Name: Análisis de N- glicanos de Raphanus sativus variedades usando PNGasa H+ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a preparar y analizar N-glicanos de Raphanus sativus usando PNGasa H⁺ sin cambios de tampón. Este método simplificado permite la caracterización rápida de glicanos en cultivares de rábano.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación de Ciencias naturales de China (la concesión número 31471703, A0201300537 y 31671854 a J.V. y L.L., número 31470435 de la concesión a G.Y.) y el Plan talentos extranjeros 100 (número de licencia JSB2014012 a J.V.).

1. muestras
<ol><li>Adquirir diferentes variedades de fresco rábano (Raphanus sativus L.).</li>
</ol>2. aislamiento de proteína de rábano
<ol><li>Homogeneizar aproximadamente 100 g de rábanos frescos con una licuadora de cocina durante 10 minutos.</li>
	<li>Transferir la mezcla a un tubo de centrífuga de 50 mL y centrifugar a 14.000 × g a 4 ° C por 20 min eliminar el material insoluble.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante con cuidado en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL y añadir un volumen igual de solución de ácido tricloroacético (TCA) de 2 M. Nota: Agregar TCA precipita soluble (glico) proteínas.</li>
	<li>Centrifugar a 14.000 × g a 4 ° C por 30 min y retire el sobrenadante de las concentrados (glico) proteínas.</li>
	<li>Lavar el precipitado con 20 mL de agua desionizada y centrifugar a 14.000 × g a 4 ° C por 5 min eliminar polisacáridos y oligosacáridos solubles.</li>
	<li>Repita el paso 2.5. cuatro veces.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de agua desionizada y transfiéralo a un tubo de centrífuga 1.5ml fresco.</li>
</ol>3. preparación de N- glicanos
<ol><li>Mezcle 50 μl de solución de proteína de paso 2.7. (equivalente a 5 g de rábanos frescos) con 0,2 mU de recombinante PNGasa H+ en 10 mM de ácido acético.</li>
	<li>Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C por 12 h. Después de la incubación, centrifugar a 14.000 × g por 5 minutos quitar la proteína adicional y enzima.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga 1.5ml fresco.</li>
</ol>4. purificación de N- glicanos
<ol><li>Preparar la columna de extracción en fase sólida (SPE) para enriquecer los N- glicanos y quitar sales y otras impurezas de la mezcla de reacción, aumentando la selectividad del fluorógenos 2-Aminobenzamida (2-AB) etiquetado agente de N- glicanos derivatización.<ol>
<li>Añadir 3 mL de agua desionizada para lavar la columna.</li>
		<li>Añadir 3 mL de acetonitrilo 80% solución de ácido trifluoroacético (TFA, 0.1% v/v) para activar la columna SPE.</li>
		<li>Añadir 3 mL de agua desionizada para equilibrar la columna SPE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir la muestra en el paso 3.3 a la columna y descartar el flujo a través.</li>
	<li>Añadir 1,5 mL de agua desionizada para lavar la columna y descartar el flujo a través.</li>
	<li>Eluir los N- glicanos liberados de la columna con 1,5 mL de solución acuosa de acetonitrilo 20%, que contiene 0.1% TFA (v/v) en un tubo de centrífuga de 2 mL.</li>
	<li>Quitar el solvente por evaporación centrífugo a temperatura ambiente. Evaporar hasta que la muestra esté completamente seca.</li>
</ol>5. fluorescencia derivatización de N- glicanos
<ol><li>Preparar 1 mL de solución 2-AB, que consta de 35 mM 2-AB y 0.1 M cianoborohidruro de sodio en solución de ácido acético/sulfóxido de dimetil (7:3, v/v).</li>
	<li>Añadir 5 μl de solución 2-AB para las muestras secadas (paso 4.5.) deriva de seis diferentes rábanos. Vortex cada muestra hasta que totalmente disuelto.</li>
	<li>Incubar la mezcla por 2 h a 65 ° C.</li>
	<li>Deje enfriar el muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos y añadir 5 μl de agua desionizada y 40 μl de acetonitrilo. Centrifugar los tubos a 14.000 x g durante 3 minutos.</li>
	<li>Transferir 48 μl del sobrenadante en un frasco HPLC de alta recuperación μl 300. Almacenar las derivatizados N- glycan muestras a-20 ° C hasta por un mes.</li>
</ol>6. HILIC UPLC perfiles de N- glicanos
<ol><li>Analizar las muestras usando un sistema UPLC estándar conectado a un detectorset de fluorescencia en línea en las longitudes de onda de excitación/emisión de 330 nm/420 nm, respectivamente.</li>
	<li>Utiliza una cromatografía de líquidos de interacción hidrofóbica (HILIC)-columna de glicanos UPLC a una temperatura de columna de 60 ° C para el análisis.</li>
	<li>Preparar A solvente diluyendo 50 mL de solución madre (solución de formiato de amonio de 1 M, pH 4,5) con 950 mL de líquido cromatografía-espectrometría de masas (LCMS)-grado de agua. Prepare la solución como sigue:<ol>
<li>Añadir 43 mL de ácido fórmico a 700 mL de LCMS-grado H2O.</li>
		<li>Ajustar el pH a 4.5 por adición gota a gota de solución de amoníaco acuosa (25% w/w).</li>
		<li>Transferir el solvente a una probeta y llenar hasta 1000 mL con LCMS-grado H2O. almacenar a 4-6 ° C hasta por 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar acetonitrilo grado LCMS como solvente B.</li>
	<li>N- glycans se separan con la siguiente elución gradiente:<ol>
<li>Comience agregando el 95% de disolvente B en solvente A. Ajuste la velocidad de flujo de 0,5 mL/min de 0 min 44,5.</li>
		<li>Del minuto 0 al minuto 6, disminuyen progresivamente la proporción del disolvente B % to78 gradiente lineal.</li>
		<li>De 6 min a min 44,5, disminuyen progresivamente la proporción del disolvente B con un degradado lineal a 55,9%.</li>
		<li>De min min 46,5 44,5, rápidamente disminuir la proporción de solvente B con un degradado lineal de 55,9% a 0% y mantener en 0% por 2 min e iniciar lavado de la columna. Reducir la tasa de flujo de 0.25 mL/min de 44,5 a 55 min.</li>
		<li>Lavar la columna adicional incrementando el disolvente B a 95% de min min 50,5 48,5 y sostenga en el 95% de 4.5 min.</li>
		<li>Volver a equilibrar la columna para las condiciones iniciales de 95% de disolvente B en 0.5 mL/min de 50.5 a min 57.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyectar al sistema UPLC 45 μl de la muestra.</li>
	<li>Eluir los N- glicanos por UPLC con tiempos de retención entre 15 y 40 minutos.</li>
	<li>Recoger cada fracción de pico UPLC observado usando tubos de centrífuga de 2 mL y secar las muestras por evaporación centrífugo.</li>
	<li>Inyectar aproximadamente 1 pmol de etiquetado estándar de dextrano (2−20 unidades de glucosa) para calibrar la plantaN- glycan perfiles y asignar los tiempos de elución en unidades de glucosa estandarizada 2-AB.</li>
</ol>7. uso de MALDI-TOF MS análisis
<ol><li>Disuelva las muestras de paso 6.8 en 5 μl de LCMS-agua de grado. Mezclar 1 μl de la solución de muestra y 1 μl de la solución de (ATT) (0,3% w/v en acetonitrilo acuoso 70% v/v) 6-aza-2-thiothymine y pipeta de la mezcla en el portamuestra de MALDI-TOF.</li>
	<li>Analizar las muestras usando un instrumento de espectrómetro de masas MALDI-TOF en ion positivo modo presionando el botón Start .</li>
	<li>Analizar los espectros de masas mediante el software de análisis de MALDI-TOF-MS que lo acompaña.</li>
	<li>Interpretar los espectros utilizando un código abierto glycan interpretación software19. Definir los parámetros de búsqueda para 2-AB etiquetado [M + Na]+y establecer el parámetro de exactitud Da 2.0.</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo que hemos presentado aquí permite la comparación de los N- glicanos perfiles de distintas variedades de rábano. Una importante ventaja de este método en comparación con los protocolos existentes es que no hay cambios de tampón entre la liberación enzimática de N- glicanos y la reacción de derivatización con 2 AB son necesarios. El paso más crítico de este procedimiento es la purificación de N- glycans utilizando la columna SPE, como fracaso para eliminar las sales o impurezas en la...

N- glycans en plantas han atraído la atención creciente en los últimos años, como la investigación anterior ha puesto de manifiesto N- glicanos como una fuente potencial de reacciones cruzadas inmunológicas que pueden provocar las respuestas alérgicas1,2 . Se ha demostrado previamente que N- glycans en glicoproteínas vegetales pueden afectar actividad catalítica3,4, termoestabilidad y plegable de5,6 o localización subcelular y secreción7. Con el fin de correlacionar las estructuras glicanos con sus respectivas funciones, N- glycans debe primero liberarse de glicoproteínas enzimático o químicamente. El método químico clásico para la liberación de N- y O- glicanos es β-eliminación, en la cual tratamiento alcalino de la muestra se acompaña de reducción con hidruro de boro para producir un alditol8. Sin embargo, este procedimiento impide etiquetar con un fluoróforo y causa decaimiento significativo de unidades de monosacárido del extremo reductor de la estructura de glicanos. Deglycosylation química basada en el tratamiento de carbonato de hidróxido de amonio es también un método alternativo utilizado9. Ninguno de estos métodos de liberación químico degrada proteínas intactas, que permite el análisis de espectrometría de masa de glicanos piscinas sin la interferencia de los fragmentos de péptido en el mismo rango de masa. Sin embargo, una desventaja de estos métodos es la tasa de degradación creciente de α1, 3 fucosylated N- glycans, una estructura común de carbohidratos encontrados en las plantas10. Como alternativa, métodos de liberación enzimática utilizando péptidos:N- glicanasas (PNGases, EC 3.5.1.52) se aplican también extensamente. Recombinante PNGasa F (de Flavobacterium meningosepticum) es la opción más común y permite la liberación de todos los tipos de N- glicanos, excepto las estructuras teniendo un núcleo α1, fucosa 311,12. Por lo tanto, A PNGasa (aislada de semillas de almendra) se utiliza generalmente para el análisis de planta N- glycans13. Sin embargo, esta enzima deglycosylates sólo proteolytically derivados de glicopéptidos y es incapaz de deglycosylate nativo glicoproteínas14. Por lo tanto, es necesaria un workup muestra varios pasos antes de análisis, que causa pérdida extensa de glycans, especialmente aquellos de baja abundancia15. El objetivo del método es presentar un flujo de trabajo optimizado para el lanzamiento de N- glicanos y fluorescencia de etiquetado de una manera sencilla y robusta. La lógica subyacente es que PNGasa H+, que fue descubierto recientemente en Terriglobus roseus y puede ser por vía recombinante expresada en e. coli, puede hidrolizar N- glycans directamente desde el andamio de proteínas en ácidos condiciones16. Una ventaja clave de usar PNGasa H+ sobre métodos alternativos es que reacciones Etiquetadoras fluorescentes se pueden realizar en el mismo tubo de reacción sin modificar la reacción buffers17,18. Las condiciones de preparación simple y alta recuperación de baja abundancia oligosacáridos hacen este método una valiosa herramienta en el análisis de N- glicanos. Este protocolo es adecuado para el análisis de N- glicanos de varias especies de plantas.

<table><tbody><tr><td><fuerte>químicos:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ácido tricloroacético&nbsp;</td><td>SCR, Shanghái</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Reactivo general G80988C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Energía química</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-aminobenzamida</td><td>Heowns, Tianjin</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidruro de sodio</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Huada</td><td>, Guangzhou</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de dextrano marcada con 2AB, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-tiotimina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Herramientas/Materiales:</fuerte></td>Batidora de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cocina</td><td>Bear, Guangzhou</td><td>Centrífuga LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador centrífugo</td><td>Hualida, Taicang</td> Columna SPE <td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Análisis:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alta recuperación vial de HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Detector de fluorescencia para HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Horno de columna</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Columna</td><td>Aguas Acquity UPLC BEH columna de glicanos</td><td></td><td>2.1 &times; 150 mm, 1.7 &mu; m tamaño de partícula</td></tr><tr><td>Agua de grado LCMS</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo de grado LCMS</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Aladdin</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>solución de amoníaco</td><td>Aladdin A112080</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de n- glicanos de raphanus sativus variedades usando pngasa h+

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

En los últimos años, las moléculas de hidratos de carbono de las plantas han recibido considerable atención, ya que son una fuente potencial de respuesta inmune cruz-reactivo, que provoca la alergia. Además, estructuras de hidratos de carbono también juegan un papel fundamental en el metabolismo vegetal. Aquí, presentamos un método simple y rápido para la preparación y análisis de N- glicanos de diferentes variedades de rábano (Raphanus sativus) con un N- glycanase específico para la liberación de las estructuras de carbohidratos de origen vegetal. Para lograr esto, los precipitados de homogenados de rábano crudo ácido tricloroacético fueron tratados con PNGasa H+y etiquetados utilizando 2-Aminobenzamida como una etiqueta fluorescente. Las etiqueta N- glycan muestras posteriormente fueron analizadas por ultra rendimiento cromatografía líquida (UPLC) separación e ionización-tiempo de desorción láser asistida por matriz de la espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF) para un detallado estructural evaluación y cuantificar abundancies relativos de las estructuras derivadas de rábano N- glicanos. Este protocolo también puede utilizarse para el análisis de N- glicanos de varias otras especies de plantas y puede ser útil para la investigación adicional de la función y los efectos de N- glicanos en la salud humana.

La figura 1 muestra una descripción esquemática del protocolo descrito, incluyendo el aislamiento de (glico) proteínas de rábano, la preparación de N- glicanos, el análisis UPLC y el MALDI-TOF-MS en análisis de estos componentes. La figura 2 muestra representativos cromatogramas UPLC de N- glycans derivatizados de los cultivares analizados rábano. La figura 3 muestra los resultados ...

Describimos un método simple y rápido para la preparación y análisis de N- glicanos de diferentes variedades de rábano (Raphanus sativus).

Análisis de N- glicanos de Raphanus sativus variedades usando PNGasa H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la glicosciencia vegetal, como cómo se pueden analizar y caracterizar rápidamente los N-glicanos de origen vegetal. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere cambios de tampón entre la liberación enzimática de los N-glicanos y las reacciones de derivatización con 2-aminobencamida. El procedimiento será demostrado por las señoritas Ya-Min Du y Shen-Li Zhen, dos estudiantes de posgrado del Centro de Investigación de Glicómica e Ingeniería de Glicanos de la Universidad Agrícola de Nanjing.Para comenzar el aislamiento de las proteínas, utilice una licuadora de cocina para homogeneizar aproximadamente 100 gramos de rábano fresco durante diez minutos. Transfiera la suspensión resultante a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugue a 14.000 × g a cuatro grados Celsius durante 20 minutos para eliminar el material insoluble.Después de esto, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Añada una cantidad igual de una solución de ácido tricloroacético dos molar. Centrifugue a 14.000 × g a cuatro grados Celsius durante 30 minutos.Luego, elimine el sobrenadante. Lave el pre

analysis-of-n-glycans-from-raphanus-sativus-cultivars-using-pngase-h

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se describe un método para el análisis de la alteración de la N-glicanos ligados a través de los primeros años de vida de las glicoproteínas después de su biosíntesis en células de mamíferos. Esto se logra mediante pulso-caza análisis de glicanos metabólicamente etiquetados, liberación enzimática de las glicoproteínas y análisis por HPLC.

Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

Una manera rápida se describe para obtener información sobre la estructura de los polisacáridos en una matriz extracelular. El método tiene la ventaja de la especificidad de glycosylhydrolases y la sensibilidad de la espectrometría de masas permite pequeñas cantidades de materiales para ser analizados. Esta técnica se puede adaptar para utilizarse directamente sobre el tejido en sí.

Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares

Usando glicosidasas específicas para eliminar los azúcares de las glicoproteínas seguido de SDS-PAGE es un método útil para detectar las modificaciones de glicanos de las muestras de proteínas y es una buena opción para los estudios de glicobiología inicial. Siguientes cambios deglicosilación pueden ser detectados como cambios en la movilidad en gel o por tinción con glicano reactivos sensibles.

Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Se desarrolló un protocolo de alto rendimiento para la purificación combinada de proteómica y glicómica y la cuantificación de LC-MS/MS en plasma. El análisis de desamidación de los motivos de glicosilación ligados a N fue específico para los sitios desglicosilados. La cuantificación precisa de N-glicanos se logró acoplando la separación de N-glicanos asistida por filtro a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano.

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

Este artículo presenta una forma mejorada de una novedosa técnica glicómica de abajo hacia arriba diseñada para analizar el perfil composicional agrupado de glicanos en biofluidos no fraccionados a través de la descomposición química de los glicanos en sus monosacáridos específicos de enlace constituyente para su detección por GC-MS. Las aplicaciones potenciales incluyen la detección temprana del cáncer y otros trastornos afectivos de los glicanos.

El análisis de glicanos Nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para Glicómica

Un protocolo para el análisis estructural de polisacáridos por electroforesis del gel (PACE), usando Manano como ejemplo, se describe.

Caracterización estructural de polisacáridos de pared celular mananos en plantas con ritmo

La inmunoglobulina G (IgG) N-glicano se caracteriza mediante cromatografía de interacción hidrófila UPLC. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada. Presentado aquí es una introducción a este método experimental para que pueda ser ampliamente utilizado en entornos de investigación.

Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance

El perfil de polímeros de microarrays (MAPP) es una técnica de alto rendimiento para el análisis de la composición de glicanos en muestras biológicas.

Perfil de polímeros de microarrays (MAPP) para análisis de glicanos de alto rendimiento

En este trabajo se presenta un protocolo detallado para la liberación de O-glicanos de las mucinas, y la posterior desalado, permetilación y análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.

Perfilado de O-glicanos de mucina permetilada mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz

Aprende a preparar y analizar N-glicanos de Raphanus sativus usando PNGasa H⁺ sin cambios de tampón. Este método simplificado permite la caracterización rápida de glicanos en cultivares de rábano.

Análisis de N- glicanos de Raphanus sativus variedades usando PNGasa H⁺

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