisiológico proporcionando una visión de su papel en la infección y condiciones inflamatorias. Además, el uso de frescos (es decir, sin procesar) las muestras de sangre minimiza las alteraciones o transformaciones celulares que pueden ocurrir debido al almacenamiento o manejo de18,19, como los que se sabe para ocurrir con monocitos de congelar-descongelar 20. preparación de la muestra pronto se recomienda como algunos marcadores son upregulated si las muestras se mantienen a temperatura ambiente antes de procesar19. Las concentraciones óptimas de marcadores M1 y M2 se determinaron por titulación, y esto debe hacerse para que cualquier nuevo anticuerpo limitar la fijación no específica mientras que asegurar que el grado de cambio debido a la expresión del antígeno y no restringido por falta de anticuerpos. La eliminación de glóbulos rojos y la fijación de las células blancas de la sangre con solución de lisis es un paso importante en este protocolo como la presencia de glóbulos rojos puede interferir con el flujo cytometry21,22. Tenga en cuenta que mientras que algunas soluciones de lisis son compatibles con la coloración no lave, poblaciones más claras son evidentes en nuestras manos cuando se utiliza un paso de lavado.
Configuración correcta de la citometría de flujo también es crítico al comparar la expresión de marcadores de monocitos. Se recomienda que los investigadores mantienen intensidades de fluorescencia blanco consistente de cuentas de control y realizan control de calidad en el instrumento a utilizarse para proporcionar resultados consistentes a través de diferentes muestras correr en días diferentes. Además, controles de isotipo se utilizan para ayudar en la interpretación de cualquier señal de fondo no específica generada por Unión de anticuerpos no específicos. Monocitos tienen altos niveles de receptores de Fc11 y por lo tanto son propensos a la Unión no específica. De nota, el nivel de fijación no específica difiere para los distintos subconjuntos, y así el uso de un control de isotipo se convierte en importante cuando se compara el grado de expresión de marcador entre subconjuntos.
Otro criterio importante a considerar es el bloquea empleado. Algunos estudios sugieren que es crucial establecer una puerta firmemente alrededor de los monocitos población en FSC(A)/SSC(A) complot para deshacerse de la mayoría de los no-monocytic CD16 células positivas23,24,25, pero esto puede conducir a la pérdida de algunos monocitos, células de monocitos no pueden traslaparse con monocitos en FSC/SSC parcelas26. Por el contrario, para excluir otras células de sangre que pueden contaminar los monocitos, la inclusión de un tercer marcador de monocitos CD14 y CD16, es esencial26,27. Por esta razón, HLA-DR se utiliza a menudo y es ideal ya que no es expresado por NK células o neutrófilos17,28. Aunque los linfocitos (células B y células T) pueden expresar HLA-DR, se diferencian de los monocitos en respeto a la expresión de CD14. Mientras que el HLA-DR es un marcador ideal de tercera, CD86 también ha recomendado5,27,29 pero no fue utilizado aquí es también un marcador M1 y así se evaluó su grado de expresión en subconjuntos de monocitos.
Validación de la estrategia bloquea utilizada es de vital importancia. Mientras que las células NK son conocidas se superponen a los clásicos no si no están cerradas a28, nos damos cuenta de que las células B también pueden traslaparse con los no clásicos (figura 2B); Si este es el caso en otros estudios pueden depender la elección de fluorocromo, configuración del equipo, sensibilidad del detector o incluso la condición de la enfermedad siendo examinada. Aquí, la superposición B células mostraron alta expresión de HLA-DR y no se fuera por la selección de las células positivas de HLA-DR en la figura 1. Más bien, para eliminar las células B se utilizó una trama adicional de CD14 / HLA-DR, donde las células de B separan hacia fuera no clásicos debido a su mayor HLA-DR y baja expresión de CD14.
También hay muchas maneras en que las puertas de los monocitos se han visto atraídas en la literatura; Estos incluyen cuadrantes (los subconjuntos están separados por marcadores de cuadrante) y cajas rectangular o trapezoidal13 (con cajas separadas para cada subconjunto), que además difieren en su colocación delinear donde un subconjunto termina y empieza otro. Estas diferencias probablemente reflejan el hecho de que los monocitos existen como un continuo de células, diferenciando desde clásico a no clásica, en lugar de poblaciones claramente distintas. Sin embargo, debido a las variaciones en las técnicas para la identificación de los subconjuntos se pueden llevar a diferencias en las proporciones de subconjunto de monocito calculado, es importante que el método bloquea es razonablemente objetiva más que subjetiva, como esto que el método más robusta y reproducible. Algunos estudios usan un control de isotipo para CD16 para determinar la frontera entre los subconjuntos clásicos e intermedios30. Por otra parte, para definir la separación entre productos intermedios y no clásicos, se ha propuesto que la línea de corte puede ser vertical u oblicua, con la opción hasta los investigadores, la salvedad de que debe ser reproducible, pero una puerta rectangular se ha recomendado para facilitar las comparaciones entre estudios13,30,31. Aquí, mayor objetividad fue obtenida por trazar los datos en una trama de cebra y aplicación de las normas visuales objetivas, porque parcelas de zebra proporcionan un cue de visualización adicional mezclando degradado de color a cada bin igual probabilidad sobre una parcela de contorno tradicional. El borde derecho del subconjunto clásico se señaló que la población se distribuye uniformemente alrededor de la mediana de la población. La división entre los intermediarios y no clásicos también fueron estandardizada por tener la base de los productos intermedios se alinean con la parte inferior de los círculos concéntricos dentro de la población clásica (es decir, la población intermedia claramente expresa altos niveles de CD14, según la nomenclatura estándar1).
Mientras que algunos estudios han sugerido el uso de marcadores adicionales, tales como C-C chemokine receptor tipo 2 (CCR2) o 6-sulfo LacNAc (SLAN) para la obtención exitosa enumeración de monocitos y revelar su significación clínica32,33 , en nuestras manos el nivel de expresión de los marcadores funcionales de muchos monocitos varía ampliamente entre individuos14. Dicha variación puede limitar la utilidad de estos marcadores para definir subconjuntos basados en su expresión. Enfoques computacionales automatizados también se han utilizado para visualizar y cluster subconjuntos de monocito incluyendo visual interactivo estocástico vecino incrustación (viSNE), t-distribución estocástica vecino incrustación (tSNE) o progresión de Spanning-tree Análisis de eventos normalizado de densidad (espada)34,35, que puede proporcionar una representación visual de las células basadas en el conjunto de múltiples marcadores utilizados. Mientras que esto se ha demostrado para aumentar la precisión de la estrategia bloquea en clasificación de subconjunto de monocitos, es reconocido que un inconveniente es la cantidad de anticuerpos (y canales de fluoróforo correspondientes). Su utilidad dependerá de las preguntas se formulan; la complejidad adicional puede no estar justificada, por ejemplo, en estudios de enumeración.
Cerrada con nuestra técnica de monocitos muestran proporciones en consonancia con la literatura y la expresión de marcadores de superficie de los tres subconjuntos puede ser fácilmente determinada. En general, la técnica y la metodología explicada aquí proporciona un método estandarizado y sencillo de enumeración proporciones de subconjunto de monocitos y la evaluación de expresión superficial del marcador, que puede ampliarse para incluir otros marcadores, así, de tal modo validar sus papeles funcionales en varias otras condiciones.

Los monocitos son un tipo de glóbulos blancos que juegan un papel importante en la promoción y resolución de la inflamación. Hay tres subconjuntos principales de monocitos reconocidos, clásicos (~ 85%), intermedio (~ 5%) y monocitos (~ 10%) no clásicas que se caracterizan por su nivel de cluster de diferenciación (CD) 14 y expresión de CD161. Las proporciones de subconjuntos de monocitos pueden diferir con la presencia de la enfermedad, una proporción mayor de productos intermedios en diversos Estados inflamatorios2,3 incluyendo enfermedad cardiovascular, donde el nivel de intermedios es asociado con eventos clínicos4,5. Además, en condiciones de enfermedad, monocitos pueden también sufrir cambios funcionales, con muchos cambios detectables por una diferencia en el marcador superficial expresión6,7. Un ejemplo es el monocito sesgar M1, un aumento de marcadores asociados con los macrófagos M1, que se ha observado en enfermedades cardiovasculares, diabetes, obesidad y síndrome metabólico7,8,9 , 10.
A pesar de la popularidad de citometría de flujo para evaluar la función y la proporción de monocitos subconjunto, existe una variabilidad considerable en la preparación de la muestra y el subconjunto que bloquean entre los estudios que hace difícil comparar los resultados entre estos estudios. Lo importante, no existe un consenso en la demarcación de subconjuntos de monocitos, pero un enfoque estandarizado es esencial dada la importancia clínica de los cambios en proporciones de subconjunto en varias enfermedades. Parte de la dificultad de sincronización surge del hecho de que monocitos diferencian desde el clásico a través de la intermedia al subconjunto no clásica11 y como tal, monocitos existen como un espectro continuo en vez de poblaciones distintas12 . Interesante, Zawada et al demostró que utilizando ya sea una rectangular o trapezoidal que bloquean del subconjunto intermedio, resultó en un subconjunto más intermedio que predijo un endpoint cardiovascular13. Esto pone de relieve que, al menos para el cálculo de proporciones, la cuestión clave es aplicar una estrategia bloquea consistente entre diferentes muestras (estudios), en lugar de intentar discriminar definitivamente entre subconjuntos. Mientras que bloquean definitivo puede ser más importante al evaluar la función, el cambio en la expresión del marcador entre subconjuntos es incremental12,14, y así otra vez, consistencia en la compuerta sea clave. Como tal, se necesita un objetivo método reproducible adjudica los subconjuntos de monocitos entre diferentes muestras que bloquean. El propósito del método presentado aquí es subconjuntos de monocitos con una clara explicación de la puerta y justificación de la técnica bloquea empleadas y evaluar los subconjuntos para la expresión del marcador superficial, proporcionando un método que permite a los investigadores que confianza en el uso de esta técnica al evaluar diferentes muestras.

<table><tbody><tr><td>Kit de extracción de sangre BD vacutainer</td><td>Becton Dickinson 367286</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD vacuitainer K2E 5.5 mg más tubos de extracción de sangre -3.0 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>7128959</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada de fosfato (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>5ml tubo FACS de poliestireno de fondo redondo (estilo 12 mm x 75 mm)</td><td>Tecnologías Invitro</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>V450 Anticuerpo CD14 antihumano para ratones [M&phi; P9]</td><td>BD Biosciences</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>APC Anticuerpo monoclonal anti-CD16 para ratones [3G8]</td><td>Abcam Australia</td><td>ab140477</td><td></td></tr><tr><td>Por CP Anticuerpo anti-HLA-DR humano [L243]</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td></td></tr><tr><td>PE Ratón IgG1 &kappa; Control de Isotipo [MOPC-21]</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>555749 Lote # 4283901</td></tr><tr><td>Ratón PE Anticuerpo CD163 Antihumano [GHI/61]</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>556018 Lote # 2335626</td></tr><tr><td>Ratón PE Anticuerpo CD64 Antihumano [10.1]</td><td>BD Biosciences</td><td>558592</td><td>Lote # 36768</td></tr><tr><td>Ratón PE Anticuerpo CD86 Antihumano [2331 (FUN-1)]</td><td>BD Biosciences</td><td>555658</td><td>Lote # 3109766</td></tr><tr><td>Ratón PE Anti-humano Anti-humano CD11b/Mac-1 Anticuerpo [ ICRF44]</td><td>BD Biosciences</td><td>561001</td><td>Lote # 3228959</td></tr><tr><td>Ratón PE IgG2A Control de isotipo [20102]</td><td>R& D Systems</td><td>IC003P</td><td>Lote # 1212031</td></tr><tr><td>PE TNF humano RII/TNFRSF1B Anticuerpo [22235]</td><td>R& D Systems</td><td></td><td>FAB226P lote # 612051</td></tr><tr><td>ratón PE IgG1, &kappa; Control de Isotipo [MOPC-21]</td><td>BioLegend</td><td>400112</td><td>Lote # B220359</td></tr><tr><td>PE Anticuerpo CD93 Antihumano [VIMD2]</td><td>BioLegend</td><td>336107</td><td>Lote # B143544</td></tr><tr><td>Ratón PE Anticuerpo anti-CD3 humano [SK7]</td><td>BD Biosciences</td><td>347347</td><td>Lote # 3010929</td></tr><tr><td>Ratón PE Anticuerpo CD19 Anti-Humano [HIB19]</td><td>BD Biosciences</td><td>561741</td><td>Lote # 2307721</td></tr><tr><td>Ratón PE Anticuerpo anti-humano CD56 [B159]</td><td>BD Biosciences</td><td>561903</td><td>Lote # 3011796</td></tr><tr><td>PE Anticuerpo CD66b humano [G10F5]</td><td>BioLegend</td><td>305105</td><td>Lote # B154037</td></tr><tr><td>OptiLyse C</td><td>Beckman Coulter</td><td>A11895</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído 37%</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td> Analizador automático de <td></td><td></td></tr><tr><td>hematología, XT-1800i</td><td>Centrífuga Sysmex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GS-6R</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo software v10.0.7</td><td>Tree Star Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Los monocitos son colaboradores claves en diversos trastornos inflamatorios y alteraciones en estas células, incluyendo sus funciones y proporciones subconjunto pueden tener significación patológica. Un método ideal para examinar alteraciones de monocitos es citometría de flujo de la sangre como la mínima manipulación de las muestras por este método limita la activación de la célula artifactual. Sin embargo, muchos enfoques diferentes son llevados a los subconjuntos de monocitos hacia la identificación incompatible de los subconjuntos entre los estudios de la puerta. Aquí se demuestra un método mediante citometría de flujo de sangre para identificar y caracterizar subconjuntos de monocitos humanos (clásicos, intermedios y no clásica). Nos indican cómo preparar las muestras de sangre por citometría de flujo, los subconjuntos (Asegúrese de que se han eliminado las células contaminantes) de la puerta y determinar monocito subconjunto expresión de marcadores de superficie, en este ejemplo M1 y M2 los marcadores. Este protocolo puede ampliarse a otros estudios que requieren un método bloquea estándar para evaluar proporciones de subconjunto de monocito y monocitos subconjunto expresión de otros marcadores funcionales.

La estrategia bloquea monocito y el análisis de citometría de flujo utilizada aquí (figura 1) con éxito Country los subconjuntos de monocito y revelaron sus proporciones relativas. Se calcularon las proporciones (para este ejemplo) como clásicos de 88.1%, intermedios de 4.33% y 7.49% no-clásicos. Estas puertas de subconjunto no fueron contaminadas con células B, células T, neutrófilos o células NK, que fue confirmada con los marcadores CD19, CD3, CD56 y CD66b, respectivamente. Mediante la evaluación de la posición relativa de otras poblaciones, resulta claro que las células T y los neutrófilos caen fuera de la forma de monocitos "┐" en una parcela de CD16/CD14 (figura 2A y 2D). Sin embargo, las poblaciones de células B y las células NK se traslaparon con la población de monocitos no clásica (figura 2B y 2C). Los pasos de la estrategia de bloquea (figura 1 y 1E) confirmaron a excluir las células de B (figura 3B) y las células NK (Figura 3A). Aunque la población de células B incluye una pequeña porción de monocitos no clásica, la cantidad es insignificante.
Después de haber cerrado los subconjuntos, el grado en que expresaron diferentes marcadores de superficie, M1 (CD64, CD86 y CD120b) y M2 (CD163, CD11b y CD93) fue evaluada. Los marcadores mostraron expresión positiva en comparación con sus correspondientes controles de isotipo, como se ve por el cambio de los histogramas (figura 4). La mediana de los marcadores fue mayor que la de los controles de isotipo.
Aplicación de esta estrategia bloquea a una muestra de sangre, que se dividió en cuatro tubos, teñido y había analizado por separado, los resultados comparables los rendimientos entre tubos (tabla 4).
<img alt="Diagramas de dispersión de citometría de flujo; clasificación de células inmunitarias; diagrama; marcadores de CD; Análisis de subpoblaciones." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: monocito representante gating estrategia en sangre entera humana. (A) FSC(A) vs FSC(H) parcela: que bloquean las células que tienen un igual área y altura, eliminando así Matas (mayor FSC(A) FSC(H)) y escombros (muy bajo FSC) K = 1000. (B) FSC(A) vs SSC(A) parcela: amplia selección de monocitos basado en sus propiedades SSC/FSC. (C) CD16 vs CD14 parcela: compuerta para seleccionar monocitos basado en su forma característica "┐". (D) CD16 vs HLA-DR parcela: bloquea para seleccionar las células positivas de HLA-DR y eliminar las células NK. (E) CD14 vs HLA-DR: bloquea a excluir las células de B (HLA-DR alta/CD14 bajo) de los monocitos. (F) seleccionado vuelve a aparecer en CD16 vs CD14 parcela a puerta los subconjuntos de monocitos monocitos. A-F color representa la densidad celular con azul y verde que indica baja densidad, rojo y naranja que indica alta densidad y naranja que indica la densidad de la gama media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagramas de citometría de flujo de diferenciación de células inmunitarias: células T, B, NK, neutrófilos; Marcadores de CD." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: validación de bloquear la estrategia de identificación de contaminantes potencialmente células. Las células potencialmente contaminantes se identifican mediante marcadores (A) T células (CD3), linfocitos (B) B (CD19), células (C) NK (CD56) y (D) neutrófilos (CD66b). Los paneles del lado izquierdo Mostrar identificación de cada población después de compuerta según figura 1A y 1B, con el color que representa la densidad celular de alta (rojo) a baja (azul). Los paneles de la derecha muestran cada población celular (azul) superpuesta a la trama de CD16/CD14 monocitos final para revelar la proximidad de estas poblaciones de monocitos (rojo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis de citometría de flujo; diagramas de dispersión de monocitos, NK y células B por marcadores CD, distribución de datos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: confirmación que bloquea pasos eliminar células contaminantes. Calor mapas que muestren el grado de expresión de alta (rojo) a baja (azul) de CD56 (A) y (B) CD19. Pasos bloquea con éxito excluyen las células con alta CD56 (células NK) y alta CD19 (linfocitos B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráficos de citometría de flujo; marcadores M1, M2; Fenotipos de macrófagos: clásico, intermedio, no clásico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: expresión del monocito de M1 (CD120b) y M2 (CD93) marcadores. Alisado histogramas de monocito M1 y M2 marcador expresión (azul), mostrando claro cambio del isotipo (rojo) para (A) clásicos, productos intermedios (B) y (C) no-clásicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticuerpo</td>
			<td>Volumen (sangre de 50 μL)</td>
			<td>Sangre de 800 μl de volumen (x 16)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14 - V450</td>
			<td>0.75 ΜL</td>
			<td>12 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16 - APC</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
			<td>8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR-PerCP</td>
			<td>0,625 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Anticuerpos para el flujo de sangre y mezcla principal.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tubo</td>
			<td>Anticuerpos de PE</td>
			<td>Código</td>
			<td>Partido de isotipo</td>
			<td>Concentración stock</td>
			<td>Volumen de trabajo</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1,0 μg/20 μl</td>
			<td>0,625 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>CD163</td>
			<td>BD (556018)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0.125 μg/20 μl</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>CD64</td>
			<td>BD (558592)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0.06 μg/20μL</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1,0 μg/20 μl</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>CD86</td>
			<td>BD (555658)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1,0 μg/20 μl</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD (561001)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1,0 μg/20 μl</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>R &amp; D (IC003P)</td>
			<td>NA</td>
			<td>25 μg/mL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>CD120b (TNFRII)</td>
			<td>R &amp; D (FAB226P)</td>
			<td>R &amp; D IgG2a</td>
			<td>25 μg/mL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BL (400112)</td>
			<td>NA</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
			<td>2,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>CD93</td>
			<td>BL (336108)</td>
			<td>BL IgG1</td>
			<td>50 μg/mL</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: M1/M2-PE fluorocromo había etiquetado anticuerpos monoclonales para el flujo de sangre.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tubo</td>
			<td>Anticuerpo</td>
			<td>Volumen de trabajo</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>CD3</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>CD19</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>CD66b</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>CD56</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Fluorocromo PE había etiquetado anticuerpos monoclonales para linfocitos (células T, células B), neutrófilos y células NK.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tubo</td>
			<td>% Clásico</td>
			<td>% Intermedio</td>
			<td>% No clásico</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.11</td>
			<td>10.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>84.2</td>
			<td>5.05</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>84.3</td>
			<td>5.03</td>
			<td>10.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>81,6</td>
			<td>5.03</td>
			<td>12.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 4: Proporciones de subconjunto de monocitos de una sangre muestra teñidas y analizadas por separado.

Aquí presentamos un protocolo para la caracterización de subconjuntos de monocitos por citometría de flujo de sangre. Esto incluye delineando cómo los subconjuntos de la puerta y evaluar su expresión de marcadores de superficie y dando un ejemplo de la evaluación de la expresión de marcadores de M2 (antiinflamatorio) y M1 (inflamatoria).

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología. Por ejemplo, determinar cómo se alteran las proporciones de subconjuntos de monocitos, o la expresión de diferentes marcadores, en los estados de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica, es que las células están cerca de su estado nativo, y que se utilizan instrucciones claras y justificación, para proporcionar un método de medición estandarizado.Generalmente, los individuos nuevos en este método pueden tener problemas, porque muchos papeles no dan instrucciones claras sobre cómo se realizó el gating de las células. Comience este protocolo con la recolección de muestras de sangre y la determinación del recuento de glóbulos blancos, como se detalla en el protocolo de texto. Diluir la sangre con solución salina tamponada con fosfato, para ajustar la concentración a aproximadamente 5 millones de glóbulos blancos por mililitro.Preparar suficiente mezcla maestra para el número de tubos mediante la combinación de sangre, anti CD14-V450, anti CD16-APC y anti HLA-DR-PerCP. Vórtice y pipeta 51,9 microlitros de mezcla en cada tubo. Agregue anticuerpos marcadores M1 y M2 etiquetados por PE, así como marcadores para células T, células B, neutrófilos y células asesinas naturales a sus tubos correspondientes.Vórtice e incubar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Ahora, agregue 250 microlitros de la lysis combinada de glóbulos rojos y la solución de fijación de glóbulos blancos, e inmediatamente vórtice la mezcla, suavemente. Incubar la mezcla de vórtices durante 10 minutos en la oscuridad, a cuatro grados centígrados.Después de 10 minutos, agregue 250 microlitros de PBS y gire hacia abajo las células a 260 g, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y resuspendir las células en 300 microlitros de 1%formaldehído. Almacene las células en cuatro grados centígrados, protegidos de la luz hasta que se realice el análisis.La citometría de flujo debe realizarse dentro de las 48 horas posteriores a la preparación de la muestra. Para comenzar, compruebe el registro del citometro de flujo para asegurarse de que el personal de la instalación ha realizado comprobaciones de control de calidad. Para configurar el experimento de citometría de flujo, haga clic en un nuevo experimento, seguido de una nueva muestra y un tubo nuevo, para añadir tubos.Seleccione trazados bivariados, haciendo clic en el icono y utilice los menús desplegables para seleccionar los parámetros de acceso. Asegurar la inclusión de una gráfica CD16/CD14 y una gráfica que muestra un detector junto con el tiempo, para supervisar la adquisición. Inserte el tubo y haga clic, adquiera.Compruebe la configuración de voltaje del instrumento, asegurándose de que las señales del detector no estén fuera de escala. Observe las células que caen en la compuerta de monocitos de la gráfica CD14/CD16. Establezca el umbral de grabación en 5.000 eventos para la puerta de monocitos clásicos y haga clic en grabar.Continúe registrando los datos de los tubos restantes. Una vez registrados los datos de todos los tubos, exporte los datos de flujo como archivos fcs para su análisis. Para realizar la gating de monocitos, abra archivos en el software de análisis, haga doble clic en el nombre del tubo y seleccione parámetros en los menús desplegables para visualizar las celdas en un gráfico de dispersión hacia delante frente frente a la altura de dispersión hacia delante.Cree una puerta de exclusión de doblete, haciendo clic en el icono de la herramienta de puerta poligonal y encerrando las celdas. Seleccione las celdas cerradas haciendo doble clic en la región cerrada. En el nuevo cuadro de visualización, ajuste los parámetros del menú desplegable para mostrar las celdas en un área de dispersión hacia delante frente a la gráfica de área de dispersión lateral.Haga clic en el icono de la puerta rectangular, y seleccione generosamente la población de monocitos, en función de las propiedades de dispersión hacia adelante y lateral, para excluir la mayoría de los linfocitos, células asesinas naturales y granulocitos. Seleccione las celdas cerradas y vuelva a mostrarlas en un trazado CD14/CD16, seleccionando los parámetros mediante los menús desplegables. Haga clic en la puerta poligonal para seleccionar monocitos en función de su característica, forma l invertida.Si la población no clásica no es distinta de las células a su izquierda, entonces la contaminación es probable y debe ser investigada. Seleccione las celdas cerradas y muestre los monocitos en un trazado CD/16 HLA-DR, utilizando los menús desplegables para seleccionar parámetros. Haga clic en la puerta poligonal para seleccionar las celdas positivas HLA-DR y excluir las células asesinas naturales restantes y neutrófilos.Seleccione las celdas cerradas y muestre las celdas positivas HLA-DR en un trazado CD14/HLA-DR utilizando menús desplegables para seleccionar parámetros. Haga clic en la puerta poligonal y dibuje una puerta para excluir las celdas B bajas HLA-DR altas/CD14 bajas. Seleccione las celdas cerradas y utilice los menús desplegables para mostrarlas en un trazado CD16/CD14.En opciones de trazado, seleccione trazado de cebra, que permitirá dibujar puertas de subconjunto de monocitos, para determinar las proporciones de subconjuntos. Ahora, haga clic en el icono de puerta rectangular y seleccione los monocitos clásicos dibujando una puerta rectangular aproximada alrededor de la población de monocitos clásicos altos/CD16 CD14. En la pantalla, seleccione, muestre las medianas para mostrar la intensidad de fluorescencia media para los monocitos clásicos.Ajuste la puerta de modo que la población tenga una distribución igual de la mediana a la izquierda y a la derecha, y esté abarcando todas las celdas a la izquierda. Seleccione la población intermedia dibujando una puerta rectangular que abarque las celdas a la derecha de la puerta clásica. Ajuste la parte inferior de la puerta para excluir las celdas no clásicas, alineando la puerta con la parte inferior de los círculos concéntricos, que están completamente dentro de la puerta de monocitos clásica.A puerta del subconjunto no clásico, dibujando un cuadro rectangular desde el borde inferior del subconjunto intermedio, seleccionando todas las celdas hasta la parte inferior de la población. En pantalla, seleccione Mostrar frecuencias de compuerta para determinar el porcentaje de cada subconjunto de monocitos. Por último, seleccione celdas de cada subconjunto de monocitos.Modifique los parámetros desplegables para crear un histograma para cada subconjunto de monocitos, mostrando cada marcador. A continuación, calcule el grado de expresión, utilizando la mediana o la media geométrica, como se describe en el protocolo de texto. Las poblaciones de monocitos cerrados con éxito se muestran aquí.Y las proporciones están en línea con las de la literatura. Las proporciones de esta muestra se calcularon como 88,1% clásica, 4,33%intermedios y 7,49% no clásicas. Al evaluar la posición relativa de otras poblaciones, está claro que las células T y neutrófilos mostrados aquí en azul, siguen muy fuera del monocitos, forma l invertida, en una gráfica CD16/CD14.Sin embargo, tanto las células asesinas naturales como las poblaciones de células B, que se muestran aquí en azul, se solapaban con la población monocitos no clásica. Los mapas de calor que confirman que se han eliminado los tipos de células contaminantes se muestran aquí. Las células asesinas naturales han sido cerradas por el paso HLA-DR CD16, mientras que las células B han sido cerradas por el paso HLA-DR CD/14.La expresión de los marcadores M1 y M2 en azul, en relación con sus controles de isotipo en rojo, se muestra aquí. CD120b un marcador M1, muestra un desplazamiento claro por encima de su control de isotipo, para todos los subconjuntos de monocitos. Este es también el caso de CD93 un marcador M2, con la expresión más alta en clásico, moderada en los intermedios y baja en no clásica.Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que las celdas contaminantes están cerradas, ya que de lo contrario pueden contribuir a la expresión cuantificada. Después de este procedimiento, se pueden examinar otros marcadores. Para responder preguntas adicionales, como cómo cambia la expresión de marcadores de monocitos en la enfermedad.No olvide que trabajar con sangre humana y formaldehído puede ser peligroso, por lo que siempre se deben tomar precauciones como, equipo de protección personal y el uso de una capucha de riesgo biológico, siempre deben tomarse al realizar este procedimiento.

characterization-human-monocyte-subsets-whole-blood-flow-cytometry

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un dispositivo de microfluidos automatizado fue desarrollado para la circulación de enriquecimiento de células nucleadas de sangre periférica mediante lisis de los eritrocitos que garantiza el aislamiento de la muestra de alta calidad sin pérdida de células.

Automatizada de sangre de microfluidos Protocolo de lisis para el Enriquecimiento de la circulación las células nucleadas

Este video muestra una técnica basada en citometría de flujo que utiliza dos fluorocromos para identificar linfocitos T CD4+ y CD8+, linfocitos T γδ, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK) y monocitos en linfocitos mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs). Al incubar las células con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra los marcadores de superficie, los subconjuntos de células se identifican utilizando una estrategia óptima de activación por citometría de flujo.

Ensayo de citometría de flujo para identificar subconjuntos de células inmunitarias en células mononucleares de sangre periférica

Macrófagos derivados de monocitos son células importantes del sistema inmune innato. A continuación, describimos un fácil de...

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

El uso de la toma de muestras por citocepillo para recolectar linfocitos y monocitos del endocérvix es una técnica mínimamente invasiva que proporciona muestras para el análisis de la inmunidad del tracto genital femenino. En este protocolo, describimos la recolección de muestras de citocepillo y el aislamiento de células inmunitarias para ensayos de citometría de flujo.

Colección, Aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales Humano

Los monocitos son componentes integrales del sistema inmune innato humano que dependen del metabolismo glucolítico cuando se activan. Describimos un protocolo de citometría de flujo para medir la expresión del transportador de glucosa y la absorción de glucosa por monocitos totales y subpoblaciones de monocitos en sangre total fresca.

Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera

Este estudio compara dos métodos diferentes de aislamiento de monocitos humanos para obtener células dendríticas (CD) in vitro. Los monocitos se seleccionan por adherencia o se enriquecen negativamente por separación magnética. Se comparará el rendimiento y la viabilidad de los monocitos junto con la viabilidad, la proliferación y la expresión de marcadores de superficie CD11c/CD14 entre ambos métodos.

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Aquí, demostramos cómo se aíslan los monocitos mediante la separación magnética de perlas de las células mononucleares de sangre periférica después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana anticoagulada. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos se diferencian en células dendríticas inmaduras y están listos para procedimientos experimentales en un entorno no clínico.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Aquí describimos un enfoque proteómico unicelular para evaluar inmunológico fenotípico y funcional (inducción de citocinas intracelulares) alteraciones en las muestras de sangre periférica, analizadas mediante citometría de masas.

Análisis unicelular de Immunophenotype y producción de citoquinas en sangre periférica por citometría de masas

Aquí, presentamos un protocolo integrado que mide la subpoblación de monocito tráfico bajo flujo in vitro por el uso de marcadores de superficie específicos y microscopía de fluorescencia confocal. Este protocolo puede utilizarse para explorar medidas de reclutamiento secuencial así como a otros subtipos de leucocitos usando otros marcadores de superficie específicos del perfil.

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

El aislamiento de células de implantes disecados y su caracterización por citometría de flujo puede contribuir significativamente a la comprensión del patrón de respuesta inmune contra implantes. En este trabajo se describe un método preciso para el aislamiento de células de implantes disecados y su tinción para el análisis citométrico de flujo.

Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

Aprenda a caracterizar subconjuntos de monocitos humanos mediante citometría de flujo en sangre completa. Este protocolo estandarizado permite evaluar marcadores M1 y M2 con células en estado nativo.

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Explorar más videos