Name: El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a medir la autofagia de secuestro masivo en células de mamíferos mediante el ensayo de secuestro de lactato deshidrogenasa. Este método cuantifica LDH endógeno sin necesidad de sondas artificiales.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por el Consejo de investigación de Noruega, la Universidad de Oslo, la Anders Jahre Foundation, la Fundación de Nansen y el legado en la memoria de Henrik Homan. Agradecemos a Dr. Noboru Mizushima para el ATG5 + / + MEFs y ATG5/MEFs, Dr. Masaaki Komatsu para la ATG7 + / + MEFs y ATG7/MEFs y Dr. Shizuo Akira para el ATG9A + / + MEFs y ATG9A/MEFs. Agradecemos Frank Sætre asistencia técnica, y el Dr. por Seglen O. constructivas discusiones metodológicas.

1. célula siembra y tratamiento
<ol><li>
Células adherentes en cultivo en frascos de cultivo de tejidos2 de 75 cm en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C, utilizando el medio de cultivo recomendado: para el tipo de célula en cuestión. Permitir a las células a crecer hasta llegar a una capa de la célula cerca del confluente. Nota: Use Medio RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS) de LNCaP, HEK293, fibroblastos embrionarios del ratón (MEFs), BJ, MCF-7 y las células RPE-1.<ol>
<li>Lavar las células con 3 mL 37 ° C con tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4. Sustituya el PBS por 3 mL 0.25% tripsina-ethylenediaminetetraacetate (EDTA) (w/v) e Incube el frasco en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C hasta que separe de las células (2-5 min).</li>
		<li>Resuspender las células separadas con 7 mL medio de cultivo que contiene 10% FBS. Mezclar una alícuota de 10 μl célula suspensión con 10 μl 0,4% azul de tripano en un tubo de microcentrífuga, utilizando una pipeta de 0.5-20 μl. Utilice la misma punta de pipeta para llenar inmediatamente una cuenta slide cámara y contar las células en un contador de células automatizado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar una adecuada dilución (ver nota abajo) de la suspensión de células de paso 1.1.2 con cultura media que contiene 10% FBS y las semillas 1 mL de la suspensión celular diluido en cada pocillo de una placa (superficie ~3.8 cm2) de 12-bien cultivo de tejidos utilizando aséptica técnica. Permitir el crecimiento en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C hasta alcanzar la densidad deseada de la célula, por ejemplo, 60 – 90% de confluencia en la cosecha. Nota: La dilución de la suspensión de células que dará la confluencia celular deseada en la cosecha varía de célula tipo tipo de la célula, así como según la duración y tipo de tratamientos experimentales. Por lo tanto, esto debe empíricamente evaluarse en cada caso.<ol>
<li>Para los experimentos que deben ser tratados y había cosechado 2 días después de siembra, semilla de 2.5 x 105 LNCaP, HEK293, o MCF-7 células, MEFs de4 5 x 10, 4 x 105 BJ o 1,5 x 105 1 RPE células en cada pocillo de la placa de la pozo 12.</li>
		<li>Para las células que se adhieren libremente, cubrir las placas con el tipo de recubrimiento recomendado para el tipo de la célula en cuestión. Para las células LNCaP (y HEK293) Utilice placas recubiertas con poly-D-lisina (PDL).</li>
		<li>Para ello, agregar 500 μl de PDL en 2,5 μg/mL en estéril de H2O para cada pozo e incubar las placas en un ambiente estéril durante 30 min a temperatura ambiente (20 – 25 ° C). Retire de la PDL con la succión y lave cada bien brevemente con 1 mL estéril H2O. Nota: Generalmente, se realiza paso 1.2.1 sin cualquier tratamiento experimental. Sin embargo, si realizar ARNi, puede ser conveniente comenzar una transfección inversa con la siembra9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realice tratamientos experimentales en los pocillos duplicados o triplicados por condición.
	<ol>
<li>Por ejemplo, tratar las células con 50 nM de la Torin1 del inhibidor de mTOR, que generalmente es un eficiente inductor del secuestro de autofagia, o someter las células a la inanición aguda de suero y aminoácidos por lavar las células con 1 mL de Earle del aminoácido libre de equilibrado Medio de solución (EBSS) la sal y posteriormente incubar las células en 1 mL de EBSS en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C.</li>
		<li>Deja un conjunto de pozos sin tratar para definir niveles de sedimentables LDH de fondo.</li>
		<li>Agregue una cantidad de saturación de la bafilomycin del inhibidor de la captura posterior A1 (Baf)3,13,16,18 en la ausencia o presencia de los tratamientos experimentales, 3 – 4 h antes de la célula de la cosecha. Incubar las células en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C.<ol>
<li>Uso 100 nM Baf de LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 y las células de RPE-1 y 10 nM Baf para MEFs.</li>
			<li>Para tratamientos experimentales que tienen una duración de sólo 3-4 h (como ésos paso ejemplificada en 1.3.1 típicamente), agregue Baf simultáneamente con los tratamientos. Para más tratamientos experimentales, esperar 3-4 h antes de la cosecha y añadir 2 μl de 500 x concentrado Baf stock directamente en el medio.</li>
			<li>Mezclar por agitación de la placa inmediatamente después de la adición de Baf. En este punto también es recomendable añadir inhibidores de la captación de macroautophagic como controles, por ejemplo, 10 mM de la pan-Fosfoinositol 3-quinasa (PI3K) inhibidor de la 3-metil adenina (3MA)19o 10 μm de la selectivo PI3K clase III inhibidor de la SAR-40520.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cosecha y preparación para la Electrodisruption de la célula
<ol><li>Al final del tratamiento, Aspire el medio con la succión y añadir solución de separación celular de μl 200 (precalentado a 37 ° C) a cada pocillo. Incubar a 37 ° C hasta que separe de las células (típicamente alrededor de 5 min). Nota: Considerando que 0.25% tripsina-EDTA (w/v) pueden utilizarse en lugar de la solución de separación celular, este último contiene DNasa, que ayuda a reducir la viscosidad de las células separadas. Como el medio fondo se aspira, no es necesario lavar las células antes de la adición de solución de tripsina-EDTA o celda de separación.</li>
	<li>Añadir 500 μl temperatura ambiente (20-25 ° C) PBS, pH 7,4, con 2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) a cada pocillo y resuspender con la pipeta hasta que no matas celulares visibles. Transferir inmediatamente la suspensión de células a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL en hielo. Nota: A menos que se indique lo contrario, realice todos los pasos subsiguientes en el hielo.</li>
	<li>Sedimentos las células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente aspirar el sobrenadante (con succión) para salir de los gránulos de la célula tan secas como sea posible.</li>
	<li>Añadir 400 μl 10% (p/v) de sacarosa (en ultrapura H2O) a cada tubo.</li>
</ol>3. membrana plasmática Electrodisruption y separación de fracciones celulares sedimentables y Total
<ol><li>Resuspender el precipitado de células con una pipeta para obtener una suspensión unicelular cerca y transferir a una cubeta de electroporación de 4 mm. Nota: Pipeteo altibajos ~ 10-15 veces, utilizando una pipeta de 100-1.000 μl, es generalmente suficiente.</li>
	<li>Colocar la cubeta en un decaimiento exponencial onda electroporator y descarga un solo pulso eléctrico a 800 V, 25 μF y 400 Ω; Estos ajustes producen un pulso de 8 ms de duración.</li>
	<li>
Utilice una nueva punta de pipeta para transferir la disruptate de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 400 μL de solución de helada sacarosa tamponada con fosfato (monofosfato de sodio 100 mM, 2 mM Ditiotreitol (DTT), 2 mM EDTA y 1.75% de sacarosa, pH 7,5) y mezclar brevemente pipeteo.
	<ol>
<li>Opcional: Para verificar la eficiente membrana plasmática electrodisruption17, mezclar 10 μl de la disruptate celular diluida en el paso 3.3 con 10 μl 0,4% azul de tripano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Traslado a una cámara de conteo y comprobar que el porcentaje de células positivas de azul de tripano es &gt; 99%.<ol>
<li>Dejar la muestra en la cámara de conteo durante 30 min a temperatura ambiente (20 – 25 ° C) y verificar que se ha mantenido el porcentaje de células positivas de azul de tripano &gt; 99%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Opcional: Para verificar que el electrodisruption no ha sido demasiado duro, es decir, no ha interrumpido los organelos intracelulares, realice pasos 1.1-3.3 como se describe anteriormente, pero utilice un material de partida más grande (un pozo de una placa de 6 pozos con una capa de células confluentes de ~ 80%), y 150 μl 10% de sacarosa paso 2.5 y 150 μL tampón fosfato solución sacarosa sin TDT paso 3.3.<ol>
<li>Utilice una pipeta cuidadosamente capa 200 μL de la solución de disruptate de celular diluida sobre un colchón de densidad 1,2 mL de medio de gradiente de densidad de 8% (w/v) con tampón fosfato (por ejemplo, 8% Nycodenz, fosfato de sodio 50 mM, 2.2% de sacarosa, 1 mM EDTA) en una centrífuga de 2 mL tubo. Centrifugue a 20.000 x g durante 45 minutos a 4 ° C en una microcentrífuga con función soft-mode (para suave aceleración y desaceleración) y con cuidado poner los tubos en hielo.</li>
			<li>Retire con cuidado 60 μL de la fracción superior de ~ 200 μL, asegurándose de que no cualquier solución medio gradiente de densidad y transferir a un tubo de microcentrífuga fresco. Nota: Esto debe contener citosol de pureza excepcional, denominada "savia celular"21.</li>
			<li>Prueba de la pureza de la fracción obtenida en el paso anterior, mediante la realización de análisis de western blot de organelo contiene proteínas, usando técnicas estándar y geles de gradiente de 4 – 20%16.</li>
			<li>Realizar por ejemplo immunoblotting para catepsina B21, citocromo c y isomerase del disulfuro de la proteína, para verificar que la descarga eléctrica en el paso 3.2 ha no interrumpido lisosomas, mitocondrias y retículo endoplásmico, respectivamente y el inmunoblot para LDH para verificar la presencia de una proteína citosólica en la savia celular.</li>
			<li>En paralelo, realizar immunoblotting en extractos de proteína procedente de la celda total disruptate solución16 para confirmar que los anticuerpos utilizados pueden detectar las proteínas contienen organelas que están siendo evaluadas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita los pasos 3.1-3.3 para cada muestra.</li>
	<li>Quitar 550 μl de cada solución de disruptate de células diluidas (obtenido en el paso 3.3) para tubos de microcentrífuga de 2 mL que contiene 900 μl resuspensión helada tampón (monofosfato de sodio 50 mM, 1 mM TDT, 1 mM EDTA y 5.9% de sacarosa, pH 7.5) suplementado con 0,5% BSA y 0,01% Tween-20 y mezclar brevemente por pipeteo.</li>
	<li>Centrifugar a 18.000 x g por 45 min a 4 ° C para producir pellets que contiene "LDH sedimentada". Cuidadosamente aspirar el sobrenadante (con succión) para dejar las pelotillas tan secas como sea posible. Coloque las muestras en un congelador de-80 ° C.</li>
	<li>Transferir 150 μL de cada solución de disruptate de células diluidas (obtenido en el paso 3.3) a nuevos tubos y coloque las muestras en un congelador de-80 ° C. Usar estas muestras para determinar los niveles de "total LDH" en las células. Nota: En este punto el experimento puede pausarse para como deseado.</li>
</ol>4. LDH extracción y medición de la actividad enzimática de LDH
<ol><li>Deshielo "LDH sedimentada" (del paso 3.6) y muestras de "total LDH" (de paso 3.7) en hielo.</li>
	<li>Añadir 300 μL de buffer de resuspensión helada que contiene 1,5% Triton X-405 a la "LDH total" las muestras (obtención de una concentración final de X-405 Triton de 1%). Rotar las muestras en un rodillo en una cámara fría (4 – 8 ° C) durante 30 minutos.</li>
	<li>Añadir 750 μl de buffer de resuspensión helada con 1% Triton X-405 a la LDH"sedimentada" muestras y resuspender el pellet con una pipeta hasta que se alcance una solución homogénea.</li>
	<li>Centrifugue las muestras en el paso 4.2 y 4.3 en 18.000 x g durante 5 min a 4 ° C a los desechos celulares sedimento disuelta.</li>
	<li>Mezcle 4 partes de imidazol frío 65 mM (piruvato de mM de 7.5)/0.75 de pH con una parte de imidazol frío 65 mM (pH 7.5) / 1,8 mM NADH para obtener una solución de trabajo que es estable durante al menos tres semanas a 4 ° C.</li>
	<li>Mezcle 3 – 30 μl de los sobrenadantes de paso 4.4 con 200 μL de la solución de trabajo de paso 4.5.</li>
	<li>Determinar la cantidad de LDH por medición de la actividad enzimática de LDH como la disminución de nicotinamida-adenin-dinucleótido (forma reducida) absorbancia (NADH) a 340 nm a 37 ° C en comparación con un estándar con una concentración conocida de la LDH. Mida la absorbancia hasta que la reacción ha acercado al terminar, es decir, hasta que la absorbancia a 340 nm ya no cambia con el tiempo. Nota: Este es el clásico método bioquímico para medir la actividad LDH. Aunque el protocolo actual realiza la reacción a 37 ° C, también se puede realizar a temperatura ambiente (20 – 25 ° C), que es recomendable si haciendo espectrofotometría manual. El protocolo actual utiliza un instrumento multianalyzer robótico, que en forma automática mezcla las muestras con solución de trabajo en una placa de 96 pocillos y mide la absorbancia a 340 nm a 37 ° C cada 20 s durante 3 minutos. Después de eso, el software del instrumento calcula la concentración de LDH, expresada como unidades (U) L, comparando la cuesta de las mediciones de absorbancia con el tiempo en comparación con una curva estándar obtenido a través de la calibración con un estándar de LDH conocida concentración. El rango lineal de detección por este método es de 30 – 1.500 U/L. Como alternativa, existen una gran variedad de kits disponibles en el mercado para medir la LDH. Algunos de ellos se basan en la reacción enzimática a la generación de productos colorimétricas o fluorescentes, permitiendo la detección por otros medios que la espectrofotometría UV y con otras gamas de lineales de detección de acoplamiento.</li>
</ol>5. cálculo del secuestro de LDH
<ol><li>Calcular el porcentaje de LDH sedimentado a LDH total para cada muestra, tomar las diluciones y toma en cuenta: LDH sedimentado (%) =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq1.jpg"> Nota: Durante los pasos 3.1-3.3 aproximadamente 50 μl se pierde debido a traslado dentro y fuera de la cubeta de electroporación. Calcular por lo tanto, de tener un total de 750 μl (en lugar de 800 μL) de disruptate de células diluidas en el paso 3.3.</li>
	<li>Restar el porcentaje de sedimentación LDH obtenida en las muestras de las células no tratadas (paso 1.3.2) del porcentaje de sedimentación LDH obtenida en muestras de células tratadas experimentalmente y se dividen por el tiempo de tratamiento con Baf para obtener el porcentaje de LDH secuestrado por hora en el período de muestreo: Secuestrado LDH (% / h) =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq2.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflicto de interés.

En Resumen, el protocolo descrito aquí representa un método fiable y ampliamente aplicable para monitorear la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. Comparado con el original método12,16, hemos eliminado una serie de pasos innecesarios, simplificado a varios de los pasos restantes e introdujo una sustancial reducción de resolución. Como resultado, el protocolo es mejorado en relación a costo y tiempo-eficiencia, y ahora se puede maneja...

Autofagia (griego para "la comer") es un proceso evolutivo conservado vacuolar/lysosomal degradación de material intracelular. Al descubrimiento de los genes relacionados con la autofagia ("ATG"), que son importantes para la autofagia en levaduras y humanos, y la realización que la autofagia juega un papel importante en la salud y enfermedad (reconocido por el Premio Nobel en medicina o fisiología a 2016 Yoshinori Oshumi), autofagia ha convertido rápidamente en uno de los procesos más intensamente estudiados en biología de la célula1,2.
Macroautophagy (en lo sucesivo, "autofagia") es caracterizado por la expansión y plegamiento de cisternas de membrana intracelular ("phagophores") en estructuras selladas, membrane doble o múltiple ("autophagosomes") que secuestran eficazmente la enwrapped material del resto del citoplasma. Sobre fusión de autophagosomes con lisosomas, la membrana autophagosomal interna y la carga secuestrada es degradado y reciclado. Autophagosomes puede secuestrar material citoplásmico en aleatorizada (no-selectivas autofagia) y modales de selectivo (selectivas autofagia). A granel autofagia probablemente representa una mezcla de la autofagia no selectivo y selectiva.
En los años 60 y 70 ("la era morfológico" de la investigación de autofagia), secuestro de autofagia se evaluó principalmente a través de análisis ultraestructurales. En la década de 1980 y principios de la década de 1990 ("la era bioquímica") por Seglen y compañeros de trabajo — que estudió autofagia en hepatocitos primarios de rata — desarrollaron los primeros métodos para medir cuantitativamente la autofagia secuestro actividad3. Mediante estos ensayos, Seglen define y caracteriza los diferentes pasos de la vía autofagia lisosomal4,5, descubierto acuñó el amphisome6 (el producto de la fusión del endosome-autophagosome) y fue el primero en describir el papel de la fosforilación de la proteína en autofagia Reglamento7. Sin embargo, tras el descubrimiento de los ATGs en 1990 ("la era molecular") y la primera caracterización de una proteína de ATG8 mamífera, proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-luz cadena 3 (LC3) en 20008, el uso de proteínas ATG como marcadores para la proceso de autofagia rápidamente ganó popularidad, y el más viejos y más laboriosos métodos bioquímicos se quedaron atrás. De hecho, durante los últimos 18 años, western blot y análisis de microscopía de fluorescencia de LC3 se han convertido en el más popular (y en muchos casos el único) medio de estudio de la autofagia en las células mamíferas. La ventaja es la facilidad relativa por la cual estos métodos pueden llevar a cabo. La desventaja es que uno está estudiando un componente del carro (LC3) en lugar de la carga real de autofagia. Esto es una desventaja bastante grave, porque la relación entre los Estados y el flujo de LC3 a través de la vía contra el secuestro y el flujo de carga es altamente confusa. De hecho, hemos demostrado que flujo de carga a granel puede ser mantenido en niveles elevados en condiciones donde no hay ningún flujo de LC3, a pesar de la presencia de conjugados LC3 en las celdas9. Por otra parte, hemos demostrado esa autofagia a granel se ve afectada por agotamiento de LC3 eficiente y es así probablemente LC3-independiente9. Este hallazgo más tarde ha sido confirmado por LC3 k.o. estudios10,11, que también indican que la mitofagia Parkin-dependiente (el selectiva autofagia de las mitocondrias) es independiente de LC310,11 .
En Resumen, existe una clara necesidad de ensayos de carga a controlar la actividad de autofagia. Forma óptima tales ensayos deben ser ampliamente aplicable, bien definidos y fáciles de realizar. En los últimos años hemos tomado un especial interés en el análisis del secuestro de LDH, que fue desarrollado por Seglen en la década de 198012y se basa en la transferencia de LDH citosólico a sedimentables, célula que contiene vacuolas autophagic de medición fracciones. LDH es una proteína citosólica estable y soluble que fácilmente Co es secuestrada cuando phagophores enwrap carga citoplásmico. Secuestro de LDH por lo tanto es una medida general de secuestro de autofagia. LDH se degrada exclusivamente por la vía autofagia lisosomal12. Así, en presencia de inhibidores de la degradación lisosomal, por ejemplo, bafilomycin A1 (Baf)13, directamente los efectos del tratamiento experimental reflejan alteraciones en la actividad de autofagia secuestro. En ausencia de inhibidores de la degradación, se puede medir el efecto neto de las alteraciones en el secuestro de la LDH y la degradación.
El ensayo de secuestro de LDH es ampliamente aplicable, puesto que la LDH se expresa altamente y ubicuo en todos los tipos de la célula y los niveles de LDH pueden cuantificarse con precisión por un ensayo enzimático14,15. Sin embargo, el original del protocolo12 , establecido en hepatocitos primarios de rata — era algo lento y requiere una gran cantidad de a partir de material así como un descarga eléctrica a la medida del condensador. De manera escalonada, poco a poco hemos transformado el ensayo en un método fácil y versátil. En primer lugar, el protocolo original fue adaptado para el uso en células de mamífero líneas16. En segundo lugar, el método era substancialmente reduce3,9. Tercero, se eliminaron varios pasos en el protocolo, incluyendo un cojín densidad laborioso paso17. Esto permitió al mismo tiempo una regionalización aún más el método, desde el punto de partida original del uso de una placa de 10 cm por ejemplo16 para usar un único pozo de una placa de 12 pozos por muestra (es decir, aproximadamente 15 dobleces menos a partir de material)17. En cuarto lugar, identificamos un aparato de electroporación comercial que podría sustituir el condensador descarga eléctrica por encargo del17.
Aquí se presenta nuestro protocolo más actualizada del ensayo LDH de secuestro, que incluye algunas otras simplificaciones del método con respecto a los previamente publicados17 . Además, se muestra un conjunto de resultados típicos obtenidos en un número de diferentes tipos de células, e importante, cuentan con varias líneas de validación experimental del método usando derribo farmacológico así como genético y enfoques de octavos de final. Para un esquema general de flujo del protocolo todo, vea la figura 1.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y 2 mL&nbsp;</td><td>Placas Eppendorf</td><td>211-2130 y 211-2120</td><td></td></tr><tr><td>de 12 pocillos&nbsp;</td><td>Solución</td><td></td> de desprendimiento de celdas Falcon 353043 <td></td></tr><tr><td>Accumax &nbsp;</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>A7089</td><td>Mantenga las alícuotas en -20 &nbsp; C durante años, y en la nevera durante unos meses</td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Enzo</td><td>BML-CM110-0100</td><td>Disolver en</td></tr><tr><td>células DMSO BJ</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td>uso en el paso < 30</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>422361V</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento Burker</td><td>Fisher Scientific</td><td>139-658585</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cámara de recuento de células Portaobjetos</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Contador de células automatizado</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos para la cámara</td> <td>de recuento BurkerFisher Scientific</td><td>139-658586</td><td></td></tr><tr><td>Criterion Tris-HCl Gel, 4&ndash; 20%, 26 pocillos, 15 y micro; L, 13,3 cm x 8,7 cm (ancho x largo)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>3450034</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Earle (EBSS)</td><td>Gibco</td><td>24010-043</td><td>contiene glucosa al 0,1%</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación (4 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador de onda de decaimiento exponencial</td><td>BTX Harvard Aparatos</td><td>&nbsp; EMC 630</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>10% de concentración final en medio RPMI 1640</td></tr><tr><td>células HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td>Autoclave una solución de 65 mM y mantener en la nevera durante meses</td></tr><tr><td>Incubadora; Incubadora de CO2 de calor directo IR Autoflow</td><td>NuAire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Reactivo de transfección</td><td>ThermoFisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>células LNCaP</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>uso en el paso < 30</td></tr><tr><td>3-metil adenina (3MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9281</td><td>stock 100 mM en RPMI en -20 &deg;C.&nbsp; Caliente el caldo a 65 ° C durante 10 min y uso a una concentración final de 10</td></tr><tr><td>mM Microcentrífuga refrigerada</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada con función de modo suave</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Eppendorf 5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de MRT67307 (ULKi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0702</td><td>Inhibe la actividad de la quinasa ULK. Disolver en DMSO.</td></tr><tr><td>Instrumento multianalizador MaxMat</td><td>Erba Diagnostics</td><td>PL-II</td><td></td></tr><tr><td>Celdas MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.24644.001</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axis-Shield</td><td>1002424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Medio de suero reducido</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta 3 (0.5-20 y micro; L)</td><td>VWR</td><td>732-2223</td><td>Thermo Fischer ART Puntas</td>de</tr><tr><td>barrera Puntas de pipeta (1-200 y micro; L)</td> <td>VWR</td><td>732-2207 y nbsp;</td><td>Puntas de barrera Thermo Fischer ART</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (100-1.000 y micro; L)</td> <td>VWR</td><td>732-2355 y nbsp;</td><td>Puntas de barrera Thermo Fischer ART</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>ThermoFisher</td><td>4701070</td><td>Finnpipette F2 GLP Kit</td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-10X5MG</td><td>Prepare una solución madre de 1 mg/mL en H2O estéril. Esta solución es estable a -20 &deg; C durante al menos 1 año.</td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Merck-Millipore</td><td>1066190050</td><td></td></tr><tr><td>células RPE-1 (hTERT RPE-1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-037</td><td></td></tr><tr><td>SAR-405</td><td>ApexBio&nbsp;</td><td>A8883</td><td>Inhibe la fosfoinositida 3-quinasa clase III (PIK3C3). Disolver en DMSO.</td></tr><tr><td>Silenciador Seleccione control negativo #1 (siCtrl)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>4390843</td><td></td></tr><tr><td>Silenciador Seleccione siRNA dirigido a ATG9 (siATG9A)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s35504</td><td></td></tr><tr><td>Silenciador Seleccione siRNA dirigido a FIP200 (siFIP200)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18995</td><td></td></tr><tr><td>Silenciador Seleccione siRNA dirigido a ULK1 (siULK1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s15964</td><td></td></tr><tr><td>Silenciador Seleccione siRNA dirigido a ULK2 (siULK2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18705</td><td></td></tr><tr><td>Silenciador Seleccione siRNA dirigido a GABARAP (siGABARAP)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22362</td><td></td></tr><tr><td>Silenciador Seleccione siRNA dirigido a GABARAPL1 (siGABARAPL1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s24333</td><td></td></tr><tr><td>Silenciador Seleccione siRNA dirigido a GABARAPL2 (siGABARAPL2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22387</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico dihidratado (NaH2PO4 &bull; 2H2O)&nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico dihidratado (Na2HPO4 &bull; 2H2O )&nbsp;</td><td>Prolabo</td><td>28014.291</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>VWR</td><td>443816T</td><td>10% concentración final en agua; filtrar a través de 0.45 &micro; m filtrar y conservar en la nevera durante meses</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>inhibe la bomba SERCA ER Ca2+. Disolver en DMSO.</td></tr><tr><td>Tritón X-405&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X405</td><td>1% final</td></tr><tr><td>Tinción de azul de tripán 0,4%</td><td>Sondas moleculares</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25% con tripsina)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>0,01% final</td></tr></tbody></table>

el ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, es un método simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

A granel la autofagia se caracteriza por el secuestro de grandes porciones de citoplasma en estructuras de doble/múltiple-membrane denominado autophagosomes. Aquí se describe un protocolo simple para controlar este proceso. Además, se proporcionan resultados típicos y validación experimental del método bajo condiciones de inducción autofagia en varios tipos de células mamíferos cultivadas. Durante autofagia a granel, autophagosomes secuestrar citosol y así también soluble proteínas citosólicas, junto a otras cargas de autofagia. LDH es estable y muy abundante, soluble enzima citosólica que selectivamente no es secuestrado en autophagosomes. La cantidad de secuestro de LDH por lo tanto refleja la cantidad de secuestro autofagia a granel. Determinar eficientemente y exactamente secuestro de LDH en las células, empleamos un protocolo basado en electrodisruption fraccionamiento que separa efectivamente sedimentables de LDH citosólica, seguido por la medida de la actividad enzimática en sedimentables fracciones versus muestras celulares. Secuestro de autofagia se determina restando la proporción de sedimentables LDH en las células no tratadas de eso en células tratadas. La ventaja de la prueba de captura de LDH es que da una medida cuantitativa de la autofagia secuestro de carga endógena, en comparación con otros métodos que o bien implican expresión ectópica de sondas de captura o proteasa semi-cuantitativo Análisis de marcadores de autofagia o receptores de protección.

Usando el protocolo descrito aquí, la actividad de autofagia secuestro a granel en un número de líneas de diferentes células de mamífero, incluyendo LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, ratón (MEFs) los fibroblastos embrionarios, RPE-1, Se midió las células HEK293, BJ y LNCaP. Secuestro fue evaluado bajo condiciones basales (en medio completo, rico en nutrientes), o en células muy hambrientos de suero y aminoácidos (un bona fide induc...

Aquí se describe un protocolo simple y bien validado para medir la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. El método se basa en cuantificar la proporción de lactato deshidrogenasa (LDH) en fracciones celulares de sedimentables en comparación con los niveles de LDH celulares total.

El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la autofagia, como cómo se regula la formación de autofagosomas y cómo diversos tratamientos y afecciones celulares afectan a la autofagia masiva. La principal ventaja de esta técnica es que mide el secuestro endógeno de la carga. Por lo tanto, el método es ampliamente aplicable e independiente de la sobreexpresión artificial o la introducción de sondas de carga.Los encargados de hacer una demostración del procedimiento estarán a cargo de Paula Szalai y Morten Luhr, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para empezar, cultive las células adherentes en matraces de cultivo de tejido de 75 centímetros cuadrados en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Permita que las células crezcan hasta que alcancen una capa celular casi confluente.Después de esto, lavar las células con tres mililitros de PBS a 37 grados centígrados en pH 7.4. Retire el PBS y reemplácelo con tres mililitros de 0.25% de tripsina EDTA. Incubar en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados, hasta que las células se desprendan.A continuación, se resuspendieron las cél

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Investigación

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Biología

Este video describe un ensayo colorimétrico para la medición de lactato en lisados celulares mediante el uso de la enzima lactato deshidrogenasa. Esta enzima convierte el lactato en piruvato, junto con la conversión de NAD en NADH que reacciona con los colorantes de tetrazolio y da un producto coloreado que se puede medir espectrofotométricamente para cuantificar el lactato.

Ensayo colorimétrico para la cuantificación de lactato en muestras de ensayo

El video muestra un ensayo para evaluar la actividad de secuestro autofágico masivo en células de mamíferos. Utiliza la electroporación para liberar proteínas citosólicas, incluida la lactato deshidrogenasa (LDH). Las fracciones de LDH secuestradas y LDH celular total se determinan para evaluar el secuestro de LDH, proporcionando información sobre la actividad general de secuestro masivo.

Cuantificación de la actividad de secuestro autofágico a granel en células de mamíferos

En este sentido, se utilizó la citometría de flujo de imágenes multiespectrales con una característica analítica que compara imágenes detalladas de 3 marcadores de autofagia y cuantifica su co-localización, junto con el recuento de puntos LC3, para medir la autofagia de una manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.

Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales

Mitofagia, el proceso de claro dañaado las mitocondrias, es necesario para el mantenimiento de la homeostasis y salud mitocondrial. Este artículo presenta algunas de la mitofagia últimos métodos de detección en células humanas, Caenorhabditis elegansy los ratones.

In Vitro e In Vivo la detección de la mitofagia en células humanas, C. Elegansy los ratones

Se describe un protocolo para el mapeo de la distribución espacial de la actividad enzimática de las enzimas que generan nicotinatmide adenina-dinucleótido-fosfato (NAD(P)H) + H + directamente en muestras de tejido.

Asignación de metabolismo: Supervisar la actividad de la deshidrogenasa del lactato directamente en el tejido

Describimos nuestro protocolo para medir los ritmos biológicos en el catabolismo proteico a través de la autofagia y el proteosoma en el hígado de ratón.

Medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal

El objetivo de este protocolo es determinar los niveles autofágicos en el cáncer de páncreas y las células acinares pancreáticas a través de la inmunofluorescencia LC3 y la cuantificación de puntos LC3.

Evaluación de los niveles de autofagia en dos modelos diferentes de células pancreáticas utilizando inmunofluorescencia LC3

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Aquí, describimos un protocolo detallado para el uso de un ensayo reportero basado en luciferasa en un formato de cribado semiautomatizado de alto rendimiento.

Detección de fármacos basados en células para inhibidores de la 4B cisteína peptidasa relacionada con la autofagia

En este trabajo se presenta la metodología para evaluar de forma concisa los niveles de LC3-II del marcador autofagosoma en vesículas extracelulares (VE) mediante inmunotransferencia. El análisis de los niveles de LC3-II en EV, la formación de autolisosomas y la formación de omegasomas sugiere el nuevo papel de STX6 en la liberación de EV positivos para LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas

Aprende a medir la autofagia de secuestro masivo en células de mamíferos mediante el ensayo de secuestro de lactato deshidrogenasa. Este método cuantifica LDH endógeno sin necesidad de sondas artificiales.

El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal

El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos

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