El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la autofagia, como cómo se regula la formación de autofagosomas y cómo diversos tratamientos y afecciones celulares afectan a la autofagia masiva. La principal ventaja de esta técnica es que mide el secuestro endógeno de la carga. Por lo tanto, el método es ampliamente aplicable e independiente de la sobreexpresión artificial o la introducción de sondas de carga.

Los encargados de hacer una demostración del procedimiento estarán a cargo de Paula Szalai y Morten Luhr, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para empezar, cultive las células adherentes en matraces de cultivo de tejido de 75 centímetros cuadrados en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Permita que las células crezcan hasta que alcancen una capa celular casi confluente.

Después de esto, lavar las células con tres mililitros de PBS a 37 grados centígrados en pH 7.4. Retire el PBS y reemplácelo con tres mililitros de 0.25% de tripsina EDTA. Incubar en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados, hasta que las células se desprendan.

A continuación, se resuspendieron las células en siete mililitros de medio de cultivo que contenían un 10% de FBS y se transfirieron a un tubo estéril de 50 mililitros. Con una punta de pipeta de 0,5 a 20 microlitros, transfiera 10 microlitros de suspensión celular a un tubo de microcentrífuga que contenga 10 microlitros de azul de tripán. Utilice la misma punta de pipeta para llenar inmediatamente un portaobjetos de la cámara de recuento y contar las células en un contador de células automatizado.

A continuación, utilice un medio de cultivo que contenga un 10% de FBS para preparar una dilución adecuada de la suspensión celular. Utilizando técnicas asépticas, siembre un mililitro de la suspensión celular diluida en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos. Incubar en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados hasta alcanzar la densidad celular deseada.

En los tratamientos experimentales deseados, dejando un conjunto de pozos sin tratar para definir los niveles de fondo de LDH sedimentable. Tres o cuatro horas antes de la cosecha, agregue una cantidad saturada de bafilomycina A1, inhibidor posterior al secuestro, a cada pocillo. Incubar en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados.

Al final del período de tratamiento, succiona para aspirar el medio. Agregue 200 microlitros de solución de desprendimiento de celda precalentada a 37 grados centígrados a cada pocillo. Incubar a 37 grados centígrados hasta que las células se desprendan.

Agregue 500 microlitros de PBS a temperatura ambiente a pH 7.4 que contenga 2% de BSA a cada pocillo. Con una pipeta, vuelva a suspender cada pocillo hasta que no se vean grupos de células. Después de esto, transfiera inmediatamente la suspensión celular en cada pocillo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros separado en hielo.

Centrifugar los tubos a 400 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos para sedimentar las células. Utilice la succión para aspirar completamente el sobrenadante, dejando los gránulos de la célula lo más secos posible. A continuación, añada 400 microlitros de solución que contenga un 10% de sacarosa en agua ultrapura a cada tubo.

Con una pipeta, vuelva a suspender el pellet de celda para obtener una suspensión casi de una sola celda. Transfiera esta suspensión a una cubeta de electroporación de cuatro milímetros. Coloque la cubeta en un electroporador de onda de decaimiento exponencial y descargue un solo pulso eléctrico a 800 voltios, 25 microfaradios y 400 ohmios.

Utilice una nueva punta de pipeta para transferir la interrupción celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 400 microlitros de solución de sacarosa tamponada con fosfato helada y mezcle brevemente mediante pipeteo. Repita este proceso de resuspensión, electrodisrupción y mezcla para cada muestra. Si realiza el procedimiento por primera vez, asegúrese de verificar la electrorrupción eficiente y selectiva de la membrana plasmática como se describe en el texto.

Para obtener fracciones de LDH sedimentadas, extraiga 550 microlitros de cada solución diluida de disruptor celular y transfiérala a su propio tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga 900 microlitros de tampón de resuspensión helado con 0,5 % de BSA y 0,01 % de Tween 20. Pipetear brevemente para mezclar. Centrifugar a 18.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 45 minutos para producir pellets que contengan LDH sedimentado.

Usando succión, aspire completamente el sobrenadante para dejar los gránulos lo más secos posible. Almacene las muestras de LDH sedimentadas a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para analizar. Para las fracciones totales de LDH, transfiera 150 microlitros de cada una de las soluciones disruptivas celulares diluidas a su propio tubo nuevo.

Guárdelos en un congelador a menos 80 grados centígrados hasta que estén listos para analizar. Descongele tanto la LDH sedimentada como el total de muestras de LDH en el hielo. Una vez descongelado, agregue 300 microlitros de tampón de resuspensión helado que contenga 1.5% de Triton X-405 al total de muestras de LDH.

Gire las muestras en un rodillo en una cámara frigorífica durante 30 minutos. A continuación, añada 750 microlitros de tampón de resuspensión helado que contenga 1% de Triton X-405 a las muestras de LDH sedimentadas. Utilice una pipeta para resuspender los gránulos hasta que la solución sea homogénea.

Centrifugar todas las muestras a 18.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos para sedimentar los restos celulares no disueltos. Una vez completada la centrifugación, coloque las muestras en hielo. Determine los niveles de LDH en los sobrenadantes utilizando un ensayo enzimático clásico como se describe en el texto o cualquiera de la amplia variedad de kits disponibles comercialmente.

En este estudio, se monitorea la actividad de secuestro autofágico a granel en varias líneas celulares de mamíferos diferentes. Como se muestra aquí, tanto el secuestro de LDH basal como el inducido por la inanición y las células LNCaP son completamente abolidas por el inhibidor de la pan-PI3-quinasa, 3MA. El inhibidor selectivo de la PI3-quinasa de clase tres, SAR-405 y el inhibidor de la bomba de calcio del RE, Thapsigargin.

En las células HEK293, el secuestro de LDH en condiciones de inanición se reduce fuertemente tanto por la Thapsigargin como por el inhibidor de ULK, MRT 67307. Además, se ha demostrado que el secuestro de LDH inducido por la inanición es inhibido sistemáticamente por 3MA en las otras líneas celulares observadas. A continuación, se emplean varios MEF knockout del gen ATG para probar si los genes relacionados con la autofagia que se han reportado como esenciales para la formación de autofagosomas son necesarios para el secuestro de LDH.

Como se puede ver, el secuestro de LDH inducido por la inanición se abolió en los MEFS knockout ATG5. Además, también se embota en los MEFs knockout ATG7 y ATG9A. Finalmente, se determinan los efectos del silenciamiento mediado por ARNi de las transcripciones clave del gen ATG.

Se observa que la transfección con un siRNA dirigido a ATG9A o con un objetivo combinado de ULK1 y ULK2 reduce en gran medida el secuestro de LDH en las células LNCaP. Al intentar este procedimiento, es importante ser preciso en todos los pasos del pipeteo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el ensayo de degradación de proteínas de larga vida, para responder a preguntas adicionales, como si se observaron alteraciones en la actividad de secuestro que resulten en cambios comparables en la actividad de degradación autofágica.

Después de establecer este método en líneas celulares de mamíferos, lo hemos utilizado para demostrar que la autofagia masiva es independiente de la familia de proteínas LC3 y, en cambio, requiere GABARAP. Esto pone de manifiesto la importancia de emplear métodos independientes de LC3 para monitorizar la actividad de la autofagia.