Name: Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprende espectrometría de masas nativa para analizar complejos proteicos y su estabilidad en biología estructural. Este método permite estudiar interacciones proteína-ligando con alta sensibilidad y resolución.

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Nos gustaría agradecer a Peter Karl Hopfner y Robert Thomas Byrne por favor muestras de proteínas proporciona HerA y HerA-NurA y por su ayuda con el diseño experimental. También agradecemos a Dr. Eamonn Reading por su revisión del manuscrito. Agradecemos a nuestros organismos: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] y sociedad real [RG150216 a A.P.].

No hay conflicto de interés declarado.

MS está jugando un papel cada vez más importante en la caracterización de la estequiometría, la interacción y arquitectura de subunidades de complejos de la proteína. IM-MS datos pueden usarse para definir arreglos topológicos de subunidades dentro de complejos de múltiples componentes. En comparación con otros métodos existentes de la biología estructural, MS tiene varias ventajas. Nativa es una técnica altamente sensible y rápida y puede usarse para muestras de proteína heterogénea. Cuando se combina con experimentos en la solución de interrupción, caminos de la disociación de los conjuntos de proteínas pueden controlarse. Junto con las estructuras cristalinas o modelos de la homología, la información ofrecida por MS estructural ofrece una herramienta para la investigación de las interacciones proteína-ligando y proporcionar modelos de materno y Asamblea vías11.
Aquí, describimos los procedimientos experimentales necesarios para analizar la estequiometría y la composición de las interacciones proteína-ligando, con uno o más ligandos, utilizando MS integradora. Esto incluye la preparación de la muestra MS, adquisición de datos, análisis de datos y la integración de datos de MS usando herramientas computacionales. Para ello, se utilizó el ADN-resección HerA-NurA hetero-oligoméricos complejo de la proteína, limitado a tres ligands (ADN, ATP y ADP), como nuestro sistema modelo. El protocolo muestra el uso de lo software disponible actualmente para facilitar la presentación y análisis de datos.
Adquisición de espectros de alta calidad es importante para el análisis de unión de ligando, por lo tanto, muestra cuidado crítico, incluyendo purificación de proteínas, valoración de ligando y cambio de buffer. Una limitación de nESI MS nativa al estudiar ligando es fijación no específica. Unión no específica ocurre durante desolvation gota durante todo el proceso electrospray. Esto aumenta las concentraciones de ligando y por lo tanto altera el cociente proteína/ligando del29. La Unión de nucleótidos se traduce en una relativamente pequeña masa diferencia apo proteína nucleótido-limite que no altera la eficiencia de ionización50,51.
Utilizamos el sistema Synapt G2-Si MS para nuestro trabajo, pero los protocolos son aplicables para diversas investigaciones de otros complejos de proteína-ligando usando otros espectrómetros de masas de nano-electrospray comercialmente disponibles. Integrante MS estructural cada vez más está jugando un papel importante en el tratamiento de problemas biológicos de mayor complejidad. El flujo de trabajo y técnicas que se describen aquí son adecuadas para entender las consecuencias estructurales y construcción de mecanismos de formación de proteína-ligando y complejo de la proteína que de lo contrario son difíciles de estudiar con las técnicas estructurales convencionales .

Análisis de espectrometría de masas nativas de proteínas intactas y sus complejos se lleva a cabo mediante electrospray y nano-electrospray ionización (nESI), que preservan el plegamiento de la proteína y las interacciones no-covalentes durante el proceso de ionización1, 2. En MS nativa, la estructura de las proteínas y sus complejos son retenidos en un estado casi nativo en la fase de gas de3,4. MS nativa detecta múltiples iones de proteínas cargadas, separadas según su masa para cargar cociente (m/z) permitiendo que la masa de la proteína o proteína-ligando compleja de calcular. Esta información permite la determinación de la estequiometría de la proteína intacta, composición de la subunidad, ligando e interacción redes3,4,5,6. MS nativa tiene varias ventajas en comparación con otras técnicas tales Cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear espectroscopia5. En primer lugar, nativa MS es una técnica rápida y muy sensible, que requiere sólo unos pocos microlitros (μL de 2-3) de muestra a relativamente bajas concentraciones complejo finales nm alta baja μm Rango6. En segundo lugar, puede utilizarse MS nativa para interrogar las muestras de proteína heterogénea lo que es posible analizar las proteínas y los Estados múltiples simultáneamente. En tercer lugar, MS nativa no requiere muestras de proteína a ser modificados antes del análisis por reticulación química o proteína etiquetado. Estas ventajas han hecho MS estructural una poderosa herramienta para la investigación estructural de complejos de la proteína.
MS nativa puede combinarse con movilidad de iones (IM), una técnica que mide el tiempo que un ion de proteína lleva a viajar a través de un campo eléctrico, que permite la sección colisión (CCS) a determinar. El CCS informa baja resolución estructural, que permite topología e información heterogeneidad conformacional de las proteínas para obtener. Además, permite el examen de modelos estructurales de la proteína generada por métodos computacionales.
Estabilidad de la proteína en fase gaseosa puede ser investigado utilizando colisión inducida por despliegue (CIU) medido IM-MS. Durante el proceso CIU, los iones de proteínas son acelerados y activados a través del aumento aceleradoras colisiones con un gas buffer inerte dentro de un espectrómetro de masas7,8,9. Este proceso de activación colisión causa la proteína revelar parcialmente, que se traduce en un aumento en CCS. Este cambio en CCS y la energía necesaria para desdoblar la proteína puede ser medida IM-Sra. usando este enfoque, el efecto del ligando en la estabilidad de la proteína puede ser medido10. Subcomplejos de mando pueden ser generadas en solución utilizando métodos de interrupción en solución tales como la adición de solventes orgánicos para monitor nativo topologías de complejos de la proteína. Perturbación de los complejos de la proteína es principalmente debido a la interrupción de interacciones no-covalentes intra. Los complejos secundarios mantienen nativo topologías y, tras la detección de la MS, revelan información sobre inter-subunidad conectividad.
Enfoques integrales en biología estructural combinan diversos métodos para estudiar la estructura y dinámica de las proteínas y sus complejos3,4,5,6. Nativo MS y IM-MS se han utilizado para descubrir los detalles moleculares de sistemas biológicos desafiantes. Ha habido varios ejemplos de aplicaciones, incluyendo el estudio de la proteína Asamblea vías11,12,13,14, estudio de redes de interacción proteína-proteína15 , 16 , 17, membrana proteínas6,18,19,20,21y las interacciones proteína-ligando como ácidos nucleicos22,23 ,24.
Sin embargo, MS nativa también tiene sus limitaciones. Medidas MS nativas se realizan a menudo en tampones volátiles como el acetato de amonio acuoso en el que algunas proteínas no conservará su estado nativo doblado3,25. Sin embargo, trabajos recientes han demostrado que esta limitación puede ser superada por la optimización de la rociadura diámetro de punta de aguja (puntas de 0,5 mm) que proteínas e iones complejos de proteína se pueden formar directamente de búferes no volátil con alta fuerza iónica que mejor imitar el entorno fisiológico26. Además, MS nativa utiliza electrospray para ionizar y transferir conjuntos no covalentes de solución a la fase gas; por lo tanto, la abundancia relativa de complejos detectados puede no totalmente representar en la solución5,27. Además, en comparación a en solución, las interacciones hidrofóbicas de la fase de gas se vuelven más débiles e interacciones electrostáticas se vuelven más fuertes y por lo tanto favorecieron3,28.
En este artículo, ofrecemos protocolos, análisis de datos e interpretación para la identificación de la proteína y ligando vinculante utilizando MS nativa, IM-MS, CIU, en la solución de interrupción y la modelización. El complejo de reparación del ADN, HerA-NurA, es utilizado como sistema modelo. Roturas de doble hebra de DNA (distritales) son una de las formas más citotóxicas y deletéreas de daño de la DNA, dando por resultado inestabilidad genética y el eventual desarrollo de cáncer en seres humanos. Recombinación homóloga es el mecanismo de reparación que erradica distritales, un proceso que está orquestado por el complejo, de HerA-NurA ATP dependiente helicase-nucleasa22.
Combina nativas MS y IM-MS con el análisis funcionales y modelado permitieron la investigación de: i) el papel de NurA en la Asamblea, la conformación y la estabilidad del complejo, ii) la interacción entre dsDNA y el complejo y su influencia en la general estabilidad del complejo y iii) la estequiometría y el impacto de ATP binding en el montaje de22. En general, este trabajo condujo a una mejor comprensión de la base molecular del complejo de HerA-NurA uniendo los complejos cambios conformacionales de la proteína y estabilidad con enlace nucleótido. Este protocolo es genérico para cualquier complex(es) de la proteína que interactúa con uno o varios tipos de ligand(s).

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5&prime;-(3-tiotrifosfato) sal de tetralitio</td><td>Merck Millipore</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-difosfato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>Solución de acetato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Columnas de cromatografía</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin</td><td>Concentrador Sartorius</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Water TraceSelect</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de borosilicato</td><td>Harvard Aparato</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Las proteínas son una clase importante de biológicas macromoléculas que desempeñan muchas funciones clave en las funciones celulares, incluyendo genes, catalizar reacciones metabólicas, replicación y reparación del ADN. Por lo tanto, una comprensión detallada de estos procesos proporciona información crítica sobre cómo las células de función. Integradora estructural MS métodos ofrecen información estructural y dinámica en conjunto complejo de proteínas, conectividad compleja, estequiometría de subunidad, Oligomerización de proteínas y ligando. Avances recientes en integrante MS estructurales han permitido la caracterización de los sistemas biológicos difíciles incluyendo grandes proteínas de unión de ADN y proteínas de membrana. Este protocolo describe cómo integrar diversos datos de la MS como MS nativa y ion movilidad-espectrometría de masas (IM-MS) con simulaciones de dinámica molecular para ganar penetraciones en una DNA helicase-nucleasa reparación del complejo de la proteína. El enfoque resultante proporciona un marco para estudios detallados de ligando a otros complejos proteicos implicados en procesos biológicos importantes.

Nativo MS de resultados revelaron el estado oligomérico, composición y topología del HerA-NurA complejo (figura 1). Como las interacciones no covalentes se conservan en la fase gaseosa, MS nativa de experimentos de valoraciones de ADP y ATP-γ-S determina la Unión de nucleótidos pares a HerA-NurA (figura 2) y aumentando la concentración de ATP-γ-S aumenta el pariente intensidad del hexámero HerA (figura 3). Con respecto a las interacciones de la subunidad se obtuvieron de la interrupción de la solución en seguida MS nativa y estaban de acuerdo con la información estructural y masas teóricas (figura 4 y tabla 1).
Los valores experimentales de CCS de las proteínas y sus complejos se derivan de experimentos IM-MS (figura 5). Estos valores son promedio rotatorio de fase de gas transversales cálculos de la forma molecular y describen el estado tridimensional de la proteína. Se comparan valores de CCS a las mediciones teóricas de Cristalografía de rayos x y un buen acuerdo se deduce que la forma nativa de retenido en la fase gaseosa (tabla 1). Esto valida utilizando valores de CCS para la construcción de modelos de baja resolución de la Asamblea de proteína48.
CCSs experimentales pueden calcularse para cada ión de estado de carga. Un conformer nativo-como la proteína puede dar lugar a iones de estado de carga con valores similares de CCS. Sin embargo, más iones de estado de carga aumentaron repulsiones coulombic que pueden llevar a fase gaseosa despliegue y más grandes CCS valores de proteína comparados con la CCSs teórica. El valor de CCS del más bajo estado de carga los iones suelen ser por lo tanto usa49. Para HerA-NurA, experimentos en la solución de interrupción sobre HerA y HerA-NurA con y sin ADN impulsó la generación de un camino conjunto a partir de monómeros y luego formando el hexámero todo HerA (HerA6)-complejo dimérico de NurA (anexo2) ADN (figura 6).
Diferencias en las parcelas que CIU entre la apo (ligand-libre) y el ligando enlazado definen el cambio en estabilidad compleja al atascamiento del ligand. Un CV más alto50 o KECOM valor implica un ión más estabilizado en la fase gaseosa. CIU y KECOM el análisis reveló que ADN enlazado HerA-NurA es más estable que el complejo de ADN libre (figura 7Aii). De análisis del CIU-MS en los respectivos Estados de unión a ATP, el estado consolidado de cuatro-ATP-γ-S reducida estabilidad compleja en la fase de gas y seis estado encuadernado -ATP-γ-S donde se ocupan todos los sitios fue la más estable (figura 7Bii). MS nativa puede revelar el nucleótido discreto enlace Estados de HerA; sin embargo, no puede distinguir qué subunidades de HerA son vinculantes ATP y donde realiza este enlace. Esta información se puede derivar de simulaciones solvente explícitos sobre el hexámero HerA y HerA-NurA siguiendo el flujo de trabajo resumido (figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> Figura 1. Interrogar el estado oligomérico, composición y topología del complejo no covalente HerA-NurA. (A) espectrométricos de HerA, NurA HerA y HerA-NurA en presencia de DNA (ADN de doble hebra 15,4 kDa 25 bp). El complejo sub HerA existe como un hexamer y un heptamer. NurA de dímero se une y un hexamer HerA imponer conversión oligomérica. El ADN une el complejo formado de HerA - NurA (adaptados de Ahdash Z. et al., 201722resultados). (B) intensidades relativas de las especies identificadas se calculan utilizando UniDec32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> Figura 2. ESI-MS nativo revela el mecanismo de unión de nucleótido a HerA-NurA. Espectros de masas (A) HerA-NurA y (B) ADN HerA-NurA con el aumento de las concentraciones de (i) ATP-γ-S y (ii) ADP. Medida masas se comparan masas teóricas y la cantidad de ATP-γ-S o ADP limitado se determinan. Medida masas y el número de nucleótidos enlazados aparecen en los espectros. Experimentos de titulaciones ATP-γ-S y ADP determinan la Unión de pares de nucleótidos a HerA-NurA solo y cuando en complejo con el ADN que indica un mecanismo de reacción cíclica (adaptados de Ahdash Z. et al., 201722resultados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> Figura 3. Medir el efecto de aumentar las concentraciones de ATP-γ-S en estado oligomérico de HerA. (A) espectrométricos de HerA en el aumento de las concentraciones de ATP-γ-S. (B) gráfico que muestra las intensidades relativas de diferentes especies de nativas MS calculada usando UniDec deconvolución software32. Como la concentración de ATP-γ-S aumenta, también aumenta la intensidad relativa del hexámero HerA. Número de moléculas de ATP-γ-S límite se muestra en los espectros (adaptados de Ahdash Z. et al., 201722resultados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> Figura 4. Masa de espectros y productos de la disociación del complejo de HerA (A) y (B) (i) HerA-NurA solo y en presencia del siguiente (ii) ADN de la solución en interrupción. Se realizaron experimentos de alteración en la solución con 10-40% de acetonitrilo, metanol (MeOH) o dimetilsulfóxido (DMSO) y dio lugar a la formación de varios Subcomplejos de mando. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> Figura 5. Ion movilidad llegada tiempo distribuciones que se muestra en un eje de CCS para complejos y complejos secundarios generados. Icono para cada sub-complejo correlato con los anotados en los espectros en la figura 4. Experimentales y calculadas las masas y valores de CCS de los complejos aparecen en la tabla 1 los cuales mostraron un acuerdo entre los valores experimentales y calculados (después de considerar la incertidumbre típica en la resolución de viajar ion de onda masa espectrometría de movilidad de ± 5 - 8%37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> Figura 6. Camino de montaje del complejo de HerA-NurA generado a partir de la interrupción de la solución en círculos nativos de MS y IM-Sra. color indican condiciones donde cada sub complejo observó: nativo (verde, antes de la interrupción), metanol (amarillo), DMSO (púrpura) o Acetonitrilo (rojo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> Figura 7. Investigando el efecto estabilizador del (A) ADN en HerA-NurA y (B) ATP binding a HerA-NurA-DNA. (i) parcelas fase gas CIU-MS y el cálculo de energías (KEcom) colisión (ii) centro de masa muestran que la presencia de dsDNA estabiliza el complejo de HerA-NurA y que el ATP-γ-S 6 había limitado estado es la más estable. Estabilización de Estados de carga distintos se muestra. Parcelas fueron generadas usando PULSAR 33. Resultados de la (A) adaptados de Ahdash Z. et al., 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> Figura 8. Flujo de trabajo para los procedimientos de modelado para simulaciones de dinámica molecular diferenciada. (A) generar el complejo objeto de investigación mediante la construcción de la topología de existentes subunidades y la reconstrucción de restos desaparecidos. (B) flujo de trabajo para la ejecución de simulaciones de dinámica molecular en el complejo con y sin ligando de la proteína. Simulaciones de dinámica molecular funcionó para la proteína sólo que actúa como referencia y que se resta de la simulación de proteína y de ligando. Esto es seguido por calcular la fluctuación diferencial cuadrático (RMSF) entre las simulaciones y determinar el efecto del ligando. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Complejos / el complejo</td>
			<td>Masa teórica (kDa)</td>
			<td>Masa experimental (kDa)</td>
			<td>Teórico CCS (Å2)</td>
			<td>Experimental CCS (Å2) [cargo]</td>
			<td>Condición de HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- anexo2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>EFE, 10-40% de DMSO, de 10-20% 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- anexo2- dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [+ 39] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>ACN de 10%, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anexo1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anexo2
</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78,36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [+ 17] 4537 [18 +] 4666 [+ 19]</td>
			<td>10-40% MeOH, 20-40% de DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [+ 14] 3792 [15 años] 3950 [16 +]</td>
			<td>10-40% ACN, DMSO 40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [+ 22] 5996 [23 +]</td>
			<td>Metanfetamina 40%, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 años] 7616 [26 +] 7717 [+ 27] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, CAN 10-40%, 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3 + ADN</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [+ 27] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4 + ADN</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>30-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [+ 39] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6 + ADN</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]</td>
			<td>30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7
</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7 + ADN</td>
			<td>409.8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]</td>
			<td>10% ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Experimentales y calculadas las masas y valores de CCS de HerA-NurA y sus sub-complejos generan estudios de interrupción de la solución en forma.

Espectrometría de masas (MS) se ha convertido en una herramienta importante para la investigación de la estructura y la dinámica de asambleas macromoleculares. Aquí, integramos los enfoques basados en la MS para interrogar la formación de complejos de proteína y de ligando.

Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Hoy en día la espectrometría de masas desempeña un papel importante en la biología estructural. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre macromoléculas biológicas importantes en su estado nativo, especialmente proteínas y complejos proteicos. La espectrometría de masas nativa es ampliamente aplicable a una variedad de conjuntos biomoleculares, incluyendo sistemas de multiproteína y ácido nucleico.La principal ventaja de esta técnica es que es rápida y altamente sensible. Se puede utilizar para interrogar muestras de proteínas heterogéneas, hacer posible analizar múltiples proteínas en estado oligomérico simultáneamente. Demostrando el procedimiento estará Andy Lau, un estudiante de doctorado en mi grupo.Para comenzar este procedimiento, prepare los capilares internos para la nanoelectrospray como se describe en el protocolo de texto. Preparar una muestra libre de ligandos como control para cada carrera como intercambio de búfer cada uno en acetato de amonio. A continuación, seleccione los modos TOF de sensibilidad, adquisición de iones positivos y movilidad.A continuación, active los gases de captura, API e IMS. Para la separación de mensajería instantánea, utilice los puntos de partida de nitrógeno y argón que se muestran aquí y ajuste según sea necesario. Establezca un rango de adquisición m/z adecuado.Para una proteína desconocida, los pasos de optimización inicial deben utilizar una amplia gama. Inserte el capilar recubierto de oro en un soporte capilar. A continuación, cargue entre dos y tres microlitros de la solución compleja proteica de interés en el capilar.Apriete suavemente el capilar y colóquelo en la etapa de la fuente de la electrospray. Deslice la etapa en su posición para empezar a adquirir datos. Aplique una presión de gas de nanoflujo bajo hasta que se forme una gota en la punta del capilar.Mueva el capilar con respecto al cono y monitoree la corriente iónica para lograr una corriente iónica estable. Aplicar una tensión capilar en el rango entre 0,9 y 1,6 kilovoltas. A continuación, establezca el cono de muestreo, el desplazamiento de origen, la temperatura de origen y el flujo de gas de cono como se describe en el protocolo de texto.Para adquirir un espectro de masa bien resuelto y una transmisión iónica maximizada, ajuste los parámetros de MS y supervise el cambio resultante en los espectros. Ajuste la energía de colisión de trampa a un punto de partida inicial entre 10 y 50 voltios. Si los desplazamientos de voltaje son insuficientes, ajuste las energías de colisión de trampa.Ajuste la trampa a través de su voltaje a un punto de partida inicial entre 20 y 45 voltios. Mejore la desolación optimizando este voltaje. Después de esto, optimice la velocidad de onda y la altura de onda como se describe en el texto para lograr la mejor separación de movilidad.Para estudios que involucran HerA y NurA, utilice una velocidad de onda de 40 metros por segundo y una altura de onda entre 550 y 650 voltios. Para el análisis de unión al ADN, mezcle la proteína y el ADN en una proporción molar que permita la formación compleja de ADN proteico. Agregue cantidades crecientes de cualquiera de los siguientes, 5'O-3-thio-trifosfato, sal de tetralitio o ADP.El uso de software adecuado mide las masas de las especies generadas e identifica la unión de ligandos, como los estados de unión y oligoméricos ATP y ADP. A continuación, utilice las intensidades iónicas observadas en los espectros de LA MS ESI en bruto para cuantificar la abundancia relativa de especies correspondiente. Después de optimizar las condiciones del instrumento para una transmisión estable, reduzca la energía colisional y el cono de muestreo lo más bajo posible, conservando al mismo tiempo una buena calidad de los espectros.Utilice la velocidad de onda y la altura de onda optimizadas previamente determinadas para adquirir IM MS. Mida el tiempo de deriva iónico a tres velocidades de onda diferentes mientras mantiene la misma altura de onda. Para determinar el CCS de iones de proteína medir cuatro calibradores de proteínas, dos con la masa por encima de la proteína bajo investigación y dos con la masa por debajo, utilizando las mismas condiciones de instrumentación. En primer lugar, preparar las muestras de proteínas y el tampón intercambiarlas en acetato de amonio como se describe en el protocolo de texto.Añadir disolvente en incrementos del 10% hasta alcanzar la cantidad deseada. Incubar sobre hielo durante una hora. Después de esto, adquiera un espectro IM-MS para cada muestra.Con el software SUMMIT, asigne subcomplejos proteicos y genere redes de interacción con proteínas. Alternativamente, generar manualmente una lista de masas teóricas para las especies esperadas. Para comenzar a investigar la estabilidad compleja de proteínas, registre los datos de IM-MS mientras aumenta el voltaje de aceleración de la trampa de 10 voltios a 200 voltios, que se desarrollará progresivamente a la fase de proteína y gas.Analice los datos utilizando el software adecuado y genere gráficas de desdoblamiento bidimensionales apilando las distribuciones de CCS normalizadas de intensidad en cada voltaje de aceleración para cada estado de carga. Los resultados nativos de la EM revelan el estado oligomérico, la composición y la topología del complejo HerA y NurA. A medida que las interacciones no covalentes se conservan en la fase gaseosa, la MS nativa de los experimentos de valoración ATP gamma S y ADP, se utiliza para determinar la unión de nucleótidos en pareja en el HerA y NurA.Los espectros de masa de los estados oligoméricos de HerA revelan que el aumento de la concentración de gamma S ATP aumenta la intensidad relativa de la HerA hexamérica. Los valores experimentales de CCS para las proteínas y sus complejos se derivan de los experimentos IM-MS. Se considera que estos valores tienen un buen acuerdo con las mediciones teóricas de la cristalografía de rayos X, que valida el uso de valores de CCS para la construcción de modelos de baja resolución de ensamblaje de proteínas.El análisis de CIU y KEcom revela que herA-NurA unido al ADN es más estable que el complejo libre de ADN. El análisis de MS de CIU y los respectivos estados de enlace ATP muestran que el estado enlazado a los cuatro modelos GAMMA S reduce la estabilidad compleja en la fase de gas. Sin embargo, el estado de seis ATP gamma S en el que todos los sitios están ocupados, se considera que es el más estable.Las mediciones precisas de la masa molecular de un complejo intacto proporcionan información valiosa sobre la caracterización biomolecular. Podemos obtener información sobre vías de montaje complejas, oligomerización de proteínas y unión de ligandos. La combinación de toda esta información permite generar modelos detallados de conjuntos biológicos funcionales.

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Investigación

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Química

Espectrometría de masas ha demostrado ser una valiosa herramienta para el análisis de grandes complejos de proteínas. Este método permite a los puntos de vista en la arquitectura de la composición, estequiometría y en general de las asambleas de múltiples subunidades. Aquí se describe, paso a paso, cómo realizar un análisis de espectrometría de masas estructurales, y caracterizar estructuras macromoleculares.

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

De movilidad de iones-espectrometría de masas es una emergente tecnología de fase gaseosa, que separa los iones, sobre la base de su colisión sección transversal y la masa. El método proporciona información en tres dimensiones de la topología general y la forma de complejos de proteínas. Aquí, se describe un procedimiento básico para elaborar un instrumento normativo y la optimización, la calibración de los tiempos de desplazamiento, y la interpretación de los datos.

De la onda T de movilidad de iones-espectrometría de masas: Basic Procedimientos experimentales para el análisis de proteínas complejas

Medición de la masa exacta representa un paso importante en la investigación de las proteínas. Matrix asistida por láser de desorción / ionización (MALDI) espectrometría de masas (MS) se puede utilizar para tal determinación y su ventaja fundamental es la tolerancia a las sales, detergentes y los contaminantes. Aquí se ilustra un enfoque accesible para el análisis de proteínas más grandes de 100 kDa por MALDI-MS.

Matrix asistida por láser de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas Análisis de las proteínas intactas de más de 100 kDa

Aquí, presentamos protocolos detallados para la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio amida de estado sólido (ssHDX-MS) y la espectrometría de masas de marcado fotolítico de estado sólido (ssPL-MS) para proteínas en polvos sólidos. Los métodos proporcionan información de alta resolución sobre la conformación de proteínas y las interacciones en el estado sólido amorfo, que puede ser útil en el diseño de formulaciones.

Espectrometría de masas enfoque para estudiar la estructura de la proteína y las interacciones en liofilizadas Polvos

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Aquí presentamos un protocolo para supervisar el montaje y desmontaje de la toxina del ántrax mediante interferometría de la biocapa (BLI). Tras el montaje y desmontaje en la superficie del biosensor, los complejos de proteínas grandes son liberados de la superficie para la visualización e identificación de componentes de los complejos usando microscopia electrónica y espectrometría de masas, respectivamente.

Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

Se describen los procedimientos experimentales para realizar el etiquetado covalente a base de dietilpirocarbonato con detección espectrométrica de masas. El dietilpirocarbonato simplemente se mezcla con la proteína o complejo proteico de interés, lo que lleva a la modificación de residuos de aminoácidos accesibles al disolvente. Los residuos modificados se pueden identificar después de la digestión proteolítica y la cromatografía líquida / análisis de espectrometría de masas.

Etiquetado Covalente Con Dietilpirocarbonato Para El Estudio De La Estructura De Orden Superior De Proteínas Por Espectrometría De Masas

Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN) y otras aplicaciones analíticas.

La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

Se determinó la estructura de la solución de RMN de un péptido modelo de metalochaperona con Cu (I), y se describe un protocolo detallado desde la preparación de la muestra y la recopilación de datos 1D y 2D hasta una estructura tridimensional.

Determinación de la estructura y coordinación de complejos péptido-metal mediante RMN 1D y 2D 1h

Aprende espectrometría de masas nativa para analizar complejos proteicos y su estabilidad en biología estructural. Este método permite estudiar interacciones proteína-ligando con alta sensibilidad y resolución.

Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo

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