Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

Este manuscrito describe un protocolo simple para el aislamiento de las arteriolas de la retina de rata que puede utilizarse en, calcio presión y proyección de imagen de miografía estudios electrofisiológicos.

Comprender cómo se controla el flujo sanguíneo en la retina es un objetivo importante, ya que el flujo sanguíneo anormal se ha implicado en el desarrollo de una variedad de enfermedades de la retina que amenazan la vista, como la retinopatía diabética, el glaucoma y las oclusiones de las venas ramificadas. Las arteriolas de la retina juegan un papel clave en la regulación del flujo sanguíneo en la retina al dilatar y constreñir su diámetro luminal, mediado por cambios en la contractilidad de las células musculares lisas que rodean estos vasos. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación de la perfusión retiniana requiere preparaciones en las que se pueda acceder a las células del músculo liso arteriolar de la retina y estudiarlas en condiciones lo más cercanas posible a las fisiológicas.

En este video, demostramos un protocolo sencillo para el aislamiento de arteriolas de la retina de rata que se puede usar en estudios de pinza de parche, imágenes de calcio y miografía de presión. En los últimos años, esta preparación se ha utilizado para proporcionar más información sobre la regulación de la contractilidad del músculo liso vascular y el flujo sanguíneo en la retina tanto en la salud como en la enfermedad. Prepare una solución de un litro de HCL de Hanks o LCH con bajo contenido de calcio, como se muestra en la tabla de materiales.

Ensamble el equipo de aislamiento antes de la recolección de tejido. La pipeta Pasteur de vidrio debe pulirse al fuego para alisar, pero no estrechar la punta. Recorte una pipeta de plástico a una apertura de aproximadamente cinco a siete milímetros.

Coloque los ojos en la placa de disección, sumergida en una solución de HCL. Use un juego de pinzas para anclar el ojo a la placa sosteniendo las inserciones del músculo orbital o el nervio óptico. Asegúrese de que el punto de anclaje esté lo más cerca posible de la esclerótica para estabilizar el ojo.

Con la cuchilla, corte la córnea a lo largo de la ora serrata y retire el cristalino presionando suavemente la esclerótica con pinzas. La pequeña región circular que vemos en la parte posterior del ojo en esta imagen es el nervio óptico. Con la cuchilla, corte el ocular por la mitad simétricamente a través del disco óptico.

Con pinzas cerradas, cepille suavemente las retinas de las dos mitades del ocular, teniendo cuidado de quitar los accesorios restantes en el disco óptico. Repita el proceso con el segundo ojo y transfiera las retinas disecadas al tubo de ensayo con la pipeta de plástico y una pequeña gota de medio de HCL. Con la pipeta de plástico, llene el tubo de ensayo con HCL hasta aproximadamente cinco mililitros y permita que las retinas se asienten en el fondo del tubo.

Lave el tejido aproximadamente tres veces extrayendo aproximadamente cuatro mililitros de solución del tubo y agregando HCL fresca con la pipeta de plástico. Cuando sea necesario, se debe extirpar el tejido extraño. Lave el interior de la pipeta Pasteur de vidrio con punta pulida con LCH para evitar que el tejido se pegue a la pipeta.

Con la misma pipeta, extraiga aproximadamente cuatro mililitros de solución del tubo de ensayo y agregue aproximadamente dos mililitros de HCL fresca. Disocie suavemente las retinas arrastrando el tejido a través de la punta de la pipeta de vidrio lentamente y expulse el contenido al tubo de ensayo. Trate de no introducir burbujas en esta etapa y repita el proceso hasta que las retinas se rompan hasta un tamaño de aproximadamente dos a tres milímetros cuadrados.

Lave el interior de la pipeta con aproximadamente dos mililitros de HCL y explíquela en el tubo de ensayo. Deje que el contenido se asiente en el fondo durante cinco a 10 minutos. Repita el proceso de trituración como se describió anteriormente con un poco más de fuerza hasta que las piezas de tejido tengan un tamaño aproximado de un milímetro cuadrado.

Deje que el tejido se asiente y repita una vez más con aún más fuerza hasta que el contenido esté completamente homogeneizado y no queden trozos de retina. La solución en esta etapa debe tener un aspecto lechoso. Esta técnica producirá hasta ocho segmentos de arteriola por aislamiento, midiendo de 200 a 2.500 micrómetros de longitud.

La canulación de un extremo de la arteriola con oclusión del extremo opuesto permite medir la vasoconstricción inducida por la presión, también conocida como respuesta miogénica. La miografía de presión arteriolar se realiza de la siguiente manera. Una alícuota de homogeneizado de retina se transfiere a una cámara de registro fisiológico montada en la platina de un microscopio invertido.

Deje que el homogeneizado se asiente en el fondo de la cámara durante al menos cinco minutos. Escanee visualmente a través de la cámara de registro para identificar arteriolas de más de 200 micrómetros de longitud y que posean un extremo abierto a través del cual se pueda canular el vaso. Ancle en un extremo de la embarcación con pinzas finas y un pequeño deslizamiento de alambre de tungsteno colocado sobre la embarcación.

Usando los extremos superpuestos del alambre de tungsteno, maniobre el recipiente para que corra horizontalmente a través del baño, de modo que el extremo abierto esté alineado con la cánula de presurización. Perfundir la cámara con cero calcio Hanks'a 37 grados centígrados. Las canulaciones se realizan con pipetas de vidrio.

La cánula se coloca en el extremo abierto del recipiente mediante un micromanipulador fino. La punta se coloca inmediatamente adyacente a la abertura, como se evalúa ajustando el plano de enfoque en el microscopio, de modo que tanto el extremo del vaso como la punta de la cánula estén enfocados al mismo tiempo y la cánula de presurización avance hacia la abertura del vaso. Se requiere una pipeta auxiliar para ayudar con el proceso de canulación y se utiliza para sujetar suavemente la arteriola y guiar la pared arteriolar sobre la cánula de presurización al mismo tiempo que la cánula avanza hacia la luz del vaso.

Este procedimiento requiere el movimiento simultáneo y controlado de ambos manipuladores y una amplia práctica para lograr una alta tasa de éxito. Después de un minuto de registrar a cero milímetros de mercurio, la presión intraluminal se incrementa a 40 milímetros de mercurio y el recipiente debe dilatarse rápidamente, confirmando el éxito de la canulación. La vasoconstricción inducida por la presión, es decir, la respuesta miogénica, se desarrollará posteriormente durante un período de aproximadamente 15 minutos.

El registro de las células del músculo liso vascular de la retina permite investigar las corrientes iónicas de la membrana plasmática que regulan el calcio intracelular y, por lo tanto, la contractilidad celular. El registro de células completas y de un solo canal es posible a partir de células individuales de músculo liso aún incrustadas dentro de sus arteriolas principales de la siguiente manera. Las arteriolas de la retina se aíslan y se anclan en la cámara de registro con deslizamientos de alambre de tungsteno.

La lámina basal necesita ser digerida para permitir que se forme un sello de alta resistencia entre la pipeta de parche y la membrana de células musculares lisas arteriolares. Las arteriolas se superfunden con una serie secuencial de soluciones enzimáticas a 37 grados centígrados, lo que también resulta en el desacoplamiento eléctrico de las células adyacentes, como lo indican las flechas en la imagen. El nivel de digestión se evalúa inicialmente en la separación visual de las capas endotelial y de músculo liso durante la etapa de colagenasa.

La extirpación de las hebras restantes de la lámina basal y/o de la neuropila periférica se logra barriendo cuidadosamente las puntas cerradas de las pinzas finas a lo largo de la superficie del vaso. Para la sujeción del parche, la punta de la pipeta del parche se coloca verticalmente sobre la célula de interés y se baja gradualmente mediante el movimiento fino y lento del micromanipulador para hacer contacto con la membrana del músculo liso arteriolar. Esto se juzga por el movimiento de la célula y un cambio en la resistencia de la pipeta, medido mediante un protocolo de prueba de sellado de celdas en el software de adquisición.

A medida que la pipeta se baja sobre la celda, la resistencia del sellado aumentará aproximadamente cinco veces. La presión negativa se aplica transitoriamente a la parte posterior de la pipeta y se forma gradualmente un gigaseal. Esto requiere aplicaciones repetidas de presión negativa en el transcurso de uno a cinco minutos.

Para el registro de células completas, se utiliza predominantemente el método de fijación de parche perforado. Se forma un gigaseal, como se ha descrito anteriormente, con una pipeta que contiene una solución intracelular y anfotericina B. La resistencia de acceso se monitoriza mediante el protocolo de prueba de membrana en el software de adquisición. Una vez que la resistencia de acceso cae a menos de 15 megaohmios, se realiza una compensación de resistencia en serie.

Por lo general, es posible compensar la resistencia en serie en aproximadamente un 75% en el modo de parche perforado. A continuación, se pueden utilizar pasos de voltaje o protocolos de rampa para medir las corrientes de toda la celda. Después de la disociación de la retina, las arteriolas primarias, secundarias y precapilares se pueden identificar en función de su calibre y la disposición de las células del músculo liso vascular.

Las arteriolas de primer y segundo orden parecen visualmente similares bajo la microscopía de campo claro, pero se pueden distinguir sobre la base de su tamaño. Las arteriolas precapilares son los vasos arteriales más pequeños de la preparación y son fácilmente reconocibles debido a la disposición intermitente de las células del músculo liso vascular. Las arteriolas aisladas se pueden diferenciar claramente de los capilares y vénulas dentro del aislamiento.

Los capilares son aparentes como una malla de vasos de pequeño calibre de aproximadamente cuatro a 10 micrómetros de diámetro, mientras que las vénulas son de paredes delgadas y carecen de cobertura de células musculares lisas. Las arteriolas primarias, secundarias y precapilares son adecuadas para la miografía a presión, las imágenes de calcio y los estudios de pinza de parche. Utilizando arteriolas presurizadas, hemos investigado los mecanismos moleculares implicados en la generación de la respuesta miogénica.

Las fotomicrografías de esta imagen muestran una arteriola retiniana de rata en varios puntos de tiempo durante el curso de un experimento de miografía de presión. El siguiente gráfico de curso temporal muestra los cambios en el diámetro de los vasos durante el curso completo del experimento. Inmediatamente después de la presurización, el vaso se dilata, lo que es seguido por una constricción miogénica activa que alcanza un nivel de estado estacionario después de 15 minutos.

La adición de wortmannina en una solución de Hanks sin calcio al final del experimento dilata el vaso a su diámetro pasivo con fines de normalización. Esta diapositiva muestra un ejemplo de una grabación de patch-clamp de un solo canal de una célula de músculo liso de la arteriola de la retina antes y después del estiramiento de la membrana. Este parche en la célula contiene dos canales TRPV2 activados por estiramiento, cuya actividad aumenta con la aplicación de presión negativa a la pipeta de parche.

Los protocolos descritos aquí requieren práctica, pero deben poder lograrse con una solución de problemas mínima. Recomendamos utilizar las arteriolas aisladas el mismo día del aislamiento. El método está optimizado para las arteriolas retinianas de ratas, pero se puede utilizar en retinas de ratones.

Ahora hemos utilizado esta preparación extensivamente, pero siempre que sea posible, también intentamos validar nuestros hallazgos clave utilizando montajes completos de retina ex vivo y mediciones in vivo del diámetro de los vasos sanguíneos y el flujo sanguíneo.