Microscopía espectral reflectométrico en axones mielinizados en Situ

Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mielina, como la plasticidad de la mielina y la desmielinización. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la nanoestructura del axón mielinizado en tejido cerebral intacto sin necesidad de un marcaje complejo ni de una preparación de la muestra. Aquí, demostraremos la aplicación en un corte de cerebro, pero esta técnica se puede extender a animales vivos.

Después de fijar y cortar el tejido cerebral del ratón de acuerdo con el protocolo de texto, prepare un portaobjetos de vidrio y dos cubreobjetos para cada corte de tejido. Use un cortador de vidrio para cortar uno de los cubrevasos cuadrados por la mitad. Luego, crea un espaciador usando superpegamento para unir las dos piezas en el portaobjetos de vidrio.

Con un cepillo o una pipeta, extraiga una rodaja de cerebro y coloque el tejido en un portaobjetos de vidrio entre el espaciador, teniendo cuidado de no doblar el tejido. Dispensar 100 microlitros de PBS en la superficie del tejido. A continuación, coloque el segundo cubreobjetos cuadrado en la parte superior del pañuelo evitando la introducción de burbujas de aire.

Use esmalte de uñas para sellar alrededor de la cubierta de vidrio para evitar la evaporación de PBS y la contaminación por polvo durante la sesión de imágenes posterior. Al menos una hora antes de la toma de imágenes, encienda el microscopio para permitir la estabilización térmica de la fuente láser. A continuación, encienda el software para el escaneo espectral y haga clic en el botón Adquirir en la parte superior de la GUI.

Encienda el obturador de software para el láser de luz blanca y el tubo fotomultiplicador. En el modo de adquisición, seleccione el modo lambda XY en la lista desplegable. A continuación, el modo de entrada del láser cambia automáticamente de porcentaje constante a potencia constante.

En Excitación lambda, configuración de escaneo lambda, desmarque la casilla de movimiento SP automático y establezca la ventana espectral para el láser de entrada en 470 a 670 nanómetros y el tamaño del paso espectral en cuatro nanómetros. Establezca el rango espectral de PMT en 450 a 690 nanómetros haciendo doble clic o moviendo la barra de ajuste para el rango espectral. Seleccione una lente de objetivo de inmersión en agua adecuada con una apertura numérica alta.

Dé cualquier valor al PMT y a la potencia del láser para activar la configuración de AOBS y el botón de escaneo en vivo. En la configuración de AOBS, cambie a la ruta óptica comprobando la reflexión. A continuación, monte un espejo de referencia en la platina del microscopio con la superficie orientada hacia la lente del objetivo.

Si no es fácil colocar el espejo en la platina del microscopio, adhiera un espejo a la placa plana. Ajuste la platina del microscopio para alinear el plano focal con la superficie del espejo. A continuación, ajuste la ganancia PMT y la potencia del láser, teniendo en cuenta el rango dinámico del detector.

Bajo un pseudocolor, compruebe que no haya saturación en todo el rango de longitudes de onda. Si se observa saturación, baje la potencia del láser. A continuación, ejecute la adquisición del análisis lambda.

Retire el espejo del escenario y repita la misma adquisición sin muestra para obtener la referencia oscura. A continuación, guarde los datos en un formato TIF de varias pilas. Para llevar a cabo la adquisición de imágenes SpeRe, coloque el tejido montado en la platina del microscopio.

Para alinear aproximadamente el tejido con el plano focal de la lente del objetivo, a través de un ocular, use el modo de fluorescencia de campo amplio. Con la exploración en vivo activada, controle la platina del microscopio para alinear el plano focal con la región de interés en el tejido. Para evitar el ruido de fondo del cubreobjetos, seleccione una región objetivo de al menos 15 micrómetros de profundidad desde la interfaz de tejido de vidrio.

Adquiera la pila de imágenes espectrales para la región de destino utilizando el mismo procedimiento que se demostró anteriormente en este vídeo. A continuación, guarde los datos para el tejido y el desplazamiento oscuro en formato TIF de varios pilas. Para procesar las imágenes en ImageJ, abra los datos espectrales del espejo de referencia y el tejido cerebral.

Seleccione los ROI para las pilas de imágenes abiertas, el área central para el espejo de referencia y el segmento de una fibra axónica para el tejido cerebral. A continuación, ejecute la imagen, apile y trace el perfil del eje Z para adquirir los espectros brutos de las ROI seleccionados. Las fibras axónicas pueden ser estructuralmente heterogéneas a lo largo de sus longitudes, por lo tanto, se recomienda seleccionar el ROI en un segmento de axón pequeño, generalmente menos de cinco micrómetros, para minimizar los artefactos de volumen parcial.

Abra los datos de desplazamiento oscuro, uno tomado para el espejo de referencia y el otro para el tejido cerebral, y trace el perfil del eje Z como se acaba de demostrar. A continuación, utilice las opciones de copiar y pegar para guardar todas las opciones adquiridas. Para llevar a cabo la corrección de la línea de base y el análisis de la señal SpeRe, reste los espectros de desplazamiento de los espectros del espejo de referencia y de los tejidos cerebrales.

Normalice cada espectro dividiendo la intensidad máxima del espectro. Ingrese el número de onda tomando el recíproco de la longitud de onda utilizada en el experimento, normalice el espectro del axón dividiendo el del espejo de referencia y reste el desplazamiento de CC del espectro normalizado. Y luego obtener la frecuencia del número de onda ajustando el espectro adquirido a una sinusoide.

Convierta la frecuencia del número de onda adquirida en periodicidad tomando el recíproco y convierta la periodicidad del número de onda en el diámetro del axón usando la ecuación que se muestra aquí. En este experimento, los cortes fijos de cerebro se tiñeron con fluorescencia contra la mielina y las imágenes SpeRe se llevaron a cabo con una dosis de luz un orden de magnitud menor que la microscopía confocal de fluorescencia convencional. La señal SpeRe se localizó a lo largo del centro de los axones mielinizados, como se esperaba por la geometría de la reflexión óptica.

A partir del espectro reflectante de un segmento axónico, se obtuvo la periodicidad del número de onda, que posteriormente se convirtió en diámetro del axón. Este gráfico ilustra un perfil transversal de la intensidad de fluorescencia de la región en caja aquí, y se encontró que el diámetro medido por SpeRe estaba en buena concordancia con la medición basada en fluorescencia. La imagen SpeRe se basa en la reflexión óptica.

Por lo tanto, un cubreobjetos a base de sílice puede introducir un ruido de fondo significativo. En la configuración óptica, el ruido de fondo era considerable cuando la profundidad de imagen del cubreobjetos era inferior a cinco micrómetros, pero se evitaba cuando la profundidad de imagen era superior a 15 micrómetros. El paso de calibración no es necesario para todos los experimentos, pero se recomienda al menos una vez a la semana.

Una vez completada la calibración, el procedimiento de obtención de imágenes puede finalizar, por lo general, en 20 segundos para cada campo de visión. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tener en cuenta la latencia dinámica del detector para el escaneo de espectros completos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener la nanoestructura de axones mielinizados utilizando imágenes de reflectancia.