Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades neurodegenerativas, como qué factores genéticos y vías regulan la toxicidad de las proteínas asociadas a la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que el proceso altamente eficiente de apareamiento de levaduras se utiliza para evaluar modelos de levadura contra una gran colección de genes de biblioteca. Aunque este método puede proporcionar información sobre la toxicidad de las proteínas de las enfermedades neurodegenerativas, también se puede aplicar al estudio de otros procesos celulares en la levadura, como la tolerancia a otras condiciones de estrés.

Comience este procedimiento alícuota cinco microlitros por pocillo de ADN plasmídico de una biblioteca de plásmidos en matriz para placas de fondo redondo de 96 pocillos. Mantenga los platos a cuatro grados centígrados. A continuación, inocule 150 mililitros de levadura peptona dextrosa o medio YPD en un matraz de 500 mililitros con una colonia de la cepa de levadura haploide W303 Alpha.

Incubar el cultivo a 30 grados centígrados con agitación a 200 rpm durante la noche. A la mañana siguiente, después de medir la OD600 del cultivo durante la noche, diluya el cultivo a una OD600 de 0,1 en dos litros de YPD. Incubar a 30 grados centígrados con agitación a 200 rpm durante unas cinco horas, hasta que el cultivo alcance un OD600 de 0,4 a 0,6.

Para cosechar el cultivo de levadura, llene ocho botellas de centrífuga estériles de 250 mililitros y centrifugue a 3000 xG durante 10 minutos a temperatura ambiente. Vierta el sobrenadante sin alterar el pellet. Lave la levadura como se describe en el protocolo de texto y consolide las células en dos tubos de centrífuga.

Vuelva a suspender cada pellet de celda en 25 mililitros de una solución de acetato de litio 0,1 molar. Combine las células resuspendidas, agregue cinco mililitros de ADN de esperma de salmón y transfiéralas a un matraz de 150 mililitros. Incubar a 30 grados centígrados con agitación a 225 rpm durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, vierta la mezcla de células en un depósito de reactivo desechable estéril. Con una pipeta multicanal, transfiera 35 microlitros de la mezcla celular a cada pocillo de las placas de 96 pocillos de fondo redondo, que contienen la biblioteca de ADN plásmido preparada anteriormente. Agite las placas de 96 pocillos a 1000 rpm durante un minuto.

Incubar las placas a 30 grados centígrados sin agitar durante 30 minutos. No apile las placas, para que el calor pueda transferirse de manera más eficiente. Retire las placas de 96 pocillos de la incubadora a 30 grados centígrados y mézclelas a 1000 rpm durante 30 segundos.

Agregue 125 microlitros de tampón de transformación a cada pocillo y luego agite las placas a 1000 rpm durante un minuto. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, haga un choque térmico de la levadura colocando las placas en una incubadora a 42 grados centígrados durante 15 minutos.

Centrifugar las placas a 3000 xG durante cinco minutos. Retire el tampón de transformación de los pocillos invirtiendo las placas sobre un contenedor de basura y arrojando con fuerza el tampón de las placas. Seca rápidamente los platos invertidos con una toalla de papel limpia para eliminar cualquier líquido que quede encima de los platos.

Enjuague las células agregando a cada pocillo, 200 microlitros de medio de caída mínima correspondiente al marcador seleccionable en el plásmido de la biblioteca. Aquí se utiliza ura sintética menos medio. Centrifugar las placas a 3000 xG durante cinco minutos.

Retire el sobrenadante sobre un contenedor de basura como se demostró anteriormente. Agregue 160 microlitros de ura mínima menos medio, que contenga 2% de glucosa a cada pocillo y agite las placas a 1000 rpm durante un minuto. Incubar las placas sin agitar a 30 grados centígrados durante 48 horas.

Después de 48 horas, una bolita de levadura transformada debe ser visible en el fondo de cada pocillo. Usando un dispensador de líquidos, agregue 100 microlitros de ura menos medio que contenga glucosa en cada pocillo de un nuevo juego de placas de 96 pocillos. Agite las placas que contienen la levadura transformada a 1000 rpm durante 30 segundos.

Usando un replicador de plástico estéril de 96 pines, coloque los pines en los pocillos que contienen la levadura transformada y luego inómelos en los pocillos correspondientes de las nuevas placas llenas de medios. Incubar las nuevas placas a 30 grados centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, una bolita de levadura debe ser visible en el fondo de cada pocillo que contenga levadura transformada con éxito.

Para guardar estas cepas de levadura como reservas de glicerol, agregue 50 microlitros de glicerol al 50% a cada pocillo, agite las placas a 1000 rpm durante 30 segundos, selle las placas con papel de aluminio y congele a menos 80 grados centígrados. Para revivir las cepas de la biblioteca del caldo de glicerol, saque las placas de 96 pocillos del congelador a menos 80 grados centígrados, retire el papel de aluminio y deje que la levadura se descongele a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Una vez que la levadura se haya descongelado, use un replicador de plástico estéril de 96 pines para inocular las existencias de glicerol a 160 microlitros de ura fresca menos medios que contengan 2% de glucosa en placas de 96 pocillos e incube a 30 grados Celsius durante 24 horas.

Inmediatamente después de usar las cepas de la biblioteca, selle las placas y devuélvalas al congelador a menos 80 grados centígrados. El mismo día que se descongelan las cepas biblioteca, se inocula la cepa de levadura en 50 mililitros de YPD y crece a 30 grados centígrados con agitación a 250 rpm durante la noche. A la mañana siguiente, vierta la cepa de levadura de consulta en un depósito de reactivo desechable estéril y alícuota 160 microlitros de la cepa de consulta en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.

Con el dispensador de líquidos, dispense 160 microlitros por pocillo de medios YPD en placas de 96 pocillos. Realice una vórtice breve de las placas de 96 pocillos que contienen la cepa de consulta y las placas de deformación de la biblioteca y, a continuación, utilice un replicador estéril de 96 pines para transferir las cepas de la biblioteca a las placas YPD que se han inoculado con la cepa de consulta. Incubar las placas YPD a 30 grados centígrados durante 24 horas.

Después de 24 horas, una bolita de levadura será visible en el fondo de cada pocillo. Llene placas de 96 pocillos con un medio de caída mínimo que contenga 2% de rafinosa correspondiente a los marcadores seleccionables en el plásmido de la cepa de consulta, así como en el plásmido de la biblioteca. Utilice un replicador estéril de 96 pines para transferir la levadura de los cultivos de apareamiento YPD al medio selectivo.

Incubar las placas de 96 pocillos a 30 grados centígrados durante 48 horas. Solo las células de levadura que se hayan apareado y formado células diploides y, por lo tanto, contengan tanto el plásmido de consulta como el plásmido de biblioteca podrán crecer en este medio. Después de 48 horas de crecimiento en el medio selectivo que contiene rafinosa, observe que se ve una bolita en el fondo de los pocillos que contienen células diploides.

Agite las placas de 96 pocillos a 1000 rpm durante un minuto. Utilice una máquina de desmanchado robótica para detectar la levadura en placas de agar en cuádruple a placas de ura-his-droupout que contienen 2% de galactosa y 2% de agar, y a placas de ura-his-droupout que contienen 2% de glucosa y 2% de agar. Después de manchar, deje que las placas de agar se sequen y luego colóquelas boca abajo en una incubadora a 30 grados centígrados durante cuatro días.

Cada 24 horas, fotografíe las placas de agar para registrar el crecimiento de la levadura. La toxicidad de la proteína FUS asociada a la ELA se examinó por primera vez en levaduras diploides. Como lo indica la placa de agar que contiene galactosa, que induce FUS, la toxicidad de FUS es consistente tanto en la levadura diplod como en la haploide.

Cinco genes previamente identificados como supresores de la toxicidad de FUS a partir de un método basado en la transformación se probaron mediante el método de apareamiento. El carril uno es una cepa de levadura de control transformada con dos vectores vacíos. El carril dos es la cepa diploide de levadura FUS con un vector vacío donde la expresión de FUS es muy tóxica.

Los carriles tres a siete muestran levadura diploide que expresa FUS, así como un gen de supresión. Los cinco genes rescatan la toxicidad de FUS en levaduras diploides, lo que indica que el método de apareamiento fue efectivo. Este método basado en el apareamiento se aplicó a un cribado de biblioteca de sobreexpresión de 940 genes.

Y se muestra una foto de una placa representativa. Como se indica en la placa de galactosa, donde se expresan FUS y los genes de biblioteca, FUS fue tóxico para la célula de levadura diplod. El gen biblioteca, indicado por el cuadrado verde, rescató la toxicidad de FUS.

Mientras que el gen biblioteca, indicado por el cuadrado rojo, aumentó la toxicidad. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 120 horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar de antemano que el fenotipo utilizado para el cribado no depende del tipo de apareamiento haploide.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los factores genéticos en la sobreexpresión que rescatan la toxicidad de las proteínas asociadas a enfermedades en la levadura. Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades neurodegenerativas exploren los mecanismos de citotoxicidad de las proteínas asociadas a la enfermedad en el modelo de levadura. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el ensayo de beta galactosidasa, para responder preguntas adicionales, como si el rescate es específico.