Generación y demanda inicio de la actividad Ictal aguda en roedores y tejido humano
19 de enero de 2019
Modelos de convulsión aguda son importantes para el estudio de los mecanismos subyacentes a los eventos epileptiformes. Además, la capacidad para generar eventos epileptiformes en demanda proporciona un método altamente eficiente para estudiar la secuencia exacta de los eventos subyacentes a su iniciación. Aquí, describimos los modelos de crisis cortical aguda 4-aminopiridina en tejido humano y ratón.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de los mecanismos de convulsiones, tales como, qué subpoblaciones neuronales son responsables de la aparición y terminación de convulsiones electrográficas. La principal ventaja de esta técnica, es que puede reproducir eventos de convulsiones electrográficas, bajo demanda, y modelos in vivo e in vitro que recuerdan a los observados clínicamente. Esta técnica también se puede utilizar para buscar posibles terapias anticonvulsivas, intentando desencadenar eventos de convulsiones electrográficas durante la aplicación de diferentes candidatos a fármacos anticonvulsivos.
Para preparar las rodajas corticales, pegue el tejido cerebral preclínico en la etapa de Vibratome, utilizando pegamento adhesivo instantáneo. Coloque suavemente el soporte de especimin en la bandeja del tampón. Asegurar que la parte dorsal del cerebro está frente a la hoja del Vibratome.
Corta el cerebro en secciones de 450 micrómetros de espesor, en la dirección dorsal a ventral. Haga el primer corte en el cerebro animal preclínico para eliminar la bombilla olfativa. A continuación, realice cortes posteriores hasta que se observe el área del motor somatosensorial.
Utilice una pipeta de diámetro ancho. Transfiera las rodajas coronales dirigidas a un plato de Petrie que contenga solución de disección en frío. Para las rodajas coronales, haga un corte transversal justo debajo de la comisura neo cortical, y luego, corte en la línea media para separar los hemisferios.
Luego, usa una nueva cuchilla de afeitar para cortar cualquier exceso de tejido de las rodajas. Es fundamental realizar el procedimiento de corte cerebral de manera eficiente. Cada momento el tejido cerebral no está sumergido en ACSF, es perjudicial para su calidad.
El tejido cerebral dañado y de mala calidad es menos propenso a generar eventos de convulsiones electrográficas. Transfiera la porción dorsal de las rodajas coronales, que contienen la neo corteza, a un segundo plato petrie lleno de 35 grados Celsius ACSF, por un momento. A continuación, transfiera rápidamente las rodajas a una cámara de incubación, que contiene 35 grados Celsius carbogenado ACSF.
Deje las rebanadas cerebrales ligeramente sumergidas en la cámara de incubación a 35 grados celsius durante 30 minutos. A continuación, retire la cámara de incubación del baño de agua y deje que vuelva a la temperatura ambiente. Espere una hora a que las rebanadas cerebrales se recuperen antes de realizar grabaciones electrofisiológicas.
En este procedimiento, corte el papel de la lente que es ligeramente más grande que la rebanada del cerebro. Utilice una pipeta de diámetro ancho o un cepillo de detalle para transferir una rebanada de cerebro al papel de la lente recortada que se mantiene en su lugar usando una pinza dental. Luego, transfiera el papel de la lente con una rebanada cerebral a la cámara de grabación y fíjelo en su posición con una pantalla de arpa.
Posteriormente, profusa la rebanada cerebral en la cámara de grabación con ACSF carbógeno a 35 grados Celsius a una velocidad de tres mililitros por minuto. Utilice un termómetro digital para asegurarse de que la cámara de grabación es de 33 a 36 grados centígrados. A continuación, rellene los electrodos de vidrio con 10 microlitros de ACSF, utilizando una jeringa Hamilton.
Bajo el estereomicroscopio 20 veces, guía el electrodo de vidrio de grabación en la capa cortical superficial, dos, tres, usando manipuladores manuales. Vea la actividad eléctrica de la rebanada cerebral con software estándar. Para inducir actividades electrográficas similares a convulsiones, profusa la rebanada cerebral con ACSF que contiene 4-AP a 100 micromolares.
Vea la actividad eléctrica de la rebanada cerebral con software estándar. Para generar eventos electrográficos similares a convulsiones, utilizando la estrategia optogenética en las rebanadas cerebrales de ratones optogenéticos, utilice un manipulador manual para colocar una fibra óptica de 1.000 micras de diámetro del cordón directamente sobre la región de grabación. Aplique un breve pulso de luz azul para iniciar un evento ictal.
Un programa basado en MATLAB fácil de usar fue desarrollado específicamente para detectar y clasificar los diversos tipos de eventos epileptiformes que ocurren en los modelos de convulsiones in vitro e in vivo 4-AP. Este programa de detección está disponible en el repositorio GitHub de Valiante Labs. La aplicación de 100 micromolar 4-AP a buena calidad 450 micrones cerebrales corticales del tamaño de 450 micras de un ratón de canalrhodopsin VGAT juvenil, indujo de forma fiable eventos de ictal recurrentes en 15 minutos.
La aplicación de 100 micromolares 4-AP a rebanadas de mala calidad, resultó en eventos de ráfaga o actividad de pico. En promedio, el 40% de las rebanadas de cada cerebro preclínico diseccionado, generaron con éxito eventos similares a los ictal. Además, el 83% de los ratones diseccionados dieron como resultado al menos una rebanada cerebral que generó con éxito eventos similares a los ictal.
En las rebanadas cerebrales con eventos similares a los ictales, la aplicación de un breve pulso de luz de 30 milisegundos en la rebanada cerebral, desencadenó de forma fiable un evento similar al ictal que era idéntico en morfología. Los mismos hallazgos se hicieron en rodajas cerebrales de tu Channelrhodopsin dos ratones. Por lo tanto, independientemente de qué subpoblación neuronal se activó, cualquier breve evento de sincronización en la red neuronal cortical aislada, condujo a la aparición de un evento similar al ictal.
Estos eventos de forma ictal estaban compuestos por un pico centinela, disparos tónicos, disparos clonales y una actividad similar a una ráfaga hacia el final. Eran de naturaleza similar a las firmas electrográficas asociadas con las convulsiones clínicas. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros tipos de transiciones de estado cerebral para abordar preguntas como, ¿cuáles son los mecanismos neurobi biológicos subyacentes a las transiciones de estado cerebral?
¿Y cómo podemos regular estas transiciones para evitar la entrada en varios estados cerebrales patológicos?
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Descripción general
Este estudio se centra en el uso de modelos agudos de convulsiones, utilizando específicamente 4-aminopiridina, para investigar los mecanismos de las actividades epileptiformes en tejidos corticales tanto de ratón como humanos. La capacidad de inducir eventos convulsivos electrográficos a demanda permite un examen detallado del comportamiento neuronal asociado al inicio y la terminación de las convulsiones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Investigación sobre epilepsia
Antecedentes
- Comprender los mecanismos subyacentes de las convulsiones es fundamental para desarrollar tratamientos eficaces.
- Los modelos agudos de convulsiones permiten la observación en tiempo real de la dinámica convulsiva.
- Los registros electrofisiológicos revelan información sobre el inicio y la propagación de las convulsiones.
- La técnica tiene aplicaciones potenciales en la evaluación de fármacos anticonvulsivos.
Objetivo del estudio
- Explorar las subpoblaciones neuronales responsables del inicio y la terminación de las convulsiones.
- Evaluar de manera controlada la eficacia de posibles terapias anticonvulsivas.
- Investigar la caracterización de eventos similares a crisis epilépticas en cortes cerebrales corticales.
Métodos Utilizados
- El estudio utilizó cortes cerebrales corticales agudos preparados a partir de tejidos de ratones y humanos.
- Se realizaron grabaciones electrofisiológicas para medir actividades similares a convulsiones inducidas por 4-aminopiridina.
- Se emplearon protocolos detallados de corte e incubación para asegurar la viabilidad del tejido.
- Se incorporaron estrategias optogenéticas para desencadenar eventos ictales mediante estimulación luminosa precisa.
- Se desarrolló un software basado en MATLAB para detectar y clasificar eventos epileptiformes.
Resultados principales
- El protocolo indujo de manera confiable eventos similares a crisis epilépticas en cortes cerebrales de alta calidad dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación de 4-AP.
- Se encontró que el 40 % de los cortes generaron exitosamente estos eventos, lo que indica una preparación efectiva del tejido.
- Las respuestas incluyeron una espiga centinela característica y diversas fases de descarga neuronal indicativas de actividad convulsiva.
- Se observaron resultados similares en diferentes modelos de ratón, lo que resalta la robustez de la técnica.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método confiable para inducir y estudiar convulsiones electrográficas, aportando conocimientos sobre los mecanismos neuronales implicados en la epilepsia.
- Los hallazgos respaldan la exploración de la dinámica de las convulsiones in vivo e in vitro.
- Comprender estos mecanismos podría conducir a mejores estrategias de tratamiento para la epilepsia y otros trastornos relacionados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inducción bajo demanda de eventos electrográficos de convulsión en modelos corticales agudos permite una interrogación precisa de los mecanismos neuronales subyacentes a la iniciación y terminación de las convulsiones. Esta capacidad apoya la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en el descubrimiento de fármacos antiepilépticos, al permitir la evaluación reproducible y cuantitativa de los efectos de compuestos anticonvulsivos sobre fenotipos electrofisiológicos definidos. La relevancia traslacional se ve potenciada por la aplicabilidad tanto a tejido de roedores como humano, facilitando la validación cruzada entre especies de hipótesis terapéuticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar subpoblaciones neuronales específicas responsables del inicio y la terminación de las crisis electrográficas mediante activación optogenética o farmacológica.
- Valor operativo: Proporciona una plataforma reproducible para evaluar si la modulación de vías neuronales específicas previene o modifica eventos similares a las crisis, lo que apoya la comprobación de hipótesis sobre dianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera eventos electrográficos cuantificables similares a convulsiones con morfología definida (espiga centinela, descarga tónico-clónica, actividad en ráfagas) adecuados para cribado de alto contenido.
- Valor operativo: Permite la inducción estandarizada de eventos ictales mediante 4-AP, pulsos optogenéticos o soplos de neurotransmisores, posibilitando pruebas consistentes de compuestos entre laboratorios.
- Valor científico: Facilita la evaluación de candidatos a fármacos anticonvulsivos mediante la medición de su impacto en la frecuencia, duración o características electrográficas de las convulsiones durante la inducción bajo demanda.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Utiliza tejido cortical humano para generar eventos similares a crisis clínicas, mejorando la confianza predictiva sobre la eficacia terapéutica.
- Valor operativo: Permite mantener la continuidad desde cribados agudos hasta modelos de epilepsia crónica, al validar que los eventos inducidos replican las firmas electrográficas clínicas.
- Valor científico: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al vincular manipulaciones neuronales específicas con cambios en la dinámica de las convulsiones, orientando la selección de dianas para el avance preclínico.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar un ensayo fisiológicamente relevante para la validación del blanco y la selección de compuestos antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los mecanismos neuronales que subyacen a la iniciación de convulsiones mediante la inducción precisa y bajo demanda de episodios ictales en redes corticales.
- Selección: Proporciona lecturas electrofisiológicas cuantitativas y reproducibles (frecuencia de eventos, morfología, duración) esenciales para la estandarización de ensayos y la comparación de compuestos.
- Análisis: Permite la detección y clasificación de eventos epileptiformes mediante software basado en MATLAB, proporcionando métricas objetivas para evaluar los efectos de los compuestos sobre la dinámica convulsiva.
- Investigación Traducional: Utiliza tejido humano para garantizar la relevancia de la enfermedad, conectando hallazgos del descubrimiento con la investigación preclínica y clínica de la epilepsia.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y escalable para evaluar diversos mecanismos anticonvulsivos en múltiples proyectos y modalidades terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad en los mecanismos neuronales de generación y propagación de convulsiones.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad de la inducción de convulsiones en preparaciones de tejido de roedores y humanos, apoyando campañas de cribado en múltiples centros.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción al permitir una evaluación rápida y cuantitativa de los efectos de compuestos anticonvulsivos sobre puntos finales electrofisiológicos definidos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos según su capacidad para suprimir o modificar eventos similares a crisis ictales en modelos clínicamente relevantes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología, corte de tejidos y técnicas de inducción de convulsiones mediante optogenética o fármacos.
- Depende de instrumentación para el registro electrofisiológico, perfusión precisa de fluidos (por ejemplo, 4-AP, ACSF) y estimulación óptica (para activación optogenética).
- Necesita protocolos estandarizados de preparación de tejidos para asegurar la viabilidad de los cortes y una generación consistente de eventos ictales, ya que la calidad del tejido afecta directamente las tasas de éxito.
- Requiere adaptación de los parámetros de inducción (por ejemplo, concentración de 4-AP, duración del pulso de luz, volumen del chorro de neurotransmisor) al trasladar entre modelos de tejido de roedores y humanos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad en la calidad de los cortes y la necesidad de manipulación experta para mantener la salud del tejido durante la preparación y el registro.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Preparation of Cortical Slices from the Somatosensory-motor Cortex
2:40
Electrophysiological Recordings of the Superficial Cortical Layer and Seizure Induction
4:43
Results: Acute In Vitro 4-AP Cortical Seizure Model and Ictal Events Generated by Optogenetics
6:19
Conclusion
