Name: Microscopía espectral reflectométrico en axones mielinizados en Situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende a realizar microscopía espectral reflectométrica para analizar axones mielinizados en tejido nervioso intacto sin marcadores. Esta técnica permite obtener información nanométrica de la mielina con dosis de luz menores que la microscopía confocal convencional.

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Este trabajo fue financiado por el Instituto de ciencias básicas (IBS-R015-D1) y programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2017R1A6A1A03015642).

Todos los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Sungkyunkwan.
1. preparación de la muestra
Nota: Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de manejo de animales. Llevar a cabo todos actuación quirúrgica en una sala dedicada a procedimientos quirúrgicos. Guantes y batas quirúrgicas estériles deben llevarse por todo el personal en la sala quirúrgica en todo momento.
<ol><li>
Fijación del tejido
	<ol>
<li>Preparar dos jeringas de 10 mL, que cada uno relleno con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 4% paraformaldehido (PFA) en PBS.</li>
		<li>Anestesiar un ratón de 7-12 semanas de edad, (C57BL/6J o las líneas de ratón con ambos sexos) mediante la administración de una mezcla de zoletil y xilacina (1:1, 20 mg/kg cada uno) o un régimen de anestesia conveniente alternativa (por ejemplo, mezcla de 80 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina) con una inyección intraperitoneal.</li>
		<li>Una vez que el ratón ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia (uso el método de respuesta a la pizca del dedo del pie), exponer el corazón cortando la piel y la caja torácica con las tijeras.</li>
		<li>Cortar la aurícula derecha con pequeñas tijeras para drenar la sangre y la perfusión de la solución PBS y PFA secuencialmente a través del ventrículo izquierdo con una aguja (tasa de perfusión = 4 mL/min, volumen = 10 mL de cada solución). Nota: El ratón se convierte en duro si el procedimiento se ha completado con éxito. El uso de ungüento oftálmico o esterilización no es necesario ya que el procedimiento es terminal. El procedimiento de fijación puede ser saltado. Sin embargo, este paso se recomienda para reducir las deformaciones estructurales incluyendo daño a los tejidos mecánicos e hinchazón axonal isquémico. Para más detalles sobre la fijación de tejido, consulte el artículo de Gage, G. J. et al. 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la rebanada del cerebro
	<ol>
<li>Decapitar el ratón con tijeras quirúrgicas a través del tórax ventral y el abdomen.</li>
		<li>Quitar el cuero cabelludo y el periostio con una tijeras convenientemente pequeña hasta exponer completamente el cráneo.</li>
		<li>Romper el hueso frontal y cortar el cráneo a lo largo de la sutura sagital del hueso occipital con pequeñas tijeras con cuidado de no para dañar el cerebro.</li>
		<li>Retire suavemente el cráneo y la duramadre secuencialmente con unas pinzas finas.</li>
		<li>Extraer el cerebro con una cuchara de plástico suave, teniendo cuidado de no para dañar el tejido.</li>
		<li>Enjuagar y remojar el cerebro extraído en una solución PFA 4% durante 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Cortar el cerebro fijado en 100 – 150 μm secciones con un vibratome. Nota: Para más detalles sobre la preparación del tejido, consulte el artículo de Segev et al. 11. para los procedimientos posteriores, el tejido debe ser cortado en secciones más fino que el espesor del espaciador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaje de la rebanada del cerebro
	<ol>
<li>Preparar 1 diapositiva de cristal y 2 vasos cuadrados de cubierta (22 × 22 × 0,17 mm) para cada rebanada de tejido.</li>
		<li>Cortar uno de los vidrios de cubierta cuadrados en la mitad (dos piezas rectangulares) usando un cortador de vidrio.</li>
		<li>Conecte los dos de los vidrios de cubierta a la mitad utilizando un pegamento en el cristal de la diapositiva. Nota: El espacio entre los dos vasos a la mitad debe ser ligeramente mayor que el tamaño de la rodaja de tejido.</li>
		<li>Cosecha de la rebanada del cerebro utilizando un cepillo o una pipeta y coloque el tejido en el cristal deslizante entre el espaciador. Tenga cuidado de no para doblar el tejido.</li>
		<li>Dispensar 100 μL de PBS en la superficie del tejido.</li>
		<li>Lugar el otros cuadrada cubierta de vidrio en la parte superior del tejido. Evitar la inclusión de burbujas de aire durante esta etapa.</li>
		<li>Selle alrededor del vidrio de cubierta con un esmalte de uñas (o adhesivos como alternativa adecuados) para evitar la evaporación de PBS y la contaminación por el polvo durante la sesión de imágenes posteriores. Nota: El experimentador puede detenerse en esta etapa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. calibración
<ol><li>Encienda el microscopio al menos 1 h antes de la proyección de imagen para permitir la estabilización térmica del láser (véase Tabla de materiales) de la fuente. A continuación, abra el software de análisis espectral (véase Tabla de materiales) y haga clic en el botón adquirir GUI (figura 3a).
</li>
	<li>Abra el software de disparo para el láser de luz blanca (WLL) y tubo fotomultiplicador (PMT) (figura 3a).</li>
	<li>Seleccione el modo xyΛ en la lista desplegable en el Modo de adquisición, entonces, el modo de entrada de láser automáticamente cambia de porcentaje constante a Potencia constante. Desactive la casilla de verificación de Movimiento automático de SP. Y a continuación, establezca la ventana espectral del láser de entrada 470-670 nm y el tamaño de paso espectral a 4 nm en Λ-excitación Lambda Scan configuración (figura 3b).</li>
	<li>ESTABLECER el rango espectral del PMT a 450 690 doble clic o mover la barra de ajuste para la gama espectral (Figura 3C). Nota: Este espectro debe incluir el ancho de banda completo de la fuente de entrada.</li>
	<li>Seleccione un objetivo de inmersión en agua, convenientemente con una alta apertura numérica (NA > 0,7) y dar cualquier valor a poder PMT y láser para activar el botón de configuración AOBS y Live Scan . Cambiar la trayectoria óptica control de reflejo en la Configuración AOBS (Figura 3d).</li>
	<li>Montar un espejo de referencia (véase Tabla de materiales) en la platina del microscopio. La superficie del espejo debe encararse contra la lente del objetivo. Si no es fácil de poner el espejo en la platina del microscopio, enlazar un espejo sobre la placa plana (e.g. cristal de la diapositiva).</li>
	<li>Control de la platina del microscopio para alinear el plano focal a la superficie del espejo.</li>
	<li>Ajustar la ganancia de la PMT y la potencia del láser teniendo en cuenta el rango dinámico de los detectores y luego cambiar el modo de entrada de láser por ciento constante a Potencia constante. Nota: Como es típico, un PMT ganancia de 500 (V) y una potencia de láser relativa de 0,1% utilizan a 570 nm.</li>
	<li>Confirmar en modo pseudo-color para comprobar que no hay ninguna saturación en toda la gama de longitud de onda. Si se observa saturación, bajar la potencia del láser (figura 3a).</li>
	<li>Ejecutar la adquisición Lambda Scan .</li>
	<li>Quite el espejo de la etapa y repetir la misma adquisición sin una muestra para obtener la referencia (es decir, offset oscuro).</li>
	<li>Guardar los datos en un formato TIF Multistacked .</li>
</ol>3. adquisición de la imagen SpeRe
<ol><li>Coloque el tejido montado en la platina del microscopio. Áspero alinear el tejido para el plano focal de la lente del objetivo, utilice el modo de campo amplio de la fluorescencia a través de un ocular.</li>
	<li>Con la Live Scan en control de la platina del microscopio para alinear el plano focal para la región de interés en el tejido. Para evitar el ruido de fondo de la hoja de cubierta, seleccione la región de destino de al menos 15 de μm de profundidad desde la interfaz de tejido de vidrio.</li>
	<li>Adquirir la pila de imagen espectral para la región de destino utilizando el mismo procedimiento como se describe en los pasos 2.1-2.10.</li>
	<li>Guardar los datos para el tejido y el oscuro offset en formato TIF Multistacked . Nota: El experimentador puede detenerse en esta etapa.</li>
</ol>4. procesamiento y análisis de imágenes
<ol></ol>5. línea base corrección y análisis de señales SpeRe
<ol><li>Reste los espectros de desplazamiento de los espectros del espejo de referencia y los tejidos del cerebro.</li>
	<li>Normalizar cada espectro dividiendo la intensidad máxima del espectro.</li>
	<li>Dividir el espectro normalizado del axón por el espectro normalizado del espejo de referencia y restar el offset de DC del espectro normalizado.</li>
	<li>Medir la frecuencia de wavenumber ajustando el espectro adquirido a una sinusoidal (véase Tabla de materiales) de la curva y luego convertir el número adquirido a periodicidad por tomando recíproco.</li>
	<li>Convertir la periodicidad proporción al diámetro del axón mediante la ecuación en la figura 4C.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li>
<li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li>
<li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832(2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024(2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li>
<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li>
</ol>

Los autores declaran que compiten intereses financieros: Kwon J. y M. Choi son inventores de la tecnología pendiente de patente se describe en este artículo.

SpeRe es una modalidad de etiqueta-libre nuevo basada en interferometría espectral, que por primera vez, ofrece la información de nanoescala en axones mielinizados energizados. En el actual protocolo de adquisición, la resolución espacial para el diámetro del axon es del orden de 10 nm. Por otra parte, SpeRe utiliza órdenes de la magnitud dosis más baja de luz en comparación con otras Microscopías de súper-resolución; por lo tanto, es libre de fototoxicidad y photobleaching. SpeRe proporcionaría una nueva vía para estudi...

En el mamífero sistema nervioso, mielina proporciona integridad axonal y conducción nerviosa rápida enwrapping las fibras de axones con varias capas envolturas membranosas. Su estructura multicapa se compone de alterna de nanoescala películas delgadas compuestas de membranas del plasma (~ 5 nm), citosol (~ 3 nm) y espacios extracelulares (~ 7 nm)1,2. Microscopía óptica, incluyendo la microscopía de superresolución recientes, no son adecuados para la observación de la dinámica de la mielina de escala nanométrica debido a su insuficiente resolución debido a la difracción óptica3,4,5. Aunque la microscopía electrónica puede proporcionar detalles finos de la nanoestructura de la mielina, no es compatible con los sistemas biológicos vivos debido a preparaciones de muestra altamente invasiva que involucra la fijación química y ultrasectioning6,7 . Hasta hace poco, no se ha producido ninguna técnica aplicable para observar dinámicas de nanoescala de axones myelinated en situ.
Schain Ciencias et al había divulgado previamente que axones myelinated exhiben colores reflectancia luz8. Adoptando el análisis espectroscópico de la luz reflejada, hemos ideado una nueva modalidad de imagen para imágenes a nanoescala de axones myelinated, llamado reflectometría espectral (SpeRe)9. SpeRe se basa en la interferencia de película delgada que ocurre en la estructura de varias capas de la vaina de mielina (figura 1). Por simulación óptica en varios axones, ha revelado que el espectro de reflectancia es una función periódica del número y su periodicidad (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) es inversamente proporcional al diámetro del axón (d). Esta relación simple (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) ofrece fácil cuantificación de diámetro de axón de los datos de SpeRe. Utilizando esto, nos reveló el frecuente axón abultamiento bajo craneoencefálico leve en nuestro informe anterior.
El sistema SpeRe está basado en la microscopia confocal y consiste en una fuente de láser especializado y filtros (figura 2). La fuente de entrada es un láser de luz blanca, proporciona banda ancha salida espectral visible a infrarrojo regiones. Para el análisis espectral, el sistema está equipado con dos dispositivos de acusto-óptica: un filtro sintonizable de acusto-óptica (AOTF) para la entrega de una longitud de onda seleccionada de la fuente de entrada de banda ancha y un divisor de viga de acusto-óptico (AOBS) para orientar el seleccionado refleja longitud de onda del detector. El software para microscopía confocal hiperespectral (véase Tabla de materiales) ofrece una opción de análisis espectral personalizable para adquirir secuencialmente las imágenes de reflectividad en distintas longitudes de onda en la entrada. Además, la aberración cromática críticamente puede interferir en la medición espectral; por lo tanto, se recomienda el uso de una lente de objetivo de apochromat.
De nota, láseres de luz blanca producen una salida espectral desigual y los componentes ópticos también afectan el perfil espectral. Por lo tanto, los espectros adquiridos deben ser calibrados para el posterior análisis cuantitativo. Un espejo de plata protegido se utiliza normalmente como una referencia, que proporciona una reflexión casi constante (&gt; 97%) en la región visible completo. Luego se dividen los espectros adquiridos por los espectros de referencia desde el espejo.
El tamaño de paso espectral para el análisis espectral determina la velocidad de adquisición; por lo tanto, debe ser optimizado. Como un axon más grande tiene un mayor periodo espectral, requiere más espectral muestreo. Por ejemplo, un axón con un diámetro de 10 μm, uno de los más grandes axones fisiológicos, tiene un periodo espectral de 8 nm. Mediante la aplicación de criterios de muestreo de Nyquist, se empleó el intervalo de muestreo espectral de 4 nm para cubrir todos los axones fisiológicos en los tejidos nerviosos de ratón. Este enfoque por lo general toma varios segundos para un análisis espectral completo y así no es adecuado para aplicaciones en vivo , donde el movimiento fisiológico (por ejemplo, la respiración y del latido del corazón) interfiere adquisición espectral estable. Ya resolvimos esta cuestión por equipar un microscopio vertical personalizado, diseñado para adquirir la gama completa para cada punto usando un espectrómetro de matriz (adquisición velocidad ≈ 30 m por píxel).
En este informe, describimos un protocolo detallado en la proyección de imagen de SpeRe en una rebanada del cerebro fija, que puede realizarse en un microscopio hiperespectral comercial (véase Tabla de materiales). Así, el protocolo puede ser completado por experimentadores sin conocimientos en instrumentación óptica. También cubrimos los posibles problemas y solución de problemas para la adquisición y análisis de datos SpeRe.

<table><tbody><tr><td>Cortador de vidrio</td><td>:</td><td></td> <td>se puede comprar en una tienda de conveniencia local o en tiendas en línea.</td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>:</td><td></td> <td>se puede comprar en una tienda de conveniencia local o en tiendas en línea.</td></tr><tr><td>Objetivo apocromático 40 veces, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Tipo de inmersión</td></tr><tr><td>en agua Verde de fluoromielina</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternativamente, se puede utilizar rojo de fluoromielina (F34652).</td></tr><tr><td>Microscopio Leica SP8 TCS</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Consulte la sección "Configuración del microscopio" en la introducción para obtener más información.</td></tr><tr><td>Software de imagen</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X-Matlab</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Recubierto con plata protegida.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136-Paraformaldehído</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v en PBS</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Grosor: #1 (0,13 a 0,17 mm)</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Grosor: ~1 mm</td></tr><tr><td>Superpegamento</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Utilice un equipo dispensador para evitar el contacto con la piel o los ojos.</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Brainetree</td><td>Scientific BS-8000 DUAL-Vibratome</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Leica Biosystems</td> <td>VT1200S-Láser</td><td></td></tr> <tr><td>de luz blanca</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 fue descontinuada y reemplazada por EXU-6.</td></tr></tbody></table>

microscopía espectral reflectométrico en axones mielinizados en situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

En un mamífero sistema nervioso, mielina proporciona un aislamiento eléctrico enwrapping las fibras del axón en una espiral de varias capas. Inspirado por su arquitectura subcelular altamente organizado, recientemente desarrollamos una nueva modalidad de imágenes, llamada reflectometría espectral (SpeRe), que permite la proyección de imagen de nanoescala etiqueta-libre sin precedentes de los axones myelinated vivo in situ. El principio subyacente es obtener información nano-estructural analizando el espectro de reflectancia de la estructura subcelular de varias capas. En este artículo se describe un protocolo detallado paso a paso para realizar una básica SpeRe la proyección de imagen de los tejidos nerviosos mediante un sistema microscopio confocal comercial, equipado con un láser de luz blanca y un filtro sintonizable. Cubrimos los procedimientos de preparación de muestras, adquisición de datos espectrales y procesamiento de imagen para obtener información de nano-estructural.

Según el protocolo, un trozo de cerebro fija fue preparado con coloración exógena, un fluoróforo dirigidos a la mielina (véase Tabla de materiales). SpeRe la proyección de imagen se realizó en el segmento del cerebro con un microscopio confocal comercial hiperespectral en conjunto (figura 4a) la proyección de imagen confocal de la fluorescencia. SpeRe, entrada intensidad óptica fue establecido como 5 μW/μm2 con un tiempo de permane...

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso de axones myelinated en un trozo de cerebro fija usando una nanoescala libre etiqueta técnica basado en reflectometría spectral de la proyección de imagen de la proyección de imagen.

Microscopía espectral reflectométrico en axones mielinizados en Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mielina, como la plasticidad de la mielina y la desmielinización. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la nanoestructura del axón mielinizado en tejido cerebral intacto sin necesidad de un marcaje complejo ni de una preparación de la muestra. Aquí, demostraremos la aplicación en un corte de cerebro, pero esta técnica se puede extender a animales vivos.Después de fijar y cortar el tejido cerebral del ratón de acuerdo con el protocolo de texto, prepare un portaobjetos de vidrio y dos cubreobjetos para cada corte de tejido. Use un cortador de vidrio para cortar uno de los cubrevasos cuadrados por la mitad. Luego, crea un espaciador usando superpegamento para unir las dos piezas en el portaobjetos de vidrio.Con un cepillo o una pipeta, extraiga una rodaja de cerebro y coloque el tejido en un portaobjetos de vidrio entre el espaciador, teniendo cuidado de no doblar el tejido. Dispensar 100 microlitros de PBS en la superficie del tejido. A continuación, coloque el segundo cubreobjetos cuadrado en la parte superior del pañuelo evitando la introducción de burbujas de aire.Use esmalte de uñas para sellar alrededor de la cubierta de vidrio para evitar la evaporación de PBS y la contaminación por polvo durante la sesión de imágenes posterior. Al menos una hora antes de la toma de imágenes, encienda el microscopio para permitir la estabilización térmica de la fuente láser. A continuación, encienda el software para el escaneo espectral y haga clic en el botón Adquirir en la parte superior de la GUI.Encienda el obturador de software para el láser de luz blanca y el tubo fotomultiplicador. En el modo de adquisición, seleccione el modo lambda XY en la lista desplegable. A continuación, el modo de entrada del láser cambia automáticamente de porcentaje constante a potencia constante.En Excitación lambda, configuración de escaneo lambda, desmarque la casilla de movimiento SP automático y establezca la ventana espectral para el láser de entrada en 470 a 670 nanómetros y el tamaño del paso espectral en cuatro nanómetros. Establezca el rango espectral de PMT en 450 a 690 nanómetros haciendo doble clic o moviendo la barra de ajuste para el rango espectral. Seleccione una lente de objetivo de inmersión en agua adecuada con una apertura numérica alta.Dé cualquier valor al PMT y a la potencia del láser para activar la configuración de AOBS y el botón de escaneo en vivo. En la configuración de AOBS, cambie a la ruta óptica comprobando la reflexión. A continuación, monte un espejo de referencia en la platina del microscopio con la superficie orientada hacia la lente del objetivo.Si no es fácil colocar el espejo en la platina del microscopio, adhiera un espejo a la placa plana. Ajuste la platina del microscopio para alinear el plano focal con la superficie del espejo. A continuación, ajuste la ganancia PMT y la potencia del láser, teniendo en cuenta el rango dinámico del detector.Bajo un pseudocolor, compruebe que no haya saturación en todo el rango de longitudes de onda. Si se observa saturación, baje la potencia del láser. A continuación, ejecute la adquisición del análisis lambda.Retire el espejo del escenario y repita la misma adquisición sin muestra para obtener la referencia oscura. A continuación, guarde los datos en un formato TIF de varias pilas. Para llevar a cabo la adquisición de imágenes SpeRe, coloque el tejido montado en la platina del microscopio.Para alinear aproximadamente el tejido con el plano focal de la lente del objetivo, a través de un ocular, use el modo de fluorescencia de campo amplio. Con la exploración en vivo activada, controle la platina del microscopio para alinear el plano focal con la región de interés en el tejido. Para evitar el ruido de fondo del cubreobjetos, seleccione una región objetivo de al menos 15 micrómetros de profundidad desde la interfaz de tejido de vidrio.Adquiera la pila de imágenes espectrales para la región de destino utilizando el mismo procedimiento que se demostró anteriormente en este vídeo. A continuación, guarde los datos para el tejido y el desplazamiento oscuro en formato TIF de varios pilas. Para procesar las imágenes en ImageJ, abra los datos espectrales del espejo de referencia y el tejido cerebral.Seleccione los ROI para las pilas de imágenes abiertas, el área central para el espejo de referencia y el segmento de una fibra axónica para el tejido cerebral. A continuación, ejecute la imagen, apile y trace el perfil del eje Z para adquirir los espectros brutos de las ROI seleccionados. Las fibras axónicas pueden ser estructuralmente heterogéneas a lo largo de sus longitudes, por lo tanto, se recomienda seleccionar el ROI en un segmento de axón pequeño, generalmente menos de cinco micrómetros, para minimizar los artefactos de volumen parcial.Abra los datos de desplazamiento oscuro, uno tomado para el espejo de referencia y el otro para el tejido cerebral, y trace el perfil del eje Z como se acaba de demostrar. A continuación, utilice las opciones de copiar y pegar para guardar todas las opciones adquiridas. Para llevar a cabo la corrección de la línea de base y el análisis de la señal SpeRe, reste los espectros de desplazamiento de los espectros del espejo de referencia y de los tejidos cerebrales.Normalice cada espectro dividiendo la intensidad máxima del espectro. Ingrese el número de onda tomando el recíproco de la longitud de onda utilizada en el experimento, normalice el espectro del axón dividiendo el del espejo de referencia y reste el desplazamiento de CC del espectro normalizado. Y luego obtener la frecuencia del número de onda ajustando el espectro adquirido a una sinusoide.Convierta la frecuencia del número de onda adquirida en periodicidad tomando el recíproco y convierta la periodicidad del número de onda en el diámetro del axón usando la ecuación que se muestra aquí. En este experimento, los cortes fijos de cerebro se tiñeron con fluorescencia contra la mielina y las imágenes SpeRe se llevaron a cabo con una dosis de luz un orden de magnitud menor que la microscopía confocal de fluorescencia convencional. La señal SpeRe se localizó a lo largo del centro de los axones mielinizados, como se esperaba por la geometría de la reflexión óptica.A partir del espectro reflectante de un segmento axónico, se obtuvo la periodicidad del número de onda, que posteriormente se convirtió en diámetro del axón. Este gráfico ilustra un perfil transversal de la intensidad de fluorescencia de la región en caja aquí, y se encontró que el diámetro medido por SpeRe estaba en buena concordancia con la medición basada en fluorescencia. La imagen SpeRe se basa en la reflexión óptica.Por lo tanto, un cubreobjetos a base de sílice puede introducir un ruido de fondo significativo. En la configuración óptica, el ruido de fondo era considerable cuando la profundidad de imagen del cubreobjetos era inferior a cinco micrómetros, pero se evitaba cuando la profundidad de imagen era superior a 15 micrómetros. El paso de calibración no es necesario para todos los experimentos, pero se recomienda al menos una vez a la semana.Una vez completada la calibración, el procedimiento de obtención de imágenes puede finalizar, por lo general, en 20 segundos para cada campo de visión. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tener en cuenta la latencia dinámica del detector para el escaneo de espectros completos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener la nanoestructura de axones mielinizados utilizando imágenes de reflectancia.

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Una técnica de imagen para el monitoreo de los cambios de potencial de membrana con una resolución temporal sub-micrométrico espacial y sub-milisegundos es descrito. La técnica, basado en una excitación láser de colorantes sensibles a voltaje, permite realizar mediciones de señales en los axones y colaterales axónicas, ramas terminales individuales dendríticas, y las espinas dendríticas.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Fuente: Kwon, J., et al., Microscopía reflectométrica espectral in situ sobre axones mielinizados.  J. Vis. Exp. (2018) Este video demuestra el uso de la reflectometría espectral con un microscopio confocal hiperespectral para analizar patrones de interferencia y determinar diámetros de axones mielinizados en cortes fijos de tejido cerebral.

Uso de reflectometría espectral para determinar los diámetros de los axones mielinizados en un corte fijo de cerebro de ratón

Fuente: McCullagh, E. A., et al. Aplicación coherente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para obtener imágenes de mielinización en cortes cerebrales. J. Vis. Exp. (2022)El video demuestra imágenes de fluorescencia y espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS) para visualizar la arquitectura neuronal en el tejido cerebral de los roedores. La tinción de Nissl marca los cuerpos celulares uniéndose al ARN ribosómico, mientras que las imágenes de CARS se dirigen a la mielina rica en...

Espectroscopia Raman anti-Stokes coherente para visualizar neuronas mielinizadas en tejido cerebral de ratón

Cuatro dimensiones (4D) de formación de imágenes se utiliza para estudiar el comportamiento y las interacciones entre los dos tipos de endosomas en los terminales nerviosos de vertebrados vivían. Movimiento de estas pequeñas estructuras se caracteriza en tres dimensiones, permitiendo la confirmación de eventos tales como la fusión endosoma y la exocitosis.

Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Presentamos un protocolo que utiliza microscopía de lapso de tiempo de excitación de dos fotones para visualizar simultáneamente la dinámica de las lesiones de axones y mielinas en tiempo real. Este protocolo propuesto permite estudiar los factores intrínsecos y extrínsecos que pueden influir en el destino de los axones mielinizados centrales después de una lesión y contribuir a la discapacidad clínica permanente.

Una Ex Vivo Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Aquí, describimos un protocolo para la visualización de proyección de la neurona de motor y arborización de axon en embriones de ratón Hb9::GFP transgénicos. Después de inmunotinción para las neuronas motoras, se utilizó microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación a los embriones de la imagen para el posterior análisis cuantitativo. Este protocolo es aplicable a otros procesos de navegación de la neurona en el sistema nervioso central.

Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

Aquí presentamos un protocolo para la combinación de dos técnicas de procesamiento de muestra, alta presión de congelación y procesamiento de las muestras asistida por microondas, seguido por la resina mínima inclusión para la adquisición de datos con un ion enfocado viga microscopio electrónico (FIB-SEM). Así lo demuestran con una muestra de nervio tibial de ratón y elegans de Caenorhabditis.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

Aquí presentamos un método para preparar organotypic culturas rebanada de cerebelo de ratón y la vaina de mielina de tinción por inmunohistoquímica adecuado para investigar mecanismos de myelination y remielinización en el sistema nervioso central.

Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de biomoléculas en función de su vibración intrínseca de enlaces químicos específicos. En este protocolo, se describe la configuración instrumental de un SRS integrado y un microscopio de fluorescencia de dos fotones para visualizar las estructuras celulares en la médula espinal de ratones vivos.

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Visualizar la mielinización es un objetivo importante para muchos investigadores que estudian el sistema nervioso. CARS es una técnica que es compatible con la inmunofluorescencia que puede obtener imágenes nativas de lípidos dentro de tejidos como el cerebro que iluminan estructuras especializadas como la mielina.

Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como modelo animal de esclerosis múltiple. En este artículo se describe un enfoque para la puntuación de la inflamación, desmielinización y lesión axonal de la médula espinal en EAE. Además, se presenta un método para cuantificar los niveles de luz de neurofilamentos solubles en el suero de ratones, lo que facilita la evaluación de la lesión axonal en ratones vivos.

Puntuación de la inflamación del sistema nervioso central, la desmielinización y la lesión axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental

Aprende a realizar microscopía espectral reflectométrica para analizar axones mielinizados en tejido nervioso intacto sin marcadores. Esta técnica permite obtener información nanométrica de la mielina con dosis de luz menores que la microscopía confocal convencional.

Microscopía espectral reflectométrico en axones mielinizados en Situ

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