Name: Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprende un método de apareamiento en levadura para el cribado de sobreexpresión genética. Esta técnica permite identificar factores genéticos que regulan la toxicidad de proteínas asociadas a enfermedades neurodegenerativas.

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Estamos agradecidos por las discusiones reflexivas con miembros del laboratorio Ju y laboratorio de Zhong y el apoyo financiero de la Universidad de estado de Wright.

Nota: El protocolo descrito aquí está diseñado para la detección de plásmidos de la biblioteca contenidas en placas de 96 pocillos diez pero se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo en consecuencia. El protocolo tiene que repetir para completar el tamizaje de toda biblioteca. Por lo general, proyección contra 10 placas de genes biblioteca cada vez que puede ser cómodamente manejado por 1 persona.
1. preparación para la transformación de la levadura de 96 pocillos
Nota: Este paso se realiza anteriormente descrito7,10.
<ol><li>Alícuota de 5 μl (aproximadamente 50-100 ng) del plásmido ADN desde una biblioteca de plásmidos vestida en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Nota: Un ejemplo de tal una biblioteca sería un gen de levadura sobreexpresión biblioteca10.</li>
	<li>Sembrar 150 mL de levadura peptona dextrosa (YPD) los medios de comunicación en un matraz de 500 mL con una colonia (2-3 mm de diámetro) de la cepa de levadura haploide W303α. Incúbelos durante la noche a 30 ° C con agitación (200 rpm).</li>
	<li>A la mañana siguiente, medir OD600 de la cultura durante la noche y diluir la cultura de la levadura a OD600 = 0.1 en (hasta) 2 L de YPD. Incubar a 30 ° C con agitación (200 rpm) durante ~ 5 h hasta que la cultura llegue a OD600 = 0,4 – 0,6.</li>
</ol>2. levadura transformación
<ol><li>Cosecha de la cultura de la levadura por llenado 8 botellas de centrífuga estériles de 250 mL y centrifugar a temperatura ambiente a 3.000 x g durante 10 minutos retirar el sobrenadante sin perturbar el pellet. Nota: Llevar a cabo todos los pasos de centrifugación a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavado de la levadura con agua destilada estéril H2O. Para esto, añadir 100 mL de estéril de H2O para cada botella de centrífuga y agitar para Resuspender el precipitado de células. Combinar las células lavadas en 2 botellas y centrifugar a 3.000 x g durante 5 minutos retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar las células en cada frasco en 100 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE (LiOAc de 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) y centrifugar a 3.000 x g durante 5 minutos verter fuera el sobrenadante.</li>
	<li>Centrifugación, hervir 5 mL de esperma de salmón ADN (10 mg/mL) a 100 ° C con un calentador del bloque por 3 min y luego enfriarlo con hielo.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 25 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE en cada botella, combinar las células resuspendidas y transferirlos a un matraz de 150 mL. Añadir 5 mL de la esperma de salmón previamente enfriado ADN e incubar a 30 ° C con agitación (225 rpm) durante 30 minutos.</li>
	<li>Vierta la mezcla de células en un reservorio de reactivo desechable estéril y, usando una pipeta multicanal, transferir 35 μl de la mezcla de células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de fondo redondo que contiene el ADN del plásmido de biblioteca. Placas de Vortex 96-bien con un Vortex de la placa durante 1 min a 1.000 rpm. Incubar las placas durante 30 min a 30 ° C sin agitación. Nota: No apile las placas, por lo que el calor puede transferir de manera más eficiente. Hemos encontrado que Vortex no hace líquido se derrame de los pozos de las placas de 96 pozos a 1.000 rpm y una velocidad del vórtice seguro debe probarse antes de realizar el paso.</li>
	<li>En un matraz, preparar 200 mL de la solución de transformación que contiene una concentración final de 40% PEG3350, 10% DMSO y 0.1 M LiOAc. Preparar el tampón de transformación inmediatamente antes del uso y homogeneizar por agitación.</li>
	<li>Quitar 96 pocillos placas de la incubadora de 30 ° C y mezclar durante 30 s en 1.000 rpm mediante el Vortex de la placa. Añadir 125 μl del buffer de transformación a cada pozo y luego vórtice las placas durante 1 min a 1.000 rpm.</li>
	<li>Incubar las placas a 30 ° C durante 30 minutos y luego calor choque la levadura mediante la colocación de las placas en una incubadora de 42 ° C durante 15 minutos. Nota: No apile las placas.</li>
	<li>Centrifugue las placas durante 5 min a 3.000 x g. Eliminar el tampón de transformación de los pozos por invertir las placas sobre un cubo de basura y con fuerza descarga el buffer de las placas. Rápidamente secar las placas invertidas en una toalla de papel limpia para eliminar cualquier líquido en la parte superior de las placas.</li>
	<li>Enjuague las células añadiendo a los platos 200 μL de deserción mínimo media correspondiente al marcador seleccionable en el plásmido de la biblioteca. Nota: Se utilizó un medio sintético de Ura.</li>
	<li>Centrifugue las placas durante 5 min a 3.000 x g y eliminar el sobrenadante con un cubo de basura como en el paso 2.10.</li>
	<li>Añadir 160 μl de mínimo medio Ura que contiene 2% de glucosa. Vórtice de las placas durante 1 min a 1.000 rpm e incúbelos a 30 ° C por 48 h sin agitar. Después de 48 h, tenga en cuenta que una pelotilla de levadura transformada es visible en la parte inferior de cada pocillo.</li>
	<li>Mediante un dosificador de líquido, añada 100 μl de glucosa que contiene medios de Ura en cada pocillo de una nueva serie de placas de 96 pocillos.</li>
	<li>Vórtice de las placas que contiene la levadura transformada (de paso 2.13) a 1.000 rpm durante 30 s. con un duplicador de 96 pines de plástico estéril, coloque los pernos en los pozos que contiene la levadura transformada y entonces los inocule en los pocillos correspondientes de las placas nuevas llenado con medios de comunicación. Incubar las placas nuevas a 30 ° C durante 24 h. Nota: Si trabaja con placas de 10, el medio puede también dispensar manualmente utilizando pipetas de varios canales.</li>
	<li>Después de 24 h, un sedimento de levadura debe ser visible en la parte inferior de cada pocillo que contenga levadura transformada con éxito. Para guardar estas levaduras como las poblaciones de glicerol, añada 50 μl de glicerol al 50% a cada pocillo, vórtice las placas durante 30 s a 1.000 rpm, sellar las placas con cinta y congelar a-80 ° C. Nota: Los pasos anteriores sólo tiene que realizarse una vez. Futuras proyecciones de modelos diferentes de levadura contra el depósito de reactivo disponible biblioteca misma pueden iniciar desde las poblaciones de glicerol y proceden inmediatamente los pasos a continuación.</li>
</ol>3. acoplamiento entre las células que contienen Genes de biblioteca y consulta de levadura
<ol><li>Para reactivar las cepas biblioteca del stock de glicerol, sacar las placas de 96 pocillos el congelador de-80 ° C, retirar la cinta de sellado y dejar que la levadura se descongelación a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.</li>
	<li>Una vez descongelado la levadura, usar un duplicador de 96 pines de plástico estéril para inocular las cepas de glicerol a 160 μl de fresco Ura-medios de comunicación que contiene 2% de glucosa en placas de 96 pocillos e incúbelos a 30 ° C por 24 h. inmediatamente después de las tensiones de la biblioteca se utilizan , sellar las placas con cinta y volver al congelador de-80 ° C.</li>
	<li>El mismo día se descongelan las cepas de la biblioteca (W303α), inocular la cepa de levadura de consulta (aquí, FUS en W303a) a 50 mL de YPD y crecer durante la noche a 30 ° C con agitación a 250 rpm.</li>
	<li>A la mañana siguiente, vierte la cepa de levadura de consulta para un reservorio de reactivo desechable estéril y alícuota 160 μl de la cepa de consulta en cada pocillo de una placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal.</li>
	<li>Utilizando el dispensador líquido, dispensar 160 μl de medio YPD en cada pozo de diez placas de 96 pocillos. Use estas placas más tarde para el apareamiento de la cepa de levadura de consulta con la levadura de la biblioteca.</li>
	<li>Brevemente vórtice la placa de 96 pocillos que contienen la cepa consulta y usar un replicador estéril de 96 pines para transferir la consulta tensión a las placas YPD.</li>
	<li>Brevemente vórtice la biblioteca cepa placas y para cada placa de la cepa de biblioteca, use un nuevo replicador estéril de 96 pines para transferir las cepas de la biblioteca a las placas YPD que han sido inoculadas con la cepa de la consulta. Nota: Las células en glicerol pierden su viabilidad después de varios ciclos de congelación descongelación. Volviendo a las cepas de biblioteca para el almacenamiento a largo plazo (congelador de-80 ° C) tan pronto como sea posible mantener la biblioteca en buena calidad y listo para su uso futuro. Se mantiene apropiadamente, el stock de glicerol puede ser congelado y descongelado al menos 10 veces. Nosotros también recomendamos mantener una copia de trabajo y copias de seguridad de la población de glicerol. Cuando el stock de trabajo no funciona, inmediatamente hacer un nuevo trabajo copia de la copia de seguridad.</li>
	<li>Incubar las placas YPD en 30 ° C por 24 h. Nota que una pelotilla de la levadura será visible en la parte inferior de cada pocillo después de 24 h.</li>
	<li>Placas de relleno 96 pocillos con un medio de salida mínima que contienen rafinosa 2%, correspondiente a los marcadores seleccionables en el plásmido en la cepa de consulta así como en el plásmido de la biblioteca (p. ej., aquí Ura - su-).</li>
	<li>Usar un replicador estéril de 96 pines para transferir levadura de YPD apareamiento culturas a los medios selectivos. Incubar las placas de 96 pozos a 30 ° C por 48 h; sólo la levadura las células que se han acoplado y diploide formado de células y, por lo tanto, contienen tanto el plásmido de la consulta y el plásmido de biblioteca serán capaces de crecer en este medio. Después de 2 días, observar que un diábolo es visible en la parte inferior de los pozos.</li>
</ol>4. localización del ensayo
<ol><li>
Después de 48 h de crecimiento en los medios selectivos que contienen rafinosa, ver la levadura en las placas de agar.
	<ol>
<li>Preparar 2 juegos de placas, Ura su abandono con agar al 2% utilizando placas de poliestireno transparente, una galactosa que contiene de 2% y el otro que contiene 2% de glucosa.</li>
		<li>Placas Vortex 96-bien durante 1 min a 1.000 rpm, punto entonces la levadura a las placas de Ura su deserción que contiene galactosa 2% y 2% de agar (genes de FUS y biblioteca inducidos) y a las placas de Ura su deserción que contiene 2% de glucosa y 2% de agar (genes FUS y biblioteca reprimido) usando una máquina de telescopio robótica, por el cual la cultura en cada bien es descubierta en las placas de agar por cuadruplicado (es decir, la cultura en 1 bien es descubierta a 4 puntos en la placa de agar).</li>
		<li>Después de detectar, que las placas de agar seco y colocar boca abajo en una incubadora de 30 ° C. Fotografiar las placas de agar cada 24 h para registrar un crecimiento más rápido y más levadura que la toxicidad a la cepa de consulta es rescatada o para registrar un crecimiento más lento, menos en que se exacerba la toxicidad a la cepa de la consulta. Incubar las placas durante 4 días. Nota: La cultura en cada bien se puede observar en placas de agar 1 a 1, como se muestra en un método basado en la transformación anterior de10. Sin embargo, la 1-a-4 manchas aquí (que puede ser situado usando la máquina de telescopio robótica) aumenta significativamente la robustez del análisis al reducir el número de falsos positivos. Resultados positivos se consideran solamente cuando todas las 4 colonias de la misma bien muestran un fenotipo similar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+%28Saccharomycotina%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li>
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<li>Treusch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+links+between+Abeta+toxicity%2C+endocytic+trafficking%2C+and+Alzheimer%27s+disease+risk+factors+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast.</a> Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).</li>
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<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614(2011).</li>
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<li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un protocolo para realizar una pantalla de sobreexpresión de plásmido en la levadura mediante apareamiento para introducir la biblioteca del plásmido en el modelo de la levadura. Usando este acercamiento, pueden proyectará varios modelos de levadura de la toxicidad de la proteína enfermedad neurodegenerativas utilizando la misma colección de levadura transformada con una biblioteca de plásmidos. El laborioso proceso de transformación sólo necesita realizarse una vez, después de que levadura altamente ef...

La levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada en la investigación científica básica1 para entender procesos celulares relacionados directamente con enfermedades humanas. Por otra parte, se ha utilizado como organismo modelo para estudiar proteínas humanas asociadas a la enfermedad, tales como los relacionados con las enfermedades neurodegenerativas más comunes, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y amiotrófica Esclerosis lateral (ALS)2. Una ventaja del modelo de la levadura es la facilidad con que se puede realizar una pantalla de genoma para identificar vías celulares relacionados con la toxicidad de las proteínas relacionadas con la enfermedad, dando la penetración en el mecanismo de su toxicidad. Una tal pantalla se llama una pantalla de biblioteca de sobreexpresión, en la que cada uno de los 5.500 genes de la levadura en una biblioteca matriz se transforma en un modelo de levadura a identificar qué genes pueden modificar la toxicidad cuando overexpressed. Este método de cribado se ha aplicado con éxito en los modelos de la levadura de múltiples neurodegenerative enfermedad proteínas asociadas, incluyendo huntingtina para la enfermedad de Huntington3, α-sinucleína para la enfermedad de Parkinson4,5 , Aβ para la enfermedad de Alzheimer6y FUS y TDP-43 para ALS7,8,9. Mientras que generalmente se realiza en un modo de alto rendimiento de10, el paso más trabajo de la pantalla está transformando individualmente 5.500 genes de la levadura de una biblioteca vestida. Este paso debe realizarse cada vez que la proyección se repite, y cada vez que un modelo de nueva levadura necesita ser estudiado. Es importante encontrar una manera más eficiente para llevar a cabo esta tarea.
Las células de levadura estable pueden existir en formas haploides y diploides. Hay dos opuestos tipos de células haploides, acoplamiento tipo de apareamiento a y α. células haploides de cada apareamiento tipo producir y secretan su propia feromona apareamiento específico, que sólo las células de tipo acoplamiento opuesto responden. Esto permite el acoplamiento entre una y las células α producen células diploides estables, a/α. Este proceso es espontáneo y altamente eficaz11. Podemos aprovechar este ciclo de vida único de S. cerevisiae para presentar la biblioteca de plásmido. Más específicamente, cada gen en la biblioteca de plásmido vestida se transformarán en células haploides de un tipo de cruzamiento, es decir, la célula α. Estas células que contienen los genes de la biblioteca se almacenará en stock de glicerol en un formato matriz de 96 pocillos. Para cada modelo de levadura que necesita ser defendido, las células de levadura que contiene los genes de la biblioteca pueden ser descongeladas del stock de glicerol, y la proyección puede realizarse a través de acoplamiento con el modelo de levaduras de interés en el acoplamiento tipo opuesto, es decir, tipo de cruzamiento una. Esta idea de la utilización de apareamiento para reunir a dos genes en la levadura no es nueva. Se ha aplicado con éxito en la levadura de alto rendimiento, proyección de dos híbridos, en que un cebo construir (es decir, fusiones de dominio Gal4-DNA-que atan) en un tipo de cruzamiento se reúne a través de apareamiento con una construcción de la presa de una biblioteca vestida 12. sin embargo, esta estrategia no se ha aplicado nunca en proyecciones de la biblioteca de sobreexpresión, que siempre han utilizado métodos de transformación tradicional.
Nuestro laboratorio había establecido previamente un modelo de levadura de la proteína asociada a ALS FUS7. A través de la proyección de la biblioteca de sobreexpresión utilizando el método de transformación descubrieron cinco genes de levadura (NAM8, SBP1, ECM32, SKO1y VHR1) que rescatan toxicidad de FUS cuando overexpressed. Estos resultados fueron confirmados independientemente con un estudio similar realizado por otro grupo8. hUPF1, un homólogo humano de ECM32, más adelante fue demostrado que suprimen la toxicidad en las células neuronales primarias13 y en un modelo animal de ALS14 así. Utilizando estos cinco genes como prueba del principio, demostramos que todos los cinco genes asimismo rescatar toxicidad FUS cuando se introducen en el modelo de la levadura FUS por apareamiento. Puesto que las células de levadura que contiene los genes de la biblioteca pueden ser almacenadas permanentemente en stock de glicerol y revivió cuando sea necesario, este método basado en apareamiento eliminará el paso lento de transformación cada vez que necesita ser defendido contra la biblioteca. Apareamiento es altamente eficiente con ninguna transformación del plásmido involucrado, esta estrategia disminuye también significativamente el costo asociado con la purificación y transformación de una biblioteca de plásmidos grandes. Con éxito se aplicará este método en una biblioteca de investigación contra el modelo de la levadura de FUS.
El procedimiento basado en el acoplamiento se describe brevemente en la figura 1. Inicialmente, la biblioteca de plásmido vestida se transforma en una cepa de levadura haploide de acoplamiento tipo α mediante un protocolo de transformación de levaduras de alto rendimiento en el que cada pocillo de una placa de 96 pocillos contiene levadura transformada con un plásmido de la biblioteca específica. Esta colección de levadura transformada se guarda como un stock de glicerol que puede ser descongelado y revivido para el uso más adelante. El modelo de levaduras de interés, en este caso toxicidad FUS, debe generarse en una cepa de levadura haploide con el tipo de apareamiento opuesto (acoplamiento tipo a). En alto rendimiento forma con estériles replicadores de 96 pines la cepa FUS cepas de levadura que contiene la biblioteca de plásmido transferidas a placas de 96 pocillos que contienen medios enriquecidos y permitió a mate. Tras el apareamiento, un pequeño volumen de cada bien de la cultura de acoplamiento se transfiere a placas de 96 pocillos que contienen medios sintéticos deserción que levadura sólo diploide que contiene tanto las FUS y genes biblioteca pueden crecer. Una máquina telescopio robótica entonces se utiliza para transferir la cultura de la levadura de cada pozo en placas de agar donde se induce la expresión de los genes de la biblioteca y FUS.  Además, cultura de la levadura es descubierta para controlar las placas de agar donde FUS y los biblioteca los genes no se expresan. Después de crecimiento en placas de agar, se identificarán genes que rescataran o exacerban la toxicidad FUS.

<table><tbody><tr><td>salmón Esperma ADN (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD caldo</td> Research <td>Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Agar granulado</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Rafinosa Pentahidrato</td><td>Productos de investigación Internacional (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Amonio</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Sintético Ura- medio de caída</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de caída de aminoácidos de levadura -Histidina/-Uracilo</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos y sulfato de amonio</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de litio, anhidro</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 3350 (PEG-3350)</td><td>Espectro Químico&nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Replicador de 96 pines&nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 placa de ensayo de pocillos, fondo redondo con tapa</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>sin tratar, estéril</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Investigación plus Pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul volumen</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Isotemp Digital Baños Secos/Calentadores de Bloque</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5810R</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti J-26 XPI Beckman</td><td></td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Dispensador multimodo</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&nbsp; &nbsp;</td><td>Instrumentos cantantes</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Levadura de florecimiento ha sido ampliamente utilizada como modelo en el estudio de proteínas relacionadas con enfermedades humanas. Investigación genética genoma es una poderosa herramienta de uso general en estudios de levadura. La expresión de un número de proteínas asociada a enfermedad de neurodegenerative en levadura causa citotoxicidad y formación de agregados, recapitulando los resultados vistos en pacientes con estos trastornos. Aquí, describimos un método para la detección de un modelo de la levadura de la proteína asociada a la Esclerosis Lateral Amiotrófica FUS para modificadores de su toxicidad. En lugar de usar la transformación, esta nueva plataforma de proyección se basa en el acoplamiento de la levadura para introducir una matriz biblioteca de plásmidos en el modelo de la levadura. El método de apareamiento tiene dos claras ventajas: en primer lugar, es muy eficiente; en segundo lugar, la biblioteca matriz previamente transformada de plásmidos puede almacenarse a largo plazo como un stock de glicerol, y rápidamente aplicada a otras pantallas sin el paso intensivo de transformación en el modelo de levadura cada vez. Nos demuestran cómo se puede utilizar con éxito este método para detectar genes que modifican la toxicidad de FUS.

La proteína asociada a ALS FUS, una proteína de unión de ARN/ADN fue estudiada previamente en levadura haploide7,8. Genéticos de detección utilizando el método basado en la transformación descubrió varios genes de levadura que suprimen la toxicidad de FUS. El homólogo humano de uno de los genes de la levadura más adelante fue demostrado para ser eficaz en suprimir la toxicidad en un modelo de rata de ALS13y...

Este artículo presenta un método basado en el acoplamiento para facilitar la detección de sobreexpresión en levadura de florecimiento utilizando una biblioteca de plásmidos vestida.

Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades neurodegenerativas, como qué factores genéticos y vías regulan la toxicidad de las proteínas asociadas a la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que el proceso altamente eficiente de apareamiento de levaduras se utiliza para evaluar modelos de levadura contra una gran colección de genes de biblioteca. Aunque este método puede proporcionar información sobre la toxicidad de las proteínas de las enfermedades neurodegenerativas, también se puede aplicar al estudio de otros procesos celulares en la levadura, como la tolerancia a otras condiciones de estrés.Comience este procedimiento alícuota cinco microlitros por pocillo de ADN plasmídico de una biblioteca de plásmidos en matriz para placas de fondo redondo de 96 pocillos. Mantenga los platos a cuatro grados centígrados. A continuación, inocule 150 mililitros de levadura peptona dextrosa o medio YPD en un matraz de 500 mililitros con una colonia de la cepa de levadura haploide W303 Alpha.Incubar el cultivo a 30 grados centígrados con agitación a 200 rpm durante la noche. A la mañana siguiente, después de medir la OD600 del cultivo durante la noche, diluya el cultivo a una OD600 de 0,1 en dos litros de YPD. Incubar a 30 grados centígrados con agitación a 200 rpm durante unas cinco horas, hasta que el cultivo alcance un OD600 de 0,4 a 0,6.Para cosechar el cultivo de levadura, llene ocho botellas de centrífuga estériles de 250 mililitros y centrifugue a 3000 xG durante 10 minutos a temperatura ambiente. Vierta el sobrenadante sin alterar el pellet. Lave la levadura como se describe en el protocolo de texto y consolide las células en dos tubos de centrífuga.Vuelva a suspender cada pellet de celda en 25 mililitros de una solución de acetato de litio 0,1 molar. Combine las células resuspendidas, agregue cinco mililitros de ADN de esperma de salmón y transfiéralas a un matraz de 150 mililitros. Incubar a 30 grados centígrados con agitación a 225 rpm durante 30 minutos.Después de 30 minutos, vierta la mezcla de células en un depósito de reactivo desechable estéril. Con una pipeta multicanal, transfiera 35 microlitros de la mezcla celular a cada pocillo de las placas de 96 pocillos de fondo redondo, que contienen la biblioteca de ADN plásmido preparada anteriormente. Agite las placas de 96 pocillos a 1000 rpm durante un minuto.Incubar las placas a 30 grados centígrados sin agitar durante 30 minutos. No apile las placas, para que el calor pueda transferirse de manera más eficiente. Retire las placas de 96 pocillos de la incubadora a 30 grados centígrados y mézclelas a 1000 rpm durante 30 segundos.Agregue 125 microlitros de tampón de transformación a cada pocillo y luego agite las placas a 1000 rpm durante un minuto. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, haga un choque térmico de la levadura colocando las placas en una incubadora a 42 grados centígrados durante 15 minutos.Centrifugar las placas a 3000 xG durante cinco minutos. Retire el tampón de transformación de los pocillos invirtiendo las placas sobre un contenedor de basura y arrojando con fuerza el tampón de las placas. Seca rápidamente los platos invertidos con una toalla de papel limpia para eliminar cualquier líquido que quede encima de los platos.Enjuague las células agregando a cada pocillo, 200 microlitros de medio de caída mínima correspondiente al marcador seleccionable en el plásmido de la biblioteca. Aquí se utiliza ura sintética menos medio. Centrifugar las placas a 3000 xG durante cinco minutos.Retire el sobrenadante sobre un contenedor de basura como se demostró anteriormente. Agregue 160 microlitros de ura mínima menos medio, que contenga 2% de glucosa a cada pocillo y agite las placas a 1000 rpm durante un minuto. Incubar las placas sin agitar a 30 grados centígrados durante 48 horas.Después de 48 horas, una bolita de levadura transformada debe ser visible en el fondo de cada pocillo. Usando un dispensador de líquidos, agregue 100 microlitros de ura menos medio que contenga glucosa en cada pocillo de un nuevo juego de placas de 96 pocillos. Agite las placas que contienen la levadura transformada a 1000 rpm durante 30 segundos.Usando un replicador de plástico estéril de 96 pines, coloque los pines en los pocillos que contienen la levadura transformada y luego inómelos en los pocillos correspondientes de las nuevas placas llenas de medios. Incubar las nuevas placas a 30 grados centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, una bolita de levadura debe ser visible en el fondo de cada pocillo que contenga levadura transformada con éxito.Para guardar estas cepas de levadura como reservas de glicerol, agregue 50 microlitros de glicerol al 50% a cada pocillo, agite las placas a 1000 rpm durante 30 segundos, selle las placas con papel de aluminio y congele a menos 80 grados centígrados. Para revivir las cepas de la biblioteca del caldo de glicerol, saque las placas de 96 pocillos del congelador a menos 80 grados centígrados, retire el papel de aluminio y deje que la levadura se descongele a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Una vez que la levadura se haya descongelado, use un replicador de plástico estéril de 96 pines para inocular las existencias de glicerol a 160 microlitros de ura fresca menos medios que contengan 2% de glucosa en placas de 96 pocillos e incube a 30 grados Celsius durante 24 horas.Inmediatamente después de usar las cepas de la biblioteca, selle las placas y devuélvalas al congelador a menos 80 grados centígrados. El mismo día que se descongelan las cepas biblioteca, se inocula la cepa de levadura en 50 mililitros de YPD y crece a 30 grados centígrados con agitación a 250 rpm durante la noche. A la mañana siguiente, vierta la cepa de levadura de consulta en un depósito de reactivo desechable estéril y alícuota 160 microlitros de la cepa de consulta en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.Con el dispensador de líquidos, dispense 160 microlitros por pocillo de medios YPD en placas de 96 pocillos. Realice una vórtice breve de las placas de 96 pocillos que contienen la cepa de consulta y las placas de deformación de la biblioteca y, a continuación, utilice un replicador estéril de 96 pines para transferir las cepas de la biblioteca a las placas YPD que se han inoculado con la cepa de consulta. Incubar las placas YPD a 30 grados centígrados durante 24 horas.Después de 24 horas, una bolita de levadura será visible en el fondo de cada pocillo. Llene placas de 96 pocillos con un medio de caída mínimo que contenga 2% de rafinosa correspondiente a los marcadores seleccionables en el plásmido de la cepa de consulta, así como en el plásmido de la biblioteca. Utilice un replicador estéril de 96 pines para transferir la levadura de los cultivos de apareamiento YPD al medio selectivo.Incubar las placas de 96 pocillos a 30 grados centígrados durante 48 horas. Solo las células de levadura que se hayan apareado y formado células diploides y, por lo tanto, contengan tanto el plásmido de consulta como el plásmido de biblioteca podrán crecer en este medio. Después de 48 horas de crecimiento en el medio selectivo que contiene rafinosa, observe que se ve una bolita en el fondo de los pocillos que contienen células diploides.Agite las placas de 96 pocillos a 1000 rpm durante un minuto. Utilice una máquina de desmanchado robótica para detectar la levadura en placas de agar en cuádruple a placas de ura-his-droupout que contienen 2% de galactosa y 2% de agar, y a placas de ura-his-droupout que contienen 2% de glucosa y 2% de agar. Después de manchar, deje que las placas de agar se sequen y luego colóquelas boca abajo en una incubadora a 30 grados centígrados durante cuatro días.Cada 24 horas, fotografíe las placas de agar para registrar el crecimiento de la levadura. La toxicidad de la proteína FUS asociada a la ELA se examinó por primera vez en levaduras diploides. Como lo indica la placa de agar que contiene galactosa, que induce FUS, la toxicidad de FUS es consistente tanto en la levadura diplod como en la haploide.Cinco genes previamente identificados como supresores de la toxicidad de FUS a partir de un método basado en la transformación se probaron mediante el método de apareamiento. El carril uno es una cepa de levadura de control transformada con dos vectores vacíos. El carril dos es la cepa diploide de levadura FUS con un vector vacío donde la expresión de FUS es muy tóxica.Los carriles tres a siete muestran levadura diploide que expresa FUS, así como un gen de supresión. Los cinco genes rescatan la toxicidad de FUS en levaduras diploides, lo que indica que el método de apareamiento fue efectivo. Este método basado en el apareamiento se aplicó a un cribado de biblioteca de sobreexpresión de 940 genes.Y se muestra una foto de una placa representativa. Como se indica en la placa de galactosa, donde se expresan FUS y los genes de biblioteca, FUS fue tóxico para la célula de levadura diplod. El gen biblioteca, indicado por el cuadrado verde, rescató la toxicidad de FUS.Mientras que el gen biblioteca, indicado por el cuadrado rojo, aumentó la toxicidad. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 120 horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar de antemano que el fenotipo utilizado para el cribado no depende del tipo de apareamiento haploide.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los factores genéticos en la sobreexpresión que rescatan la toxicidad de las proteínas asociadas a enfermedades en la levadura. Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades neurodegenerativas exploren los mecanismos de citotoxicidad de las proteínas asociadas a la enfermedad en el modelo de levadura. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el ensayo de beta galactosidasa, para responder preguntas adicionales, como si el rescate es específico.

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Una pantalla de supresor asistida por secuenciación profunda, espontánea en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe

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Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano

Este trabajo describe un protocolo para un cribado genético supresor multicopia en Schizosaccharomyces pombe. Esta pantalla utiliza una biblioteca de plásmidos de todo el genoma para identificar clones supresores de un fenotipo de pérdida de función asociado con una cepa mutante de consulta. Los nuevos supresores genéticos del mutante nulo ell1 se identificaron utilizando esta pantalla.

Cribado genético para la identificación de supresores multicopia en Schizosaccharomyces pombe

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Aislamiento de mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura

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