Name: Evaluación de la salud de peces basados en la necropsia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a evaluar la salud de peces silvestres mediante necropsia estandarizada. Este método permite documentar lesiones visibles, recolectar tejidos para histopatología y calcular índices de condición en ecosistemas acuáticos.

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Este trabajo fue financiado por los ecosistemas de el U.S. Geological Survey (entornos de la bahía de Chesapeake y pesca) y programas de salud ambiental (biología de contaminantes) y el Departamento de Virginia Occidental de recursos naturales. Uso de nombres comerciales es sólo con fines de identificación y no implica la aprobación por el gobierno de Estados Unidos.

Los métodos aquí descritos han sido aprobados por el centro de Ciencias de Leetown institucional Animal cuidado y Comité de uso.
1. colección de peces
<ol><li>Recoger peces vivos con un mínimo de estrés. Uso de barco o mochila electropesca, gancho y línea o redes.</li>
	<li>Retener a los peces en recipientes aireados o energizados pozos hasta la toma de muestras. Nota: La sociedad americana de pesquerías ha publicado una serie de guías para la colección de peces, manejo y anestesia/eutanasia26,27,28. Usar guantes al manipular el pescado.</li>
</ol>2. autopsia de pescado
<ol><li>
Eutanasia a un pez.
	<ol>
<li>Coloque el pescado en la anestesia hasta que deja de movimiento opercular y el pez pierde el equilibrio. Después de otros 2 a 10 minutos los peces serán sacrificados; sin embargo, esto también puede variar según las especies. Nota: El pescado se puede sacrificado con un número de anestésicos (véase Tabla de materiales para la más de uso general). El método de eutanasia dependerá de las mediciones de laboratorio que se llevará a cabo en los tejidos recogidos29.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medir las características biométricas.
	<ol>
<li>Pesar los peces al gramo más cercano.</li>
		<li>Mida la longitud del pescado al milímetro más cercano.<ol>
<li>Mida la longitud total desde la punta del hocico con la boca cerrada hasta el final de la cola cuando pellizcados juntos.</li>
			<li>Mida la longitud a la horquilla de la horquilla en la cola a la punta del hocico y la longitud estándar de la punta del hocico hasta el final del cuerpo (principio de la cola).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcular el factor de condición utilizando la siguiente fórmula: Factor de condición = (peso total - peso de la gónada) / total de longitud3. Nota: Peso de la gónada se resta del peso total del cuerpo ya que las gónadas pueden contribuir significativamente al peso total del cuerpo, particularmente en los peces hembra prespawn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Obtener una muestra de sangre. Nota: Sangre comúnmente se toma de la vena caudal pero puede también ser retirado de la aorta dorsal o por cardiaco perforar30.<ol>
<li>Extraer una muestra de sangre periférica de la vena caudal con una aguja 22 o 23 de G en una jeringa de 1 a 5 mL, dependiendo del tamaño de los peces. Inserte la aguja anterior el área caudal por debajo de la línea lateral (figura 1A y 1B). Ángulo hacia arriba hasta golpear la espina dorsal y luego retirar un poco. La vena es ventral a la columna vertebral suprayacente. Nota: Si se realizará frotis de sangre o suero es necesario, no se utiliza anticoagulante. En la mayoría de los casos se recogerán plasma y, por lo tanto, un anticoagulante como EDTA, litio o heparina sódica se utiliza para recubrir la aguja y la jeringa y es también en el tubo de la colección de la sangre (e.g., vacutainer).</li>
		<li>Retire la aguja y coloque en un contenedor para objetos punzantes antes de poner la sangre en el tubo de la colección. Nota: Sangre puede ser sostenida en el hielo pero según análisis posteriores debe centrifugarse tan pronto como posible30.</li>
		<li>Si serán evaluada anormalidades nucleares o recuento sanguíneo diferencial, inmediatamente Coloque una gota de sangre en portaobjetos de vidrio limpio duplicados. De nuevo un segundo portaobjetos en un ángulo de 45° en la gota, que se dibuja entonces a través de la superficie por acción capilar. Permita que se seque al aire31.</li>
		<li>Centrifugar la sangre a 1.500 – 2.500 x g durante 15 min a sedimento las células. Suero, plasma con una pipeta de transferencia estéril, alícuota en viales criogénicos, de quitar y almacenar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig1.jpg"> Figura 1 : Obtención de una muestra de sangre de un pez. (A) A recientemente sacrificado peces se pone a su lado y la línea lateral que se encuentra. (B) una aguja es insertada ventral a la línea (flecha), en ángulo hacia arriba hasta que la aguja toque la espina dorsal lateral. Luego se retira un poco, y succión iniciada para retirar sangre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="4"><li>
Cabo una evaluación de salud basados en la necropsia de cada pescado. Nota: Un número de publicaciones que ilustra y describe las lesiones y anomalías es disponibles32,33,34,35.<ol>
<li>Documento externas anormalidades incluyendo lesiones en la superficie del cuerpo y las aletas (figura 2), los ojos y las branquias (figura 3), parásitos externos como las sanguijuelas (Figura 2D), larvas o quistes metacercarial trematodo (Figura 2D, 3B) y gill parásitos (figura 3D). De documentos tipo, ubicación y tamaño de las anormalidades observadas en hojas de datos, así como fotografía, si es posible.</li>
		<li>Abrir la cavidad abdominal (Figura 4A) utilizando unas tijeras de corte de la zona anal para el opérculo y la aleta del músculo para exponer los órganos internos. Nota: Si el riñón anterior se recogerán para inmune función (vea el paso 5 más abajo) o muestras para bacteriología o la virología, la superficie corporal externa debe ser desinfectada con alcohol al 70% y las muestras deben obtenerse antes de la necropsia. Si sólo se utilizan los tejidos para la observación visual, análisis de plasma y técnica estéril la histopatología no es necesaria.</li>
		<li>Documento internas anormalidades (figura 4) incluyendo las descoloraciones focal o generales de los distintos órganos (Figura 4B-4D), presencia de levantado zonas (figura 4E), quistes, parásitos y tamaño (anormalidades agrandado, atrofiado).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig2.jpg"> Figura 2 : Ejemplos de lesiones visibles se observaron en la superficie del cuerpo y las aletas de los peces. (A) A pequeñas, ligeramente erosionada lesión (flecha) en la superficie lateral del cuerpo. (B) una enrojecida área grande (flecha) que implican la superficie caudal del cuerpo. (C) elevado, lesiones negras (flechas) en la superficie del cuerpo y las aletas. (D) las sanguijuelas (flecha blanca) y manchitas negras (flechas negras) en la aleta. Barra de escala = 3 mm. (E) una, lesión multilobed, pálida (flecha) en la superficie del cuerpo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig3.jpg"> Figura 3 : Ejemplos de las lesiones visibles de las branquias y ojos de pescado. (A) A área (flecha) dentro de la lente de un ojo de color pálido. Barra de escala = 5 mm. (B) blanco quistes (flechas blancas) y manchitas negras (flechas negras) causadas por parásitos trematodos en el opérculo que cubre las branquias (a). Barra de escala = 1 cm. (C) una pálida, erosionada zona (flecha) en la papada (a). Barra de escala = 5 mm. (D) una papada que se ha eliminado con parásitos (flechas) se une a los filamentos branquiales. Barra de escala = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig4.jpg"> Figura 4: Ejemplos de una necropsia y anormalidades internas del pescado. (A) durante una autopsia el pescado es abrir (a lo largo de la flecha blanca) y un colgajo de músculo (flecha negra) removido para exponer a la gónada (a) y del bazo, siendo sostenido por pinzas y tijeras. (B) moteado hígado (a), testículos (b), intestino rodeado de grasa grasa (c) y estómago (d). Barra de escala = 5 mm. (C) hígado (a) con un área rojo oscuro (flecha), ovario (b) e intestinos (c). Barra de escala = 5 mm. (D) hígado con zonas decoloradas verdosas (flechas). Barra de escala = 1 cm. (E) ejemplo de (a) normal y anormales (b) los testículos con levantaron nódulos. Barra de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="5"><li>
Obtener el índice hepatosomático (HSI).
	<ol>
<li>Retirar el hígado por cortar la arteria hepática y del tejido conectivo del final anterior. Suavemente Levante mientras cortar adherencias y otras conexiones a intestino y grasa adiposa. Tenga cuidado de no pinchar la vesícula biliar. Peso del hígado. Nota: Algunos peces, como carpas, no tienen un hígado discreto pero algo hepático tejido envuelto alrededor de los intestinos y otros órganos. De estas especies, no puede ser posible obtener pesos de hígado.</li>
		<li>Calcular el índice hepatosomático (HSI) mediante la fórmula: HSI = peso total peso hígado</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calcular el índice gonadosomático.
	<ol>
<li>Retirar las gónadas y pésalo.</li>
		<li>Calcular el índice gonadosomático (GSI) utilizando la fórmula: GSI = peso total peso de la gónada</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. conservar los tejidos para la patología microscópica
Nota: Puede utilizarse un número de fijadores como formalina tamponada neutra 10% y Z-fix, un fijador basados en formalina con zinc, para la preservación del tejido en el campo. Este último es preferible si se pueden utilizar métodos como la hibridación en situ o tinción de anticuerpos fluorescentes.
<ol><li>Cuidadosamente corte pero no extraer muestras de tejido. Mantener piezas de tejido individual &lt; 2 cm de tamaño y &lt; 5 mm de espesor para la fijación adecuada. Como regla general, use aproximadamente 10 x fijador más por volumen que el tejido para la adecuada preservación. Colocar todas las muestras de tejido de un pez en el mismo contenedor de prueba de fugas del tamaño adecuado, dependiendo del tamaño de los peces que se muestrearon.</li>
	<li>Colocar cualquier anormalidad externa en el recipiente de fijador. Además, incluye una pieza adyacente de tejido normal. Nota: Inadecuado manejo tales como compresión u otros daños mecánicos, exposición prolongada a aire o luz del sol y congelación pueden causar artefactos.</li>
	<li>Corte al menos cinco trozos gruesos de 3 a 4 mm del hígado de varias regiones y coloque en el recipiente de fijador. Incluyen las áreas normales y anormales, si.</li>
	<li>Dependiendo del tamaño, coloque una gónada entera o varias piezas a lo largo de una gónada en el contenedor de fijador.</li>
	<li>Lugar de órganos enteros, si pequeño, o piezas de todos los demás órganos (bazo, riñón anterior y posterior, branquias, corazón, intestino y estómago) en el contenedor de fijador. Si se observa tejido anormal, preservar una pieza adyacente de tejido normal también.</li>
</ol>4. Retire los otolitos de edad análisis
Nota: La edad puede ser una variable importante en los estudios de salud enfermedad y peces pescados. Mientras que un número de estructuras, incluyendo escamas y espinas, se ha utilizado para la determinación de la edad, mayoría de los estudios que comparan las estructuras ha encontrado los otolitos para dar los mejores resultados36,37. Peces teleósteos tienen tres pares de otolitos - lapillus, sagitta y asteriscus. Generalmente, los otolitos sagitales o lapillus son recogidos por envejecimiento aunque eso puede variar según las especies. Técnicas de eliminación y el envejecimiento han sido descrita38.
<ol><li>Corte a través del Istmo de gill y doblar la cabeza hacia atrás. Tira lejos tejidos conjuntivo y muscular alrededor de las porciones inferiores del neurocranium para localizar prootic ampollas, un área ósea elevada.</li>
	<li>Marcar o cortar con cortadores de hueso y crack para exponer los otolitos. Pueden verse con el ojo desnudo.</li>
	<li>Lugar de otolitos en un frasco rotulado o una moneda sobre y almacenar a temperatura ambiente hasta su análisis por edad contando los anillos o incrementos de38. Si colocar en un frasco, abrir la tapa una vez regresó al laboratorio y dejar completamente seco antes de almacenar.</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig5.jpg"> Figura 5 : Extracción de otolitos. (A) se corta el Istmo y el tejido conectivo y músculo tiran lejos para exponer la base de la espina dorsal y neurospinal. (B) el hueso está roto para exponer los otolitos. Otolitos Lapillar (C) se eliminan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
5. obtener tejido para el análisis de la función inmune
Nota: El riñón anterior es el principal órgano hematopoyético, la fuente de los linfocitos y macrófagos para ensayos funcionales y debe retirar asépticamente si las células se cultivan para ensayos funcionales, tales como mitogénesis, fagocítica y la capacidad de matanza de los macrófagos39,40.
<ol><li>Rocíe la superficie externa del pez con etanol al 70%. Utilizar tijeras estériles, bisturí y pinzas para abrir la cavidad abdominal y extirpar el tejido del riñón anterior, que es un órgano rojo oscuro situado anterior a la vejiga natatoria.</li>
	<li>Coloque la muestra de riñón anterior en los medios de comunicación (por ejemplo, Leibovitz L-15) para mantener las células vivas. Homogeneizar las muestras de riñón con un triturador de tejidos mano estéril (p. ej., amoladora del tejido de Tenbroeck) en suspensiones celulares individuales. Mantenga en hielo húmedo hasta que volvió al laboratorio.</li>
</ol>6. preservar el tejido para análisis de ácidos nucleicos
Nota: Si aguas abajo análisis molecular se llevará a cabo, como la expresión del gen mediante transcripción abundancia41 o PCR cuantitativa42 (reacción en cadena de polimerasa), colocar las piezas de tejido para ser evaluados en un conservante adecuado ( por ejemplo,, solución de estabilización RNAlater) tan pronto como sea posible.
<ol><li>Para la preservación de la RNA, colocar dos o tres pequeñas (2 – 3 mm) en el preservativo adecuado en una relación 10:1 de preservativo volumen al tejido. Nota: Las muestras deben ser protegidas de la luz solar o calor excesivo y transportar en hielo húmedo.</li>
	<li>Para la preservación de ADN, coloque dos o tres pequeñas porciones de tejido en etanol al 95% (etanol del 10:1 al tejido por volumen). Continuación, mantenga las muestras en hielo húmedo y luego almacenar a-20 ° C.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La autopsia-evaluación de la salud de los peces puede ser utilizada en cualquier especie de pescado para que el investigador tiene una comprensión de la apariencia normal de las estructuras externas e internas. Utilizando un enfoque estandarizado permite comparaciones entre sitios y especies así como cambios estacionales y temporales en una población. Los resultados se pueden utilizar para identificar efectos asociados con punto y nonpoint fuentes de contaminantes e informar sobre acciones de manejo. También puede utilizarse para realizar un seguimiento de mejoras una vez que se inician acciones de manejo. La metodología puede modificarse para aumentar la documentación de alteraciones visuales externos de una variedad de maneras. Evaluaciones, basadas solamente en observaciones visuales, pueden ser relativamente barato, inocuo y datos se pueden generar rápidamente un gran número de individuos. Por lo tanto, pueden ser útiles para la evaluación inicial o exploratoria, para monitorear el cambio en el tiempo o en combinación con otros indicadores. Si la longitud y el peso de los peces se miden durante observaciones visuales, también se puede calcular el factor de condición. Aunque las evaluaciones basan únicamente en la observación visual no proporcionan información sobre la causa o factores de riesgo asociados, las tendencias a largo plazo de ciertas anormalidades de piel45 y parámetros biométricos46 han indicado mejoras en algunas áreas asociado a mejoras de calidad de agua.
La evaluación de la autopsia proporciona más información también se examinan los órganos internos y se pueden calcular otros factores condición como índice hepatosomático e índice gonadosomático. Goede y Barton22 desarrollaron un método de necropsia de campo que incluyó los parámetros de la sangre, factores biométricos, el porcentaje de anormalidades y los valores del índice para las anormalidades específicas. Un refinamiento del método incluye una clasificación de gravedad para algunas variables que permitieron para el cálculo de un índice de evaluación de salud que podría ser estadísticamente en comparación con23. Este índice de evaluación de salud se ha utilizado en el sitio regional comparaciones23,47,48 y en combinación con otros indicadores biológicos incluyendo plasma y análisis histopatológicos en el geológico de los Estados Unidos De control biológico de la situación ambiental y programa de tendencias, evaluación de efectos potenciales de la exposición de contaminantes en ríos grandes a nivel nacional49,50,51. Un índice de enfermedades de peces basado en visibles enfermedades y parásitos, neoplasias hepáticas visibles y otros histopathologically detectaron las lesiones del hígado ha sido desarrollado y utilizado ampliamente en el mar del norte, mar Báltico y fuera de Islandia. Este índice fue encontrado para ser una herramienta importante como un ecosistema salud indicador52.
Hay algunos factores críticos en la realización de la evaluación de necropsia en peces. En primer lugar, las evaluaciones se realizarán en el pescado inmediatamente después de la muerte. Cambios en consistencia y color del órgano pueden ocurrir bastante rápidamente después de la muerte. Además, algunos parásitos pueden dejar el host pronto después de la muerte. En segundo lugar, es importante saber lo que es normal para la especie de interés. Por ejemplo, algunos peces normalmente grasosos y pálido, hígado, mientras que para la mayoría de las especies un hígado pálido sería anormal. También es importante reconocer los cambios estacionales que ocurren naturalmente. Algunos peces tienen cambios de color o desarrollan tubérculos de cría durante la temporada de desove.
Las limitaciones de la evaluación basada en la autopsia como método de evaluación de la salud de peces incluyen la incapacidad para identificar 1) consistentemente la "causa" de lesiones específicas y 2) identificar los efectos que pueden no ser visibles a simple vista. Estos inconvenientes pueden ser superados con la adición de la histopatología, molecular o cultural identificación de patógenos y parásitos y expresión génica. Por ejemplo, un "tumor" o lesión levantada (hinchazón) puede ser neoplasia actual o puede ser un parásito, inflamación, edema o hiperplasia (aumento del número de células normales), causada por la exposición a sustancias químicas, agentes infecciosos u otros irritantes. Como se muestra en los resultados representativos, definitivo tumor o neoplasia diagnóstico requiere patología microscópica para identificar el tipo de lesión y la gravedad (es decir, benignos o malignos). Evaluación del matalote blanco externo "tumores" por observación visual sobrestiman la prevalencia, particularmente en el sitio de referencia. Muchas de las lesiones elevadas no fueron neoplasias sino lesiones hiperplásicas algo. Actualmente no se sabe si estas lesiones hiperplásicas son pre-neoplásicas. Por el contrario, la observación de nódulos elevados en el hígado subestimó significativamente la prevalencia de neoplasias de hígado. Por lo tanto, era necesario para abordar adecuadamente el potencial de supresión colección de tejido para patología microscópica.

Las actividades humanas tienen numerosos efectos adversos en ambientes acuáticos. Peces habitan en diversos cuerpos de agua que la población humana recrea en y utiliza a menudo como una fuente de agua potable y por lo tanto, son indicadores importantes de la salud del medio acuático. Peces que viven y se reproducen en un hábitat particular están expuestos a lo largo de sus vidas a diversos estresores incluyendo patógenos, parásitos, mala calidad del agua y contaminantes químicos. Miles de productos químicos entran las aguas a través de aguas residuales industriales y humanas, suburbano y urbano aguas lluvias y escorrentía agrícola. Estas mezclas complejas de sustancias químicas pueden tener aditivos, sinérgicos o efectos antagónicos sobre exponen organismos1,2,3. Además, otros factores de estrés ambientales tales como elevan nutrientes, temperatura elevada, bajo nivel de oxígeno disuelto o pH fluctuante puede exacerbar los efectos de los contaminantes químicos4,5. Estresores ambientales también pueden influir en los resultados de enfermedades infecciosas directamente por aumentar el número de agentes infecciosos6, aumento de la virulencia de patógenos oportunistas7 o suprimir la respuesta inmune y la enfermedad resistencia del anfitrión8,9,10. Por estas razones, existe un creciente interés en los efectos adversos o biológicos monitoreo11,12,13,14, utilizando peces y otros organismos acuáticos para identificar las poblaciones y los ecosistemas en riesgo.
Efectos adversos vigilancia utiliza biomarcadores a distintos niveles de organización, desde el organismo al subcelular o molecular, para identificar los efectos subletales que pueden influir en las poblaciones y ser indicativos de la exposición a diversos estresores. Indicadores a nivel de organismo incluyen condiciones y anomalías visibles. Índices de condición basados en longitud y peso se calculan para evaluar el bienestar o aptitud de las poblaciones de peces. El más común es factores de condición de Fulton (K) = (peso/talla3) 15. Otro indicador es la presencia de anormalidades visibles. Han utilizado una variedad de métodos en los estudios individuales y programas de monitoreo para evaluar, documento y evaluar anormalidades visibles. Evaluación basada en anormalidades externas, es decir, la proporción de individuos con la enfermedad, daños de la aleta, tumores y anomalías esqueléticas, es uno de los indicadores para el índice de integridad biótica (IBI) que evalúa la comunidad salud16. Una evaluación similar denominada DELTs (deformidades, lesiones, lesiones, tumores) también se ha utilizado para evaluar la salud de las comunidades de peces17. Sin embargo, estos métodos sólo evaluaron anormalidades visuales externas y no internas lesiones o primeros indicadores subletales.
Evaluaciones basadas en la necropsia incluyen observaciones externas e internas y permitan la medición de los índices de condición adicional. Índice hepatosomático (peso total peso hígado) también se ha utilizado como un indicador de aptitud o energía reserva15 para que un mayor valor del índice indica peces más sanos. Sin embargo, varios estudios han demostrado que la hipertrofia o aumento del tamaño del hígado se produce debido a la exposición a diversos contaminantes metabolizado por el hígado18,19,20. En este caso un índice más alto sería indicativo de exposición a ciertas clases de químicos. El índice gonadosomático (gónada peso total del peso corporal) es otro índice de estado dirigida hacia la salud reproductiva21. Observaciones realizadas durante la evaluación de la autopsia pueden utilizarse para comparar la prevalencia de los tipos de lesión individual o porcentaje de individuos normales. Sin embargo, también puede ser utilizados en una salud más cuantitativa evaluación22,23.
La evaluación estandarizada basada en necropsia descrita aquí se puede utilizar para aumentar la evaluación grueso visible de múltiples formas dependiendo de las preguntas a ser respondidas, conocimientos y otros recursos disponibles. Nuestro enfoque habitual es recoger datos biométricos (longitud, peso, peso del hígado, peso de la gónada), para análisis, suero, plasma, documentos internos y externos visibles anomalías, preservar pedazos de órganos para análisis microscópicos y recogen otolitos para la sangre Análisis de la edad. La evaluación basada en la necropsia más análisis de edad y la histopatología de diversos órganos, permite el cálculo y comparación de distintos índices de condición, la prevalencia de anormalidades visibles, así como cambios microscópicos del tejido, por sexo, edad, sitio y periodo de muestreo. Colecciones de tejido adicional se pueden hacer para muchos otros análisis como la microscopía, bacteriología, virología, Parasitología y concentraciones químicas. Estos métodos también pueden ser parte del más profundo análisis para diagnosticar la causa de pescado mata24 o mortalidades de cautivas peces25. Se ilustran los métodos para la colección de tejidos para análisis inmunes funcionales, expresión génica y dos análisis adicionales.

<table><tbody><tr><td>Mesas plegables</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>silla plegable</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tabla de disección</td><td>Cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabla de medición (mm)</td><td>Cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Báscula a pilas (g) para el peso de los peces</td><td>Cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Báscula a pilas (mg) para pesos de órganos</td><td>Cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de disección</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cortador de hueso</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bisturí y cuchillas</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guantes desechables</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cubo</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco Nalgene a prueba de fugas (250 ml)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>02-924-5C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Vacutainer con heparina sódica</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>02-689-6</td><td>Para la extracción de sangre</td></tr><tr><td>Jeringas desechables de 3 ml con aguja de 23 g</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-826-11</td><td></td></tr><tr><td>crioviales de 1 y 2 ml</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se utiliza para muestras de plasma y ARNlater</td></tr><tr><td>Invitrogen Solución de estabilización de ARNlater</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Z-Fix Formaldehído Fijador de zinc</td><td>Anatech LTD</td><td>SKU-174</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS-222)</td><td>Syndel USA</td><td></td><td>anestésico para peces</td></tr><tr><td>Sobres de monedas</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>para otolitos</td></tr><tr><td>Lápices y bolígrafos</td><td>Cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% de alcohol</td><td>Cualquiera Hojas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de datos</td><td>Cualquiera</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la salud de peces basados en la necropsia

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

Influencias antropogénicas de aumento de nutrientes y contaminantes químicos, a alteraciones del hábitat y el cambio climático pueden tener efectos significativos en las poblaciones de peces. Efectos adversos vigilancia, utilizando biomarcadores desde el organismo a nivel molecular, pueden utilizarse para evaluar los efectos acumulativos sobre peces y otros organismos. Salud de los peces se ha utilizado en todo el mundo como un indicador de la salud del ecosistema acuático. La evaluación de la salud de peces basados en la autopsia proporciona datos visibles índices anormalidades y lesiones, parásitos, condición y organosomatic. Estos se pueden comparar por sitio, temporada y sexo, así como temporal, a cambio de documento en el tiempo. Clasificaciones de gravedad pueden asignarse a varias observaciones para calcular un índice de salud de peces para evaluación cuantitativa más. Un inconveniente de la evaluación de la autopsia es que se basa en observaciones visuales y factores de condición, que no son tan sensibles como tejido y subcelular de efectos subletales. Además, es raramente posible identificar causas o factores de riesgo asociados con las anormalidades observadas. Así, por ejemplo una lesión levantada o "tumor" en aletas, labios o superficie del cuerpo puede ser una neoplasia. Sin embargo, también podría ser una respuesta a un parásito, la inflamación crónica o la hiperplasia de las células normales en respuesta a un irritante. Por el contrario, ciertos parásitos, otros agentes infecciosos, neoplasias y muchos cambios de tejido no son accesibles y así pueden ser subestimados. Sin embargo, durante la evaluación de la autopsia, sangre (plasma), tejidos para histopatología (patología microscópica), genómica y otros análisis moleculares y otolitos de envejecimiento pueden recogerse. Estos análisis descendentes, junto con los análisis geoespaciales, evaluaciones de hábitat, análisis de calidad y contaminantes de agua todo puede importantes en la evaluación integral del ecosistema.

Áreas de Great Lakes de preocupación (AOC) son las zonas geográficas que fueron señaladas debido a deficiencias de diversos usos beneficiosos. Una de las debilitaciones del uso benéfico (BUIs) en AOC muchos es los tumores de peces u otras deformidades. Millones de dólares se han gastado para rehabilitación y restauración de cada una de estas áreas para venta BUIs diversos y en definitiva el AOC43. Los criterios para la supresión del tumor de pescado que Bui difiere de estado a estado (véase epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf y dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); sin embargo, como se señala en los documentos de exclusión, es un requisito para determinar la prevalencia de tumores en el hígado y en algunos casos tumores de la piel. En muchos casos, la prevalencia es comparada con un sitio de referencia no AOC.
El tumor de pescado BUI fue evaluado en tres AOCs (San Luis Río, Río de Milwaukee y Sheboygan) y un sitio de referencia no AOC (río de Puno) en lagos Superior y Michigan, utilizando una evaluación basada en la autopsia del matalote blanco (Catostomus commersonii ), seguido por patología microscópica de la piel y el tejido del hígado. Peces fueron recogidas del río Milwaukee, Sheboygan y Puno en 2012 y 201344 y del río St. Louis en el año 2015 (datos no publicados). Se evaluaron doscientos ventosas blanco de Milwaukee, Kewaunee, St. Louis y 193 de Sheboygan.
Por definición, un tumor puede ser cualquier área de inflamación o levantado, aunque se considera generalmente que una hinchazón causada por un crecimiento anormal de tejido con células anormales es una neoplasia benigna o maligna. Matalote blanco de todos los sitios exhibe una variedad de lesiones elevadas externas como pequeñas manchas blancas discretas, grandes áreas blancas, ligeramente elevadas lesiones mucoides multilobed áreas elevadas en la superficie del cuerpo y los labios (figura 6). Pescado se pesaron y midieron para obtener un factor de condición, se documentaron anormalidades internas y externas, y tejido de la piel y del hígado fueron recogido para la histopatología.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig6.jpg"> Figura 6 : Lesiones de piel elevada observaron en matalote blanco de los grandes lagos. (A) un discreto punto blanco en la superficie del cuerpo. Barra de escala = 5 mm. (B) A ligeramente levantadas mucoide (flechas) y multilobed lesiones (a) en la superficie posterior del cuerpo. Barra de escala = 1 cm. (C) A grandes multilobed lesión, en la superficie del cuerpo. Barra de escala = 1 cm. (D) numerosas lesiones múltiples lóbulos en los labios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El porcentaje de peces con tumores externos o levantado descolorida áreas osciló entre 15.5% en la AOC de St. Louis y 58.0% en la AOC de Milwaukee. En general, las manchas blancas discretas fueron la lesión visual menos común mientras que el labio multilobed y lesiones superficiales del cuerpo eran más comunes. El número de peces con los nódulos del hígado observables era bajo, que van desde 1.5% a Puno y St. Louis a 2.5% en Milwaukee (tabla 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="4">Ríos y año muestreado</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lesiones visibles</td>
			<td>Puno 2013</td>
			<td>St. Louis 2015</td>
			<td>Sheboygan 2012</td>
			<td>Milwaukee 2013</td>
		</tr>
<tr>
<td>Discretas manchas blancas</td>
			<td>16</td>
			<td>3</td>
			<td>3.1</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mucoide</td>
			<td>20</td>
			<td>9.5</td>
			<td>9.8</td>
			<td>30.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multilobed</td>
			<td>22.5</td>
			<td>3</td>
			<td>29.5</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total levantado piel anormalidadesuna
</td>
			<td>46</td>
			<td>15.5</td>
			<td>38.3</td>
			<td>58</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nódulos del hígado visibles</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.6</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
un Número total de peces con lesiones levantadas. Algunos peces tenían varios tipos de anormalidades.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Observaciones de la autopsia del matalote blanco recogieron en Great Lakes de preocupación y un sitio de referencia (río de Puno), presentado como un porcentaje. Examen visual se puede utilizar para documentar el porcentaje de pescado con diversas anomalías. Sin embargo, para diagnosticar definitivamente la presencia y el tipo de neoplasia, los tejidos se deben examinar microscópicamente (histopatología). En el examen microscópico, se encontró que no todas las lesiones levantadas fueron neoplásicas. Muchos de los puntos blancos discretos y las lesiones mucoides, particularmente en Puno, fueron lesiones hiperplásicas en lugar de neoplasia (tabla 2). Además, en Puno y St. Louis, todos los tumores de la piel observados eran papilomas benignos. A Sheboygan y Milwaukee papilomas y carcinomas de células escamosas, tumores de piel malignos, se observó (tabla 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="4">Ríos muestreados</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de neoplasia</td>
			<td>Puno 2013</td>
			<td>St. Louis 2015</td>
			<td>Sheboygan 2012</td>
			<td>Milwaukee 2013</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papiloma</td>
			<td>21</td>
			<td>5.2</td>
			<td>30.5</td>
			<td>37.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Carcinoma de células escamosas</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2.1</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neoplasias de piel total</td>
			<td>21</td>
			<td>5.2</td>
			<td>32.6</td>
			<td>48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Conducto biliar neoplasiasun
</td>
			<td>2.5</td>
			<td>4</td>
			<td>6.2</td>
			<td>9.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Célula hepática neoplasiasb
</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>2.1</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neoplasias de hígado total</td>
			<td>3.5</td>
			<td>4</td>
			<td>8.3</td>
			<td>15.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
un Incluye cholangioma y colangiocarcinoma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
b Incluye adenoma de la célula hepática y el carcinoma de la célula hepática</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
c Algunos peces tenían el conducto biliar y neoplasias hepáticas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Microscópico verificado lesiones neoplásicas del matalote blanco recogido en Great Lakes de preocupación y un sitio de referencia (río de Puno), presentado como un porcentaje. El análisis histopatológico también identificaron tumores hepáticos que no fueron identificados mediante la observación visual. Mientras que sólo el 1,5% de los peces recogidos de Puno y St. Louis tenía nódulos visibles del hígado (tabla 1), 3.5% y 4.0%, respectivamente, habían microscópico identificado neoplasias (tabla 2). Una diferencia más grande se observó en Sheboygan (1,6% versus 8,3% microscópico visible) y Milwaukee (2,5% visible frente al 15,0% microscópica). Examen microscópico también provee una diferenciación de los tumores de vía biliar versus el origen de la célula hepática (tabla 2) y benignos y tumores malignos.

La salud de los peces silvestres puede utilizarse como un indicador de la salud del ecosistema acuático. Evaluaciones de salud de peces basados en la necropsia proporcionan documentación de las lesiones visibles o anormalidades, datos utilizados para calcular índices de condición como la oportunidad de recoger los tejidos para la evaluación microscópica, expresión génica y otros más a fondo Análisis.

Evaluación de la salud de peces basados en la necropsia

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on ...

La evaluación de la salud de los peces basada en la necropsia se utiliza para evaluar la salud de los peces silvestres para el monitoreo de rutina, estudios específicos que comparan sitios y como base para la recolección de tejidos para un análisis más profundo. Los peces están constantemente expuestos a una combinación de factores estresantes, como mezclas complejas de productos químicos, patógenos y parásitos. Estas combinaciones de factores estresantes pueden provocar efectos adversos como la reducción de la resistencia a las enfermedades, el cáncer y el fracaso reproductivo.Las técnicas demostradas permiten una evaluación estandarizada de las anomalías visibles y la recolección de sangre y tejidos para la histopatología, otolitos para la edad y tejidos para otros análisis posteriores. En primer lugar, demostraremos la evaluación rutinaria basada en la necropsia con extracción de sangre, otolito y tejido para la histopatología utilizando un solo pez. La recolección de riñón anterior para ensayos de función inmune y de hígado u otro tejido para la expresión génica son adiciones a este método que también demostraremos.Es importante recolectar los tejidos lo más rápido posible para evitar cualquier cambio post mortem. Por lo tanto, generalmente tenemos un proceso de línea de ensamblaje con dos o tres personas recolectando pañuelos y alguien registrando los datos. Heather Walsh y Cheyenne Smith, estudiantes de doctorado de la Universidad de West Virginia, y Ryan Braham, recién graduado de doctorado, demostrarán los diversos pasos del proceso.Después de recolectar y sacrificar peces de acuerdo con las pautas institucionales, pesar y medir los peces y obtener una muestra de sangre. A continuación, mida la longitud total del pez desde la punta del hocico hasta el final de la cola. Insertar una jeringa de tres CC con aguja de calibre 22 o 23, previamente recubierta de heparina, anterior a la zona caudal por debajo de la línea lateral.Incline la necesidad hacia arriba hasta que llegue a la columna vertebral y retírela ligeramente para obtener una muestra de sangre. Antes de transferir la muestra de sangre a un tubo de recolección, retire la aguja y colóquela en un contenedor de objetos punzantes. Para las excursiones de un día, la sangre se puede mantener en hielo húmedo hasta que regrese al laboratorio.Luego se centrifuga para eliminar el plasma que se almacenó a menos 80 grados centígrados hasta que se analizó. Si no regresa al laboratorio todos los días, es necesario una centrífuga y almacenamiento de hielo seco. A continuación, documente cualquier anomalía o lesión externa en el cuerpo, las aletas, los ojos y las branquias del pez.Inspeccione los peces en busca de parásitos externos como sanguijuelas, larvas, quistes metaacercariales de trematodos y parásitos branquiales. A continuación, utiliza unas tijeras para abrir la cavidad abdominal desde la zona anal hasta el opérculo. Retire el colgajo de músculo para exponer los órganos internos.Examine los órganos internos y documente las decoloraciones generales y focales, la presencia de áreas elevadas, quistes, parásitos y anomalías de tamaño. A continuación, para extirpar el hígado, corte la arteria hepática y el tejido conectivo del extremo anterior. Levante suavemente el hígado de la carcasa y recorte las adherencias y conexiones con los intestinos y la grasa adiposa, teniendo cuidado de no perforar la vesícula biliar.Pesa el hígado. A continuación, obtenga el índice hepatosomático como se describe en el protocolo de texto. A continuación, retira las gónadas y pésalas.Con cuidado, sin tirar, corte pequeñas muestras de tejido. Coloque las muestras de tejido de un pez en el mismo recipiente. A continuación, corte al menos cinco trozos de tres a cuatro milímetros de grosor de varias regiones del hígado y colóquelos en el recipiente fijador.Dependiendo del tamaño, coloque una gónada entera o trozos de una gónada en el recipiente fijador. A continuación, coloque los órganos enteros más pequeños y trozos de otros órganos más grandes en el recipiente fijador. Si se observan tejidos anormales, conserve una pieza adyacente adicional de tejido normal.Numerosas estructuras, como escamas, radios y otolitos, se pueden utilizar para envejecer los peces. Aquí estamos usando otolitos ya que son los más precisos. Primero, corta a través del istmo branquial e inclina la cabeza hacia atrás.Luego, para localizar la bulla proótica, se desprenden los tejidos conectivos y musculares alrededor de las porciones inferiores del neurocráneo. Use un cortador de huesos para romper la bulla proótica y exponer los otolitos. Los otolitos deben ser visibles a simple vista.Coloque los otolitos en un frasco etiquetado y sin tapar y guárdelos a temperatura ambiente hasta que se pueda realizar el análisis de edad. La exposición a numerosos productos químicos y otros factores estresantes ambientales puede causar inmunosupresión. A partir de este tejido se pueden aislar linfocitos, macrófagos y granulocitos y en el laboratorio se puede medir su capacidad para matar patógenos, producir anticuerpos, responder a las células tumorales y otras funciones.Con tijeras estériles, bisturí y fórceps se extrae el tejido renal anterior. Coloque la muestra de riñón anterior en el medio adecuado para mantener vivas las células. Utilice un triturador de pañuelos de mano estéril para homogeneizar la muestra en suspensiones unicelulares.Y sostenga las muestras sobre hielo húmedo. Para la conservación del ARN, coloque dos o tres trozos pequeños de hígado en el conservante adecuado en una proporción de 10 a uno de conservante con respecto al tejido. En este estudio, se recolectaron chupones blancos de tres áreas de preocupación de los Grandes Lagos, o AOC, y el sitio de referencia del río Kewanee.El porcentaje de peces con tumores externos osciló entre el 15,5% en el AOC de St. Louis y el 58% en el AOC de Milwaukee. Se observaron varios tipos de lesiones externas, incluyendo manchas blancas discretas, lesiones mucoides ligeramente elevadas y lesiones papilomatosas grandes. Muchas de las manchas blancas discretas y lesiones mucoides observadas en este estudio, particularmente en el sitio de referencia de Kewanee, eran lesiones hiperplásicas en lugar de neoplasias.El análisis histopatológico también identificó tumores hepáticos que no se identificaron con la observación visual. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 15 a 20 minutos por pez si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante saber qué es normal para su especie en particular y ser lo más consistente y preciso posible al describir las anomalías.Incluye el tamaño, el color, la textura y la ubicación. La documentación fotográfica es útil. Esta técnica se puede utilizar para cualquier especie de pez y es útil para documentar la salud de los peces tanto espacial como temporalmente para comprender mejor los efectos adversos de los factores de estrés ambiental e identificar enfermedades invasivas.

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