Name: Generación y demanda inicio de la actividad Ictal aguda en roedores y tejido humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprende a generar crisis epilépticas agudas bajo demanda en cortes cerebrales de roedores y tejido humano usando 4-aminopiridina. Este método permite estudiar mecanismos neuronales y evaluar terapias anticonvulsivas de forma controlada.

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Este trabajo fue financiado por los institutos canadienses de investigación de salud (MOP 119603 Taufik A. Valiante y Peter L. Carlen), el Instituto del cerebro de Ontario (a Taufik A. Valiante) y la beca de investigación del estudiante de Mightex (a Michael Chang). Nos gustaría dar las gracias a Liam Long para su ayuda en la película el manuscrito video. Nos gustaría reconocer Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran y Shadini Dematagoda por su ayuda en la recopilación de las figuras y tablas en este manuscrito. Figuras 1A, 3A, 4Ay 6A son todas figuras originales de datos publicados en Chang et al. 16.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Las rebanadas del cerebro se tratan con un medicamento proconvulsant o una solución ACSF alterado para aumentar la excitabilidad de la red neuronal y promover una precipitación de acontecimientos ictales (electrográficas asimiento-como acontecimientos). Para los ratones, deben contener las rebanadas coronales preferidas del área somatosensorial-motor de la corteza del cíngulo, área 2 (CG), pero no el área de retrosplenial (RS); Estos marcadores anatómicos ayudan a identificar la gama de rebanadas coronales que son los me...

Modelos de crisis aguda pueden reproducir con éxito firmas electrográficas ictales eventos observados en el electroencefalograma (EEG) de las personas que experimentan una convulsión recuerdas. Los investigadores utilizan estos acontecimientos ictal como (en adelante 'ictales eventos') como sustitutos para el evento de decomiso1. Clínico, ictales eventos sirven como un proxy confiable para los eventos de crisis puesto que las convulsiones son un trastorno neurológico que se origina en el cerebro. En la unidad de monitoreo de epilepsia, neurólogos se basan en la detección de eventos ictales para confirmar la región epileptógena del cerebro y aislarlo para resección2. En la unidad de cuidados intensivos, los médicos monitorear actividad ictal evaluar si persiste cualquier actividad convulsiva en pacientes sedados3. Controlar las convulsiones queda un tema desafiante para la comunidad médica, como 30% de pacientes con epilepsia son resistentes a los fármaco a la medicación disponible4,5, y 10% de casos médicos de convulsiones inducidas por drogas no responde al tratamiento estándar3. Esto presenta una seria preocupación para la sociedad, como 10% de la población estadounidense es prospectado para experimentar un episodio de convulsión en su vida y se espera que el 3% desarrollan epilepsia6.
Estudiando las convulsiones en modelos de epilepsia crónica es caro, laborioso y a menudo toma meses para preparar7. También es difícil realizar las grabaciones electrofisiológicas en animales en libre movimiento. Ensayos clínicos en humanos enfrentan a problemas similares, así como complicaciones adicionales relacionadas con el consentimiento del paciente, variabilidad de orígenes de los participantes y las consideraciones Morales y éticas involucradas8. Modelos de crisis aguda, por el contrario, son favorables porque son relativamente cómoda para prepararse, rentable y capaz de generar grandes volúmenes de eventos ictales de estudio9. Además, el tejido se fija en una posición estable, por lo que las condiciones son ideales para realizar las grabaciones electrofisiológicas necesarias para estudiar la dinámica de la crisis y la patofisiología subyacente relacionada. Modelos de convulsión aguda siguen siendo favorables sobre modelos en silico (PC) porque se basan en material biológico compuesto por constituyentes red neuronal del cerebro con todos sus factores inherentes y conectividad sináptica, que no puede ser capturado por la computadora más detallada de los modelos10. Estas características hacen de modelos de convulsión aguda preparados para ser eficiente en la detección de potenciales terapias anticonvulsivas y que resultados preliminares antes de avanzar para la posterior investigación en modelos de epilepsia crónica y ensayos clínicos.
Por lo general, modelos de convulsión aguda se derivan el tejido normal del cerebro que ha sido sometido a condiciones hiper excitable. Para inducir acontecimientos ictales clínicamente relevantes en el tejido cerebral sano, es importante entender que el cerebro funcione óptimamente en un estado crítico11 donde (E) de la excitación y la inhibición (I) son equilibrados12. Una interrupción de la E-I equilibrio puede llevar al estado de crisis hiper excitable que precipitan acontecimientos ictales. Por consiguiente, dentro de este marco conceptual, existen dos estrategias principales para generar eventos de ictales en rebanadas de cerebro (en vitro) o en preparaciones de todo el cerebro (en vivo): aumento o disminución de la inhibición ("desinhibición") excitación ("no-desinhibición"). Sin embargo, acontecimientos ictales son altamente ordenados y sincronización eventos que requieren de la influencia de interneuronas GABAérgicas para organizar la red de los nervios actividad13,14. Por esta razón, modelos de desinhibición no son los más efectivos para generar acontecimientos ictales en redes neuronales aisladas, como en una en vitro cerebro rebana15, mientras que en vitro modelos desinhibición comúnmente clavar actividad recuerda a clavar interictal-como. Además, dentro de este marco conceptual, un evento momentáneo de sincronización también fiable puede desencadenar un evento ictal16. De hecho, un evento ictal puede ser desencadenado por cualquier perturbación menor aplicada a los sistemas neuronales17 cuando se encuentra en un estado crítico de punto de transición ("bifurcación")18. Tradicionalmente, estas perturbaciones fueron inducidas por estimulación eléctrica. Sin embargo, el reciente desarrollo de optogenetics en neurociencia, ofrece ahora una estrategia más elegante para inducir transiciones de estado crítico16.
Los métodos descritos en este artículo muestran cómo generar acontecimientos ictal en demanda en modelos de convulsiones agudas en vitro (paso 1 del Protocolo) y estudios en vivo (paso 2 del Protocolo). Implican la elección de la región del cerebro, método de inducción de convulsiones, tipo de estudio y especies; sin embargo, nos centraremos en la opción recomendada de un modelo agudo 4-AP corticales convulsiones debido a su versatilidad en una amplia variedad de tipos de estudios. El modelo de 4 AP convulsiones agudas en vitro se basa en el protocolo estándar para preparar rodajas de cerebro de alta calidad para grabaciones electrofisiológicas y la proyección de imagen estudia19. Estos protocolos ya han sido utilizados para hacer en vitro cerebro coronales rebanadas de la corteza somáticosensorial-motor de ratones16,20 y seres humanos21. Modificaciones para generar acontecimientos ictales en estos tipos de rebanadas del cerebro han demostrado previamente16 y todos los detalles se describen en el Protocolo a continuación. El modelo agudo en vivo 4-AP convulsiones corticales se basa en el protocolo estándar para preparar una craneotomía para la proyección de imagen estudios22. La modificación es que no hay ventana (portaobjeto) está instalada después de la craneotomía. En cambio, agentes proconvulsant (4-AP) se aplican tópicamente a la corteza expuesta para inducir acontecimientos ictales mientras el animal está bajo anestesia general. A nuestro conocimiento, nuestro grupo fue el primero en desarrollar este modelo de crisis cortical aguda en vivo en ratones16,23. El modelo de crisis cortical 4-AP aguda en vivo preparado a partir de ratones adultos fue desarrollado para complementar el modelo de corte en vitro del tejido juvenil. La replicación de los resultados en el modelo adulto en vivo ataque ayuda a generalizar los resultados de los modelos de la rebanada por atender las preocupaciones inherentes en cuanto a las condiciones no fisiológicas de un trozo de cerebro 2D (frente a un 3-d todo el cerebro estructura) y las diferencias fisiológicas entre juvenil y adulta del tejido.
El método de iniciación de evento ictal en la demanda se demuestra utilizando cualquiera de los dos soplos de neurotransmisores con estrategias de picospritzer o optogenetic. A lo mejor de nuestro conocimiento, nuestro grupo es el primero en iniciar acontecimientos ictales en tejido humano mediante neurotransmisores a través de un picospritzer16. Estrategias de optogenetic, la cepa de ratones C57BL/6 es la tensión convencional utilizada para la expresión de los transgenes. La expresión de channelrhodopsin-2 (ChR2) en interneuronas GABAérgicas o las células piramidales glutamatérgica proporcionará la capacidad opcional para generar acontecimientos ictal en demanda con pulsos breves de luz. Cepas de ratones de optogenetic conveniente incluyen la variante disponible en el mercado de C57BL/6 que expresa ChR2 en o interneuronas, utilizando el ratón vesicular GABA transporter promotor (VGAT)24, o las células piramidales, usando el antígeno de la célula de ratón timo 1 promotor (Thy1)25. Estos ratones VGAT ChR2 y Thy1-ChR2 comercialmente disponibles ofrecen la oportunidad de activar las neuronas GABAérgicas o neuronas glutamatérgica, respectivamente, en el neocortex con azul (470 nm) luz. La capacidad de generar eventos ictales en demanda en modelos de convulsiones agudas puede ofrecer oportunidades novela estudio convulsión iniciación dinámica y eficientemente evaluar potenciales terapias anticonvulsivas.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital de sodio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de los proveedores del Toronto Western Hospital</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mm</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprada a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Aguja estéril de 25G 5/8"</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprada a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de un solo filo (2x)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprada a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Pegamento adhesivo instantáneo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Papel para lentes</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med</td></tr><tr><td>Store Placa de Petri de vidrio (2x)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med</td></tr><tr><td>Store Pinzas de astillas (2x)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Micro espátula con mango de PVC</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med Tienda</td></tr><tr><td>Micro cuchara con extremo plano</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Pincel para detalles 5/0</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado en una boutique de arte</td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia de diámetro ancho</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med</td></tr><tr><td>Store Pinza dental</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med</td></tr><tr><td>Store Termómetro (digital)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado en Amazon.ca</td></tr><tr><td>Tanque de carbógeno Check (95%O2/5%CO2)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de los proveedores del Toronto Western Hospital</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de los proveedores del Toronto Western Hospital</td></tr><tr><td>cámara de incubación de cortes de cerebro (también conocida como guardian de cortes de cerebro)&nbsp;</td><td>Scientific Systems Design Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO4 H2O)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med Store</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico monohidratado (HNaPO4&middot; H2O)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med</td></tr><tr><td>Store Cloruro de calcio (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med</td></tr><tr><td>Store Sacarosa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado a través de UT Med Store</td></tr></tbody></table>

generación y demanda inicio de la actividad ictal aguda en roedores y tejido humano

Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue

Controlar las convulsiones, sigue siendo un tema difícil para la comunidad médica. Para avanzar, los investigadores necesitan una forma de estudiar dinámica del asimiento e investigar sus mecanismos subyacentes. Convulsión aguda modelos son convenientes, ofrecen la posibilidad de realizar grabaciones electrofisiológicas y pueden generar un gran volumen de electrográficas asimiento-como acontecimientos (ictal). Los resultados prometedores de los modelos de la convulsión aguda luego pueden avanzar a modelos de epilepsia crónica y ensayos clínicos. Así, estudiando convulsiones en aguda modelos que reproducen fielmente las firmas electrográficas y dinámicas de un ataque clínico será esencial para hacer los resultados clínicamente relevantes. Estudiar acontecimientos ictales en convulsión aguda modelos preparados a partir de tejido humano también es importante para hacer conclusiones que son clínicamente relevantes. El objetivo primordial en este trabajo es en el modelo cortical de la 4-AP debido a su versatilidad en la generación de acontecimientos ictales en estudios tanto en vivo como en vitro , así como en ratón y tejido humano. Los métodos en este artículo también describe un método alternativo de la inducción de convulsiones mediante el modelo de cero Mg2 + y proporcionar una descripción detallada de las ventajas y limitaciones de la actividad epileptiforme generada en las distintas aguda modelos de convulsiones. Por otra parte, aprovechando comercialmente disponible optogenetic cepas de ratón, un pulso de luz breve (30 ms) puede utilizarse para activar un evento ictal idéntico a las que ocurren espontáneamente. Asimismo, ms de 30-100 bocanadas de neurotransmisores (Ácido Gamma Amino butírico o glutamato) pueden aplicarse a tejido humano para desencadenar eventos ictales que son idénticos a las que ocurren espontáneamente. La capacidad de desencadenar acontecimientos ictal en demanda en modelos de convulsiones agudas ofrece la recién descubierta capacidad de observar la secuencia exacta de eventos que subyacen la dinámica de la iniciación de asimiento y evaluar eficientemente potenciales terapias anticonvulsivas.

La aplicación de 100 μm 4-AP a rebanadas de cerebro cortical μm tamaño 450 (intacto) buena calidad de un juvenil VGAT ChR2 ratón inducido confiablemente ictal eventos recurrentes (&gt; 5 s) dentro de 15 min (figura 1Ai). La aplicación de 100 μm 4-AP a rebanadas de mala calidad producido explosión eventos o clavar actividad (figura 1Aii). En promedio, 40% de las láminas de cada cerebro de ratón disecado había generado con éxito ac...

Modelos de convulsión aguda son importantes para el estudio de los mecanismos subyacentes a los eventos epileptiformes. Además, la capacidad para generar eventos epileptiformes en demanda proporciona un método altamente eficiente para estudiar la secuencia exacta de los eventos subyacentes a su iniciación. Aquí, describimos los modelos de crisis cortical aguda 4-aminopiridina en tejido humano y ratón.

Generación y demanda inicio de la actividad Ictal aguda en roedores y tejido humano

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de los mecanismos de convulsiones, tales como, qué subpoblaciones neuronales son responsables de la aparición y terminación de convulsiones electrográficas. La principal ventaja de esta técnica, es que puede reproducir eventos de convulsiones electrográficas, bajo demanda, y modelos in vivo e in vitro que recuerdan a los observados clínicamente. Esta técnica también se puede utilizar para buscar posibles terapias anticonvulsivas, intentando desencadenar eventos de convulsiones electrográficas durante la aplicación de diferentes candidatos a fármacos anticonvulsivos.Para preparar las rodajas corticales, pegue el tejido cerebral preclínico en la etapa de Vibratome, utilizando pegamento adhesivo instantáneo. Coloque suavemente el soporte de especimin en la bandeja del tampón. Asegurar que la parte dorsal del cerebro está frente a la hoja del Vibratome.Corta el cerebro en secciones de 450 micrómetros de espesor, en la dirección dorsal a ventral. Haga el primer corte en el cerebro animal preclínico para eliminar la bombilla olfativa. A continuación, realice cortes posteriores hasta que se observe el área del motor somato

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra la inducción de eventos ictales en cortes corticales coronales de un ratón transgénico que expresa canales catiónicos activados por luz en neuronas piramidales excitadoras corticales. El corte se coloca en una cámara de registro y se inserta un electrodo de registro en la capa cortical superficial. Tras la perfusión con un fármaco inductor de convulsiones que bloquea los canales de potasio, las neuronas se vuelven hiperexcitables y generan eventos ictales espontáneos. Para...

Generación de eventos ictales espontáneos y bajo demanda en cortes corticales del cerebro de ratón

Fuente: Jang, S., et al, Convulsiones electroconvulsivas en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por convulsiones en las proteínas de densidad postsináptica. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la inducción de una convulsión electroconvulsiva aguda (ECS) en un modelo de rata para estudiar la neuroplasticidad inducida por convulsiones. Los investigadores aplican estimulación eléctrica a través de electrodos de clip para los oídos, lo que desencadena...

Inducción de una convulsión electroconvulsiva aguda en un modelo de rata

Aquí demostramos el uso de una tecnología inalámbrica para el electroencefalograma (EEG) en modelos neonatos de roedores con enfermedades humanas. Con la telemetría, no hay conexiones que entorpezcan, lo que permite comportamientos naturales.

A largo plazo Monitoreo EEG continua en Modelos pequeño roedor de las enfermedades humanas Uso del Sistema Transmisor inalámbrico Epoch

Este video presenta los procedimientos de preparación, registro y análisis de fuentes de EEG de alta resolución en ratas sedadas con un modelo preclínico particular de epilepsia focal en condiciones no invasivas.

Cerebro Imaging Source en modelos preclínicos de la rata de la epilepsia focal usando de alta resolución EEG Grabaciones

Las oscilaciones son propiedades fundamentales de la red y son modulados por la enfermedad y las drogas. El estudio de las oscilaciones cerebrales rebanada permite la caracterización de las redes aisladas en condiciones controladas. Los protocolos se proporcionan para la preparación de cortes de cerebro agudos para evocar oscilaciones γ CA1.

Generación de oscilaciones γ CA1 locales por tetánica Estimulación

Este protocolo describe un montaje quirúrgico para una toma de corriente del electrodo de epicranial permanente y un electrodo de pecho implantado en roedores. Al colocar un segundo electrodo en el zócalo, diferentes tipos de la estimulación eléctrica cerebral transcraneal pueden proporcionarse al sistema motor en animales alerta a través del cráneo intacto.

Estimulación eléctrica cerebral transcraneal en roedores alerta

Este protocolo detallado describe la colocación del electrodo de estimulación transcraneal en el hueso temporal para investigar los efectos a corto y largo plazo de la estimulación eléctrica transcraneal en mover libremente las ratas.

Estimulación eléctrica transcraneal crónica y grabación Intracortical en ratas

Ilustramos cómo realizar grabación y eléctrica de la modulación de la actividad epileptiforme inducida por 4-aminopiridina en rebanadas de cerebro de roedores utilizando microelectrodos. Una cámara de grabación personalizada mantiene la viabilidad del tejido a lo largo de prolongadas sesiones experimentales. Asignación de electrodo en vivo y selección de pares estimulantes son realizados por una interfaz de usuario gráfica personalizada.

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

El protocolo presentado describe el transporte y la preparación del tejido hipocampal humano resecado con el objetivo final de utilizar las rebanadas cerebrales vitales como una herramienta de evaluación preclínica para posibles sustancias antiepilépticas.

Preparación de rebanadas agudas de hipocampo humano para grabaciones electrofisiológicas

Aquí, describimos la preparación de las rebanadas organotípicas de la corteza rinal-hipocampo. Bajo una privación gradual y controlada del suero, estas rebanadas representan la evolución epiléptica-como acontecimientos y se pueden considerar un modelo ex vivo del epileptogenesis. Este sistema representa una excelente herramienta para monitorear la dinámica de la actividad espontánea, así como para evaluar la progresión de las características neuroinflamatorias a lo largo del curso de la...

Un Modelo De Epileptogénesis En La Corteza Rinal-Hipocampo Organotípica Slice Cultivos

Este informe describe los métodos para generar un modelo de epilepsia del lóbulo temporal basado en el encendido eléctrico de ratones transgénicos VGAT-Cre. Los ratones VGAT-Cre encendidos pueden ser útiles para determinar qué causa la epilepsia y para detectar nuevas terapias.

Preparación e implantación de electrodos para encender eléctricamente ratones VGAT-Cre para generar un modelo para la epilepsia del lóbulo temporal

Aprende a generar crisis epilépticas agudas bajo demanda en cortes cerebrales de roedores y tejido humano usando 4-aminopiridina. Este método permite estudiar mecanismos neuronales y evaluar terapias anticonvulsivas de forma controlada.

Generación y demanda inicio de la actividad Ictal aguda en roedores y tejido humano

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