Name: Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprende a aislar arteriolas de la retina de rata para estudios de fisiología celular ex vivo. Este protocolo permite investigar la contractilidad del músculo liso vascular y la regulación del flujo sanguíneo retiniano en condiciones fisiológicas.

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Desarrollo de los protocolos descritos en este trabajo fue apoyado por subvenciones de los organismos de financiamientos siguientes: BBSRC (BB/I026359/1), lucha para la vista (1429 y 1822), la Fundación de investigación de Diabetes Juvenil (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D División (STL/4748/13) y MRC (MC_PC_15026).

<ol><li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li>
<li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients%2C+ocular+hypertensives%2C+and+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li>
<li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+lesions+of+diabetic+retinopathy%3A+clues+towards+understanding+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?</a> Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease).</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voorde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+in+the+Retinal+and+Choroidal+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation.</a> Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).</li>
<li>Metea, M. R., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+dilate+and+constrict+blood+vessels%3A+a+mechanism+of+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling.</a> Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Shepro, D., Morel, N. M. <a target="_blank" href="https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.7.11.8370472">Pericyte physiology.</a> The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Blood+Flow+in+the+Retinal+Trilaminar+Vascular+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).</li>
<li>Matsushita, K., Puro, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779733/">Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes.</a> Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).</li>
<li>Needham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K%2B+and+Cl-+channels+in+the+regulation+of+retinal+arteriolar+tone+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).</li>
<li>Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vasomotion+in+porcine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologicaogica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles.</a> Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voord, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+myogenic+responses+in+isolated+bovine+retinal+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).</li>
<li>Kur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ion+channels+and+subcellular+Ca2%2B+signaling+in+arachidonic+acid-induced+dilation+of+pressurized+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).</li>
<li>Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+sparks+promote+myogenic+tone+in+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles.</a> British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).</li>
<li>Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV3.1+T-Type+Ca2%2B+Channels+Contribute+to+Myogenic+Signaling+in+Rat+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV2+Channels+Contribute+to+Stretch-Activated+Cation+Currents+and+Myogenic+Constriction+in+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).</li>
<li>Guidoboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Pressure%2C+Blood+Pressure%2C+and+Retinal+Blood+Flow+Autoregulation%3A+A+Mathematical+Model+to+Clarify+Their+Relationship+and+Clinical+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).</li>
<li>Scholfield, C. N., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+cytosolic+calcium+regulation+among+different+microvascular+smooth+muscle+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina.</a> Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single+Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single Channel Recording, Second Edition</a>. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).</li>
<li>Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791(2014).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2%2B-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+1+stimulates+Ca2%2B-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+assembly+of+TRPV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the assembly of TRPV channels.</a> Structure. 22 (2), 260-268 (2014).</li>
<li>McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-type+potassium+current+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).</li>
<li>McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+downregulation+of+the+BKbeta1+subunit+in+diabetic+arteriolar+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes.</a> Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li>
<li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+arteriolar+diameter+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).</li>
<li>Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constriction+of+porcine+retinal+arterioles+induced+by+endothelin-1+and+the+thromboxane+analogue+U46619+in+vitro+decreases+with+increasing+vascular+branching+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).</li>
<li>P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li>
</ol>

Dr. Joanna Kur es ahora un empleado de Medtronic (ciudades gemelas, Minnesota, USA), su actual trabajo no entra en conflicto con la presentada aquí.

Los protocolos descritos anteriormente requieren práctica pero deben ser con un mínimo de resolución de problemas. En un día normal obtener arteriolas utilizables de 6-8 desde el aislamiento y lograr experimentos exitosos de 3-4. Si se encuentran problemas, sin embargo, hay algunos pasos que pueden tomarse para ayudar a mejorar las tasas de éxito. En ocasiones hemos encontrado, especialmente en ratas jóvenes (< 8 semanas), que el rendimiento de las arteriolas puede ser bajo. Para evitar este problema, sugerimos que el tejido retiniano (10-30 s a 500 x g) entre cada uno de la trituración de la centrifugación los pasos en pasos 1.12-1.14. Esto a menudo ayuda a mejorar el rendimiento de los barcos pero también aumentará la cantidad de restos de células dentro de la preparación.
Cuando canular vasos estudios miografía de presión es importante comprobar las arteriolas cuidadosamente para cualquier ramas laterales que pueden haber sido troceados cerca del sitio de la bifurcación. Esto representa una causa frecuente de fugas y pérdidas de presión durante la experimentación. El principal problema que puede surgir con los [Ca2 +] protocolos es el nivel de carga de tinte. Carga de tinte pobre conduce a proporciones bajas de señal a ruido, mientras se sobrecarga el resultado en la interrupción de la normal homeostasis de Ca2 + . Para reducir la probabilidad de que cualquiera de estas cuestiones, puede extraerse una pequeña alícuota de homogeneizado de retina y vasos aislados controlar periódicamente durante el protocolo de carga. Cuando la empresa experimentos de patch-clamp, la tasa de éxito de formación gigaseal es bien depende en gran medida de cómo la lámina basal ha sido digerida. Cuando inicialmente prueba este protocolo o utilizando nuevos lotes de enzimas puede ser necesario ajustar la concentración/duración de la digestión de la enzima. Supervisar cuidadosamente la separación de las capas endoteliales y músculo liso garantizará suficiente digestión quitar bastante basal laminal para acceder. También es necesario evitar la digestión excesiva, que puede manifestarse como el buque comienza a constrict monitoreo cuidadoso. Si esto ocurre, las células musculares lisas son a menudo demasiado frágiles para la grabación de patch clamp. Aplicación de enzimas, es importante incluir DNasa I para asegurar el retiro de cadenas de ADN liberados de las células dañadas durante el proceso de aislamiento. Fragmentos de ADN son pegajosos y causar el fórceps para adherirse a la arteriola durante las etapas finales del proceso de limpieza (paso 4.4), a menudo dando por resultado pérdida del buque. Limpieza de los vasos es técnicamente difícil y se realiza mejor a gran aumento (20 X) con movimientos suaves de barrido de pinzas cerradas del diámetro más fino posible punta. Entre barridos, limpie la pinza de rodillo del laboratorio.
Como se destacó antes, una motivación clave en el desarrollo de los protocolos descritos en este manuscrito era entender mejor por qué el flujo sanguíneo se interrumpe durante enfermedades vasculares de la retina. La mayor parte de nuestro trabajo hasta la fecha se ha centrado en la enfermedad de ojo diabética28,33. Las arteriolas pueden ser aisladas de las retinas de modelos experimentales de roedores de la diabetes mediante los métodos descritos en la sección 1. Cuando experimentando en arteriolas retinianas aisladas de animales diabéticos, es importante intentar replicar estrechamente las condiciones hiperglucémicos por barcos en vivo. Por esta razón, normalmente sería elevar los niveles D glucosa en nuestras soluciones experimentales a 25 mM y aislamiento. Engrosamiento de las membranas del sótano vasculares es un fenómeno bien reconocido en los vasos retinianos en diabetes34,35. Tratándose de animales con diabetes prolongada (duración de la enfermedad de > 1 meses), las concentraciones de la enzima mayor o tiempos de digestión a menudo se necesitan para permitir la aplicación de métodos de grabación de patch-clamp.
Una importante limitación del uso de ex vivo aislados arteriolas retinianas a estudiar fisiología vascular retiniana y Fisiopatología es la pérdida de los neuropilos de retina circundante. Aunque la eliminación de las células neuronales y gliales retinianas permite fácil acceso a las células del músculo liso vascular retiniano para estudios de fisiología celular, la respuesta de los vasos a mediadores vasoactivos puede cambiar dramáticamente en la ausencia y presencia de retina tejido. Las acciones de la adenosina tri-fosfato (ATP), por ejemplo, proporcionan una buena ilustración de este punto. En aislados arteriolas retinianas, además de ATP los disparadores de la rata una robusta constricción de los vasos36, mientras que en la presencia de un neuropilos intacto, los vasos se dilatan37. Por lo tanto, siempre que sea posible, generalmente tratamos de validar los resultados claves de los preparativos de la arteriola aislados utilizando ex vivo retinal todo-montajes y mediciones en vivo de vaso diámetro y sangre flujo16,37 . De la nota, nuevos métodos han surgido recientemente para el estudio de las pequeñas arteriolas y capilares en toda perfundidos porcina retinas ex vivo38,39. Estas preparaciones suelen mejorar grandemente nuestra comprensión de cómo los neuropilos retina regula tono arteriolar y capilar retiniano y cómo cambios en la hemodinámica retiniana modulan la actividad neuronal en la retina.
Aunque los procedimientos descritos en este documento se centran en el uso de arteriolas retinianas aislado de rata para fisiología comprensión de la célula del músculo liso arteriolar, actualmente estamos desarrollando protocolos para permitir también el estudio de la función endotelial de la célula en estos vasos. En trabajos previos, hemos tenido éxito en la modificación de la digestión enzimática de segmentos arteriolares retinianos para producir tubos de células endoteliales viables que son susceptibles de Ca2 + imagen y patchclamp estudios de grabación. Canulación de las arteriolas aisladas en ambos extremos, permitiendo intramural entrega de drogas, en el futuro podría también activar dependiente del endotelio respuestas vasodilatadoras investigarse en estos vasos.

Entender cómo se controla el flujo sanguíneo en la retina es un objetivo importante, ya que el flujo de sangre anormal se ha implicado en la patogenia de una gran variedad de avistar-que amenaza enfermedades de la retina1,2,3, 4. La circulación retiniana, que provee las células gliales y neuronas retinianas internas, tiene un arreglo de la arteria extremo, con toda la sangre de las arterias retinianas y arteriolas pasando por los capilares a las vénulas retinianas y finalmente las venas5. Flujo sanguíneo en la retina está regulado por el tono de las arterias retinianas y arteriolas así como la actividad contráctil del pericitos situado en las paredes de los capilares de la retina y vénulas post capilares6,7, 8. el control del tono vascular retiniano es complejo y es modulado por una variedad de entradas desde el sistema circulatorio y el tejido retiniano circundante, incluyendo gasometría arterial, circulación de moléculas y hormonas, y sustancias vasoactivas liberados de la retina vascular endotelio y macroglía9,10,11. Las arteriolas retinianas son las pequeñas ramas arteriales de la retina y se componen de una sola capa de células musculares lisas vasculares y un revestimiento interior de longitudinalmente dispuestas las células endoteliales12,13, 14. estos vasos forman el sitio web principal de la resistencia vascular en la circulación retiniana y por lo tanto juegan un papel importante en el control local del flujo sanguíneo retiniano. Arteriolas retinianas regulan el flujo sanguíneo capilar en la retina por dilatación o constricción su diámetro luminal, mediada por cambios en la contractilidad del músculo liso vascular10,15,16. Comprensión de los mecanismos moleculares a través de que retina las arteriolas regulan la perfusión retiniana por lo tanto requiere preparaciones donde las células del músculo liso arteriolar pueden acceder y estudiadas en condiciones como a fisiológico como sea posible.
Ex vivo preparaciones de vasos sanguíneos retinianos aislados proporcionan acceso a las células de músculo liso vascular, mientras que sigue manteniendo su funcionalidad y su interconexión con el endotelio subyacente. Mayoría de los estudios hasta la fecha usando los recipientes aislados se ha centrado en bovinos o porcinos arteriales vasos (60-150 μm). Estas pueden montarse en alambre comercialmente disponible o sistemas de presión de la laringe para permitir interrogatorios farmacológica del músculo liso vascular células mecanismos contráctiles17,18. Estas preparaciones han contribuido enormemente a nuestro conocimiento de la fisiología vascular retiniana en condiciones normales. Pocos estudios han utilizado arteriolas retinianas aisladas de animales de laboratorio pequeños como su diámetro más pequeño (~ 8-45 μm) impide su uso en sistemas convencionales de miografía19,20,21,22. Una ventaja importante, sin embargo, utilizando embarcaciones de animales de laboratorio pequeños es la amplia disponibilidad de modelos de enfermedad retiniana, transgénicos y genéticamente modificados. Animales de laboratorio pequeños también son más susceptibles para estudios de intervención en vivo .
Aquí describimos protocolos sencillos para aislar y canular arteriolas retinianas de ratas para los experimentos miografía de presión. CA2 + proyección de imagen y electrofisiología protocolos utilizando estas embarcaciones también se detallan. Estos pueden proporcionar otras penetraciones en la regulación de la contractilidad del músculo liso vascular y flujo sanguíneo en la retina.

<table><tbody><tr><td>Vasos de precipitados</td><td>Fisherbrand</td><td>15409083</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Tijeras curvas</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-109-3542</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Pipeta de plástico desechable / de transferencia</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6mL es mejor, pero otros tamaños son aceptables; Retire la punta para ampliar la apertura</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Brunel Microscopes LTD</td><td></td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5 14095</td><td>Cualquier pinza fina equivalente</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Fisherbrand 11546963</td><td></td><td>Pulida al fuego para reducir la fricción pero no lo suficiente como para estrechar la punta</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741</td><td>O cualquier producto equivalente de 10 cm</td></tr><tr><td>Tetina</td><td>de pipeta Fisherbrand</td><td></td><td>12426180 O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Suministro de agua purificada</td><td>Merek</td><td>Milli-Q Sistema Integral de Purificación de Agua</td><td>O cualquier sistema equivalente</td></tr><tr><td>Tubo de ensayo de fondo redondo</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL; cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Pinzas dentadas</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-230</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Cuchillas de un solo filo</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>O cualquier superficie flexible&nbsp;</td></tr><tr><td>Bastidor de tubos de ensayo</td><td>Fisherbrand Derlin</td><td>10257963</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Miografía</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>a presión manipulador mecánico de 3 ejes</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>x2 (o cualquier producto equivalente)</td></tr><tr><td>Grifería de 3 vías</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Mesa de aire</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Banco</td><td>limpio o cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Software de análisis&nbsp;</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Software de imagen gratuito</td></tr><tr><td>Plugin de análisis</td><td>Myotraker&nbsp;</td><td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td><td>Plugin personalizado para imageJ Disponible gratuitamente para descargar</td></tr><tr><td>Pipeta de canulación de vidrio</td><td>Instrumentos de percisión del mundo</td><td>TW150F-4</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Computadora</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Termómetro digital</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Fluo-4-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>Hacer 1 mM de culata en DMSO</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #7 14097</td><td>Cualquier pinza fina equivalente</td></tr><tr><td>Fura-2-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1221</td><td>Hacer 1 mM de culata en DMSO</td></tr><tr><td>Cámara de grabación con fondo de vidrio</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Vidrio</td> <td>de pipeta auxiliarInstrumentos de percusión mundial</td><td>IB150F-3</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Calentador en línea Hecho</td><td>a medida</td><td></td><td>Calentador en línea de solución comercial equivalente SH-27B de Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Manómetro</td><td>Riester</td><td>LF1459</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Extractor</td> <td>de microelectrodosInstrumentos Sutter</td><td>P97</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Microscopio Olympus CX 31</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter instruments</td><td>MP-285</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Colector de suministro multicanal&nbsp;</td><td>Automate Scientific</td><td>Perfusion Pencil</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Relleno de pipetas&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Jeringa calentada y estirada al diámetro interno de la pipeta</td></tr><tr><td>Soporte de pipeta</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Bomba de succión</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Bomba de aireación convertida por fuelle invertible</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Alambre de tungsteno</td><td>Advent</td><td>W558818</td><td>75&mu; m de diámetro</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>tamaños varios</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Cámara USB</td><td>&nbsp; Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Software de captura de vídeo</td><td>Hypercam</td><td>versión 2.28.01</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>x20 lente</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>x4 lente</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Conectores en Y World</td><td>Percision Instruments</td><td>14012</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Abrazadera</td><td></td><td></td><td></td>de parche</tr><tr><td>de 3 vías</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>manipulador mecánico de 3 ejes</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr>Corporación de fabricación técnica de <td>la mesa de aire</td><td>&nbsp;</td><td>Banco limpio</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>3 mg disueltos diariamente en 50 &mu; L de DMSO (sonicato para disolver)</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>Axopatch 200a</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Convertidor digital analógico</td><td>Axon</td><td>Digidata 1440A</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891&nbsp;</td><td>0,1 mg/ml en HCL</td></tr><tr><td>Computadora</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Termómetro digital</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Millipore</td><td>260913</td><td>Material de trabajo 1 MU mL-1 (10 MU diluido en 10 mL LCH)&nbsp;</td></tr><tr><td>Jaula de Faraday</td><td>Hecho a</td><td></td> medida <td>Cualquier producto comercial equivalente</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Dumont</td><td>No. 7</td><td>Cualquier pinza superfina</td></tr><tr><td>Cámara de grabación con fondo de vidrio</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Calentador en línea Hecho</td><td></td> <td>a medida</td><td>Equilavent comercial SH-27B Solución Calentador en línea de Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Extractor de microelectrodos</td><td>Sutter instruments</td><td>P97</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Microscopio Olympus CX 31</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter instruments</td><td>MP-285</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Colector de suministro multicanal&nbsp;</td><td>Automatice Scientific</td><td>Perfusion Pencil</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Software de parcheo</td><td>Molecular Devices</td><td>Pclamp v10.2</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Pipeta filler&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Jeringa calentada y estirada hasta el diámetro interno de la pipeta Soporte de</td></tr><tr><td>pipeta</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Proteasa Tipo XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147&nbsp;</td><td>0,01 mg/ml en HCL</td></tr><tr><td>Pipeta monocanal de vidrio</td><td>World Percision instruments</td><td>IB150F-3</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Bomba de succión</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Bomba de aireación convertida por fuelle invertible</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Alambre de tungsteno</td><td>Advent</td><td>W557418</td><td>50&mu; m de diámetro</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>varios tamaños</td><td>Cualquier producto equivalente para adaptarse a</td></tr> la <tr><td>cámara USB</td><td>&nbsp; Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Pipeta de celda entera</td><td>vidrio Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>x20 lente</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>x4 lente</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>x40 lente Nikon</td><td></td><td>40x/0.55, WD 2.1, &infin;/1.2</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Conectores en Y World</td><td>Percision Instruments</td><td>14012</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Ca2+ de imagen</td> grifos de 3 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vías</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>de 3 ejes manipulador mecánico</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Software de adquisición&nbsp;</td><td>Cairn Investigación Ltda.</td><td>Motor de adquisición V1.1.5</td><td>O cualquier producto equivalente; microfluorimetría</td></tr><tr><td>Mesa de aire</td><td>Corporación Técnica de Fabricación&nbsp;</td><td>Banco</td><td>limpio O cualquier producto equivalente Software de</td></tr><tr><td>análisis para imágenes confocales</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Software de imagen gratuito</td></tr><tr><td>Computadora</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica Geosystems</td><td>SP5&nbsp;</td><td>O cualquier producto equivalente; confocal</td></tr><tr><td>Termómetro digital</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Dumont</td><td>No. 7</td><td>Cualquier pinza superfina</td></tr><tr><td>Cámara de grabación con fondo de vidrio</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Calentador en línea Hecho</td><td>a medida</td><td></td><td>Equilavent comercial SH-27B Solución Calentador en línea de Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Invertido microscopio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000</td><td>O cualquier producto equivalente; microfluorimetría</td></tr><tr><td>Monocromador&nbsp;</td><td>Cairn Investigación Ltda.</td><td>Optoscan</td><td>O cualquier producto equivalente; microfluorimetría</td></tr><tr><td>Colector de suministro multicanal&nbsp;</td><td>Automate Scientific</td><td>Perfusion Pencil</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Relleno de pipetas&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Jeringa calentada y estirada al diámetro interno de la pipeta</td></tr><tr><td>Software para microscopio confocal</td><td>Leica Geosystems</td><td>LAS-AF versión 3.3.</td><td>O cualquier producto equivalente; confocal</td></tr><tr><td>Bomba de aspiración</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Bomba de aireación convertida por fuelle inversor</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Alambre de tungsteno</td><td>Advent</td><td>W557418</td><td>50&mu; m de diámetro</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>varios tamaños</td><td>Cualquier producto equivalente para adaptarse Baño</td></tr><tr><td>de agua</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>O cualquier producto equivalente</td></tr><tr><td>Lente Nikon x100</td><td></td><td>N.A. 1.3 aceite</td><td>O cualquier producto equivalente; microfluorimetría</td></tr><tr><td>lente x20</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>O cualquier producto equivalente; microfluorimetría</td></tr><tr><td>Lente x20</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, &infin;/0.17/D</td><td>O cualquier producto equivalente; lente confocal</td></tr><tr><td>x4</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>O cualquier producto equivalente; microfluorimetría</td></tr><tr><td>lente x63</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS &infin;/0.17/E</td><td>O cualquier producto equivalente; conectores Y confocales</td></tr><tr><td></td><td>World Percision Instrumentos</td><td>14012</td><td>O cualquier producto</td></tr> <tr><td>equivalentePipetas</td><td></td><td></td><td>Especificaciones y ajustes para la fabricación de pipetas para experimentación</td></tr><tr><td>Helper pipeta</td><td>World Percision instruments</td><td>IB150F-3</td><td>Diámetro interior: 0,86 mm Rampa: 261 Presión: 300 Calor: 280 Tirón : 0 Velocidad: 56 Tiempo: 250 Nº de ciclos: 4 Diámetro de la punta: 0.5-2 &mu; m Pulido: sí Resistencia final: >10 M&Omega;</td></tr><tr><td>Pipeta de canulación</td><td>World Percision instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Diámetro interior: 1,17 mm Rampa: 290 Presión: 300 Calor: 280 Tirón: 0 Velocidad: 58 Tiempo: 150 Nº de ciclos: 4 Diámetro de la punta: 3-10 &mu; m Pulido: no Resistencia final: < 1 M&Omega;</td></tr><tr><td>Parcheo en celda</td><td>Instrumentos World Percision</td><td>IB150F-3</td><td>Diámetro interior: 0,86 mm Rampa: 261 Presión: 300 Calor: 280 Tirón: 0 Velocidad: 56 Tiempo: 250 Nº de ciclos: 4 Diámetro de la punta: 0,5-2 &mu; m pulido: sí resistencia final: >5 M&Omega;</td></tr><tr><td>Parcheo de celda completa</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>Diámetro interior: 1.17 mm Rampa: 296 Presión: 200 Calor: 287 Tirón: 0 Velocidad: 50 Tiempo: 250 Nº de ciclos: 4 Diámetro de la punta: 2-3 &mu; m Pulido: útil pero no necesario Resistencia final: 1-2 M&Omega;</td></tr></tbody></table>

aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular ex vivo

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

La retina es un tejido metabólicamente muy activo que requiere una fuente substancial de la sangre. La circulación retiniana compatible con la retina interna, mientras que los vasos coroides fuente de los fotorreceptores. Alteraciones en la perfusión retiniana contribuyan a numerosas enfermedades avistar-que amenaza, incluyendo retinopatía diabética, glaucoma y retina rama oclusiones de la vena. Comprender los mecanismos moleculares implicados en el control del flujo de sangre a través de la retina y cómo estos se alteran en la enfermedad ocular podría conducir a la identificación de nuevas dianas para el tratamiento de estas condiciones. Arteriolas retinianas son los vasos de resistencia principal de la retina y por lo tanto, juegan un papel clave en la regulación hemodinámica retiniana a través de cambios en el diámetro luminal. En los últimos años, hemos desarrollado métodos para aislar las arteriolas de la retina de rata que son convenientes para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo estudios de fisiología celular. Esta preparación ha comenzado ya a producir nuevos conocimientos sobre cómo el flujo de sangre es controlado en la retina y nos ha permitido identificar algunos de los cambios claves que ocurren durante la enfermedad ocular. En este artículo, describir los métodos para el aislamiento de arteriolas de retina de rata e incluir protocolos para su uso en estudios miografía presión, proyección de imagen de calcio y electrofisiología patch-clamp. Estos buques también son susceptibles para su uso en PCR, western blot y immunohistochemistry basado en los estudios.

Este manuscrito describe un protocolo simple para el aislamiento de las arteriolas de la retina de rata que puede utilizarse en, calcio presión y proyección de imagen de miografía estudios electrofisiológicos.

Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Comprender cómo se controla el flujo sanguíneo en la retina es un objetivo importante, ya que el flujo sanguíneo anormal se ha implicado en el desarrollo de una variedad de enfermedades de la retina que amenazan la vista, como la retinopatía diabética, el glaucoma y las oclusiones de las venas ramificadas. Las arteriolas de la retina juegan un papel clave en la regulación del flujo sanguíneo en la retina al dilatar y constreñir su diámetro luminal, mediado por cambios en la contractilidad de las células musculares lisas que rodean estos vasos. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación de la perfusión retiniana requiere preparaciones en las que se pueda acceder a las células del músculo liso arteriolar de la retina y estudiarlas en condiciones lo más cercanas posible a las fisiológicas.En este video, demostramos un protocolo sencillo para el aislamiento de arteriolas de la retina de rata que se puede usar en estudios de pinza de parche, imágenes de calcio y miografía de presión. En los últimos años, esta preparación se ha utilizado para proporcionar más información sobre la regulación de la contractilidad del músculo liso vascular y el flujo sanguíneo en la retina tanto en la salud como en la enfermedad. Prepare una solución de un litro de HCL de Hanks o LCH con bajo contenido de calcio, como se muestra en la tabla de materiales.Ensamble el equipo de aislamiento antes de la recolección de tejido. La pipeta Pasteur de vidrio debe pulirse al fuego para alisar, pero no estrechar la punta. Recorte una pipeta de plástico a una apertura de aproximadamente cinco a siete milímetros.Coloque los ojos en la placa de disección, sumergida en una solución de HCL. Use un juego de pinzas para anclar el ojo a la placa sosteniendo las inserciones del músculo orbital o el nervio óptico. Asegúrese de que el punto de anclaje esté lo más cerca posible de la esclerótica para estabilizar el ojo.Con la cuchilla, corte la córnea a lo largo de la ora serrata y retire el cristalino presionando suavemente la esclerótica con pinzas. La pequeña región circular que vemos en la parte posterior del ojo en esta imagen es el nervio óptico. Con la cuchilla, corte el ocular por la mitad simétricamente a través del disco óptico.Con pinzas cerradas, cepille suavemente las retinas de las dos mitades del ocular, teniendo cuidado de quitar los accesorios restantes en el disco óptico. Repita el proceso con el segundo ojo y transfiera las retinas disecadas al tubo de ensayo con la pipeta de plástico y una pequeña gota de medio de HCL. Con la pipeta de plástico, llene el tubo de ensayo con HCL hasta aproximadamente cinco mililitros y permita que las retinas se asienten en el fondo del tubo.Lave el tejido aproximadamente tres veces extrayendo aproximadamente cuatro mililitros de solución del tubo y agregando HCL fresca con la pipeta de plástico. Cuando sea necesario, se debe extirpar el tejido extraño. Lave el interior de la pipeta Pasteur de vidrio con punta pulida con LCH para evitar que el tejido se pegue a la pipeta.Con la misma pipeta, extraiga aproximadamente cuatro mililitros de solución del tubo de ensayo y agregue aproximadamente dos mililitros de HCL fresca. Disocie suavemente las retinas arrastrando el tejido a través de la punta de la pipeta de vidrio lentamente y expulse el contenido al tubo de ensayo. Trate de no introducir burbujas en esta etapa y repita el proceso hasta que las retinas se rompan hasta un tamaño de aproximadamente dos a tres milímetros cuadrados.Lave el interior de la pipeta con aproximadamente dos mililitros de HCL y explíquela en el tubo de ensayo. Deje que el contenido se asiente en el fondo durante cinco a 10 minutos. Repita el proceso de trituración como se describió anteriormente con un poco más de fuerza hasta que las piezas de tejido tengan un tamaño aproximado de un milímetro cuadrado.Deje que el tejido se asiente y repita una vez más con aún más fuerza hasta que el contenido esté completamente homogeneizado y no queden trozos de retina. La solución en esta etapa debe tener un aspecto lechoso. Esta técnica producirá hasta ocho segmentos de arteriola por aislamiento, midiendo de 200 a 2.500 micrómetros de longitud.La canulación de un extremo de la arteriola con oclusión del extremo opuesto permite medir la vasoconstricción inducida por la presión, también conocida como respuesta miogénica. La miografía de presión arteriolar se realiza de la siguiente manera. Una alícuota de homogeneizado de retina se transfiere a una cámara de registro fisiológico montada en la platina de un microscopio invertido.Deje que el homogeneizado se asiente en el fondo de la cámara durante al menos cinco minutos. Escanee visualmente a través de la cámara de registro para identificar arteriolas de más de 200 micrómetros de longitud y que posean un extremo abierto a través del cual se pueda canular el vaso. Ancle en un extremo de la embarcación con pinzas finas y un pequeño deslizamiento de alambre de tungsteno colocado sobre la embarcación.Usando los extremos superpuestos del alambre de tungsteno, maniobre el recipiente para que corra horizontalmente a través del baño, de modo que el extremo abierto esté alineado con la cánula de presurización. Perfundir la cámara con cero calcio Hanks'a 37 grados centígrados. Las canulaciones se realizan con pipetas de vidrio.La cánula se coloca en el extremo abierto del recipiente mediante un micromanipulador fino. La punta se coloca inmediatamente adyacente a la abertura, como se evalúa ajustando el plano de enfoque en el microscopio, de modo que tanto el extremo del vaso como la punta de la cánula estén enfocados al mismo tiempo y la cánula de presurización avance hacia la abertura del vaso. Se requiere una pipeta auxiliar para ayudar con el proceso de canulación y se utiliza para sujetar suavemente la arteriola y guiar la pared arteriolar sobre la cánula de presurización al mismo tiempo que la cánula avanza hacia la luz del vaso.Este procedimiento requiere el movimiento simultáneo y controlado de ambos manipuladores y una amplia práctica para lograr una alta tasa de éxito. Después de un minuto de registrar a cero milímetros de mercurio, la presión intraluminal se incrementa a 40 milímetros de mercurio y el recipiente debe dilatarse rápidamente, confirmando el éxito de la canulación. La vasoconstricción inducida por la presión, es decir, la respuesta miogénica, se desarrollará posteriormente durante un período de aproximadamente 15 minutos.El registro de las células del músculo liso vascular de la retina permite investigar las corrientes iónicas de la membrana plasmática que regulan el calcio intracelular y, por lo tanto, la contractilidad celular. El registro de células completas y de un solo canal es posible a partir de células individuales de músculo liso aún incrustadas dentro de sus arteriolas principales de la siguiente manera. Las arteriolas de la retina se aíslan y se anclan en la cámara de registro con deslizamientos de alambre de tungsteno.La lámina basal necesita ser digerida para permitir que se forme un sello de alta resistencia entre la pipeta de parche y la membrana de células musculares lisas arteriolares. Las arteriolas se superfunden con una serie secuencial de soluciones enzimáticas a 37 grados centígrados, lo que también resulta en el desacoplamiento eléctrico de las células adyacentes, como lo indican las flechas en la imagen. El nivel de digestión se evalúa inicialmente en la separación visual de las capas endotelial y de músculo liso durante la etapa de colagenasa.La extirpación de las hebras restantes de la lámina basal y/o de la neuropila periférica se logra barriendo cuidadosamente las puntas cerradas de las pinzas finas a lo largo de la superficie del vaso. Para la sujeción del parche, la punta de la pipeta del parche se coloca verticalmente sobre la célula de interés y se baja gradualmente mediante el movimiento fino y lento del micromanipulador para hacer contacto con la membrana del músculo liso arteriolar. Esto se juzga por el movimiento de la célula y un cambio en la resistencia de la pipeta, medido mediante un protocolo de prueba de sellado de celdas en el software de adquisición.A medida que la pipeta se baja sobre la celda, la resistencia del sellado aumentará aproximadamente cinco veces. La presión negativa se aplica transitoriamente a la parte posterior de la pipeta y se forma gradualmente un gigaseal. Esto requiere aplicaciones repetidas de presión negativa en el transcurso de uno a cinco minutos.Para el registro de células completas, se utiliza predominantemente el método de fijación de parche perforado. Se forma un gigaseal, como se ha descrito anteriormente, con una pipeta que contiene una solución intracelular y anfotericina B. La resistencia de acceso se monitoriza mediante el protocolo de prueba de membrana en el software de adquisición. Una vez que la resistencia de acceso cae a menos de 15 megaohmios, se realiza una compensación de resistencia en serie.Por lo general, es posible compensar la resistencia en serie en aproximadamente un 75% en el modo de parche perforado. A continuación, se pueden utilizar pasos de voltaje o protocolos de rampa para medir las corrientes de toda la celda. Después de la disociación de la retina, las arteriolas primarias, secundarias y precapilares se pueden identificar en función de su calibre y la disposición de las células del músculo liso vascular.Las arteriolas de primer y segundo orden parecen visualmente similares bajo la microscopía de campo claro, pero se pueden distinguir sobre la base de su tamaño. Las arteriolas precapilares son los vasos arteriales más pequeños de la preparación y son fácilmente reconocibles debido a la disposición intermitente de las células del músculo liso vascular. Las arteriolas aisladas se pueden diferenciar claramente de los capilares y vénulas dentro del aislamiento.Los capilares son aparentes como una malla de vasos de pequeño calibre de aproximadamente cuatro a 10 micrómetros de diámetro, mientras que las vénulas son de paredes delgadas y carecen de cobertura de células musculares lisas. Las arteriolas primarias, secundarias y precapilares son adecuadas para la miografía a presión, las imágenes de calcio y los estudios de pinza de parche. Utilizando arteriolas presurizadas, hemos investigado los mecanismos moleculares implicados en la generación de la respuesta miogénica.Las fotomicrografías de esta imagen muestran una arteriola retiniana de rata en varios puntos de tiempo durante el curso de un experimento de miografía de presión. El siguiente gráfico de curso temporal muestra los cambios en el diámetro de los vasos durante el curso completo del experimento. Inmediatamente después de la presurización, el vaso se dilata, lo que es seguido por una constricción miogénica activa que alcanza un nivel de estado estacionario después de 15 minutos.La adición de wortmannina en una solución de Hanks sin calcio al final del experimento dilata el vaso a su diámetro pasivo con fines de normalización. Esta diapositiva muestra un ejemplo de una grabación de patch-clamp de un solo canal de una célula de músculo liso de la arteriola de la retina antes y después del estiramiento de la membrana. Este parche en la célula contiene dos canales TRPV2 activados por estiramiento, cuya actividad aumenta con la aplicación de presión negativa a la pipeta de parche.Los protocolos descritos aquí requieren práctica, pero deben poder lograrse con una solución de problemas mínima. Recomendamos utilizar las arteriolas aisladas el mismo día del aislamiento. El método está optimizado para las arteriolas retinianas de ratas, pero se puede utilizar en retinas de ratones.Ahora hemos utilizado esta preparación extensivamente, pero siempre que sea posible, también intentamos validar nuestros hallazgos clave utilizando montajes completos de retina ex vivo y mediciones in vivo del diámetro de los vasos sanguíneos y el flujo sanguíneo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Ex vivo ERG se puede utilizar para registrar la actividad eléctrica de las células de la retina directamente a partir de retinas intactas aisladas de animales o humanos. Demostramos aquí cómo los sistemas ERG in vivo comunes se pueden adaptar para registros ERG ex vivo con el fin de diseccionar la actividad eléctrica de las células de la retina.

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

Muchas enfermedades oculares visión-que amenaza se asocian a microvasos retiniana disfuncional. Por lo tanto, la medición de las respuestas de la arteriola retiniana es importante investigar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Este artículo describe un protocolo detallado para ratón arteriola retiniana aislamiento y preparación para evaluar los efectos de sustancias vasoactivas en el diámetro vascular.

Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

Demostrar técnicas de preparación de tres tejidos diferentes para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica aislamiento de la red vascular.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

El protocolo describe explantes organotípicos de ratón neuroretina,cultivados junto con su epitelio pigmentario retiniano (EPR), en medio definido R16, libre de suero y antibióticos. Este método es relativamente simple de realizar, menos costoso y lento en comparación con los experimentos in vivo, y se puede adaptar a numerosas aplicaciones experimentales.

A largo plazo, Cultivo Sin Suero De Explantes Organotípicos De La Retina De Ratón Con Epitelio Pigmento Retiniano Intacto

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Este protocolo describe un método para el aislamiento de células endoteliales retinianas postnatales murinas optimizadas para el rendimiento, la pureza y la viabilidad celular. Estas células son adecuadas para los enfoques de secuenciación de próxima generación.

Aislamiento de células endoteliales retinianas murinas para secuenciación de próxima generación

La preparación intensiva de "tubos" endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca2+] intracelular y el potencial de membrana.

Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Este manuscrito describe un protocolo simplificado para el aislamiento de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) de los ojos de ratón de una manera gradual. El protocolo incluye la enucleación y disección de los ojos del ratón, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de células del EPR.

Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón

Este protocolo presenta y describe los pasos para el aislamiento, disección, cultivo y tinción de explantes de retina obtenidos de un ratón adulto. Este método es beneficioso como modelo ex vivo para estudiar diferentes enfermedades neurovasculares de la retina como la retinopatía diabética.

Explante retiniano de la retina de ratón adulto como modelo ex vivo para el estudio de enfermedades neurovasculares retinianas

Se desarrolló un ensayo de protección para monitorizar la resistencia de la vasculatura de la retina a la muerte por lesiones relacionadas con la diabetes/retinopatía diabética, como el estrés oxidativo y las citocinas.

Un ensayo para detectar la protección de la vasculatura de la retina frente a la muerte relacionada con la diabetes en ratones

Aquí, proporcionamos una metodología detallada para aislar la retina del ojo del ratón para una experimentación ex vivo extendida. Este protocolo hace hincapié en hacer que este enfoque técnicamente exigente sea accesible para los investigadores que deseen aprovechar las vías de investigación que ofrece mantener la glía de la retina in situ en tejido vivo.

Un modelo de explante ex vivo para estudiar las interacciones gliales en la retina del ratón

Aprende a aislar arteriolas de la retina de rata para estudios de fisiología celular ex vivo. Este protocolo permite investigar la contractilidad del músculo liso vascular y la regulación del flujo sanguíneo retiniano en condiciones fisiológicas.

Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

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