Name: Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprende a cuantificar mRNA recién sintetizado en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado con 4-tiouracilo. Este método permite medir la actividad de ARN polimerasa II separando la síntesis de la degradación del ARN.

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Agradecemos a Laszlo Tora por su apoyo y V. Fisher, Schumacher K. y F. El Saafin para sus discusiones. T.B. fue apoyado por una beca Marie Curie ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) y la Fundación arco. Este trabajo fue financiado por los fondos de la Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Este estudio fue apoyado también por ANR-10-LABX-0030-INRT, un fondo del Estado francés a cargo de la Agence Nationale de la Recherche en el marco programa Investissements Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

1. célula de cultivo y el agotamiento de la rapamicina de una subunidad de la SAGA
<ol><li>Para cada cepa de S. cerevisiae y repetición, incluyendo tipo o cepas de control, inocular una colonia solo de un plato fresco en 5 mL de medio YPD (2% peptona, extracto de levadura 1% y 2% de glucosa).</li>
	<li>Cultivar células de S. cerevisiae durante la noche a 30 ° C con agitación constante (150 rpm).</li>
	<li>Medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) y diluir la cultura a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 100 mL de medio YPD y dejarla crecer hasta que el OD600 es alrededor de 0,8.</li>
	<li>En paralelo, inocular una sola Colonia de S. pombe células de una nueva placa en 50 mL de medio de sí (0,5% extracto de levadura, 250 mg/L adenina, histidina, uracil, leucina y lisina; 3% de glucosa) y crecen las células durante la noche en 32 ° C con agitación constante (150 rpm).</li>
	<li>Medir OD600 de la cultura durante la noche de S. pombe y diluir la cultura a un OD600 de aproximadamente 0.1 en 500 mL de medio de sí y dejarla crecer hasta que el OD600 es aproximadamente 0.8.</li>
	<li>Para cada cepa ancla lejos de S. cerevisiae y repetición, incluyendo tipo o cepas de control, inocular una colonia solo de un plato fresco en 5 mL de medio YPD (2% peptona, extracto de levadura 1% y 2% de glucosa).</li>
	<li>Crecen las células durante la noche a 30 ° C con agitación constante (150 rpm).</li>
	<li>A la mañana siguiente, medir el OD600, diluir la cultura a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 100 mL de medio YPD y dejarla crecer hasta el OD600≈ 0.8.</li>
	<li>Añada 100 μl de rapamicina a la cultura de una solución stock de 1 mg/mL (concentración final rapamicina de 1 μg/mL) y dejar las células incubar a 30 ° C con agitación constante durante el tiempo necesario para la proteína de interés a ser condicional agotado desde el núcleo ( generalmente, 30 minutos es suficiente). Para el control, utilizar un cultivo de levadura similar, pero en lugar de agregar rapamicina, añadir el volumen equivalente de dimetilsulfóxido (DMSO).</li>
</ol>2. 4tU etiquetado con S. pombe como una espiga (cuenta)
<ol><li>
Preparar una solución fresca de 4 M 2-tiouracilo. Una vez preparado, mantener a temperatura ambiente y lejos de la luz.
	<ol>
<li>Exactamente pesa 64,1 mg de tiouracilo de 4 para cada cultivo de S. cerevisiae y disolver en 250 μl de dimetilformamida (DMF) o en 250 μl de DMSO.</li>
		<li>Para el cultivo de S. pombe ser utilizado como punto de pesa de 320,5 mg de 4-tiouracilo y disolverlo en 1.250 μl de DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir la solución 4-tiouracilo a cultivos de S. cerevisiae y S. pombe para una concentración final de 5 mM e incúbelos durante 6 min con agitación constante a 30 ° C y 32 ° C, respectivamente.</li>
	<li>Después de 6 minutos, retirar una pequeña alícuota de cada cultivo para el recuento celular. Contar las células usando un contador celular automático o una cámara de Neubauer.</li>
	<li>Recoger las células por centrifugación (2.500 x g) durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante, lavar las células y helada 1 x PBS, centrifugar nuevamente (2.500 x g, 4 ° C, 5 min).</li>
	<li>Calcular el número total de células en cada una de las muestras de S. cerevisiae y S. pombe .</li>
	<li>Resuspender las células en 5 mL de PBS 1 x helada y S. cerevisiae se mezclan con las células de S. pombe con una proporción 3:1.</li>
	<li>Centrifugar las células (2.500 x g, 4 ° C, 5 minutos), retirar el PBS, flash-congela las células en el líquido de N2y almacenar la muestra a-80 ° C hasta su uso posterior.</li>
</ol>3. ARN extracción y tratamiento de DNasa
<ol><li>Descongelar las células en hielo por aproximadamente 20-30 min.</li>
	<li>Proceder a la extracción de RNA utilizando un kit de extracción de ARN de la levadura (Tabla de materiales) con algunas adaptaciones.</li>
	<li>Por cada muestra, vierta 750 μl de helada granos de zirconio en un tubo de 1,5 mL tapón provisto en el equipo. Tenga en cuenta que por cada tubo, ARN de hasta 109 células puede ser eficientemente extraída. Por lo tanto, prepare el número de tubos necesarios para cada muestra. Por ejemplo, un cultivo de S. cerevisiae de 100 mL (OD600≈ 0.8) puede hacer alrededor de 2 x 109 a 3 x 109 células, a un total de 2.7 x 109 4 x 109 células en total (después de la espiga con un tercio de la de S. pombe células). En este caso, se requiere hasta 3-4 tubos de reacción por cada muestra/condiciones/mutantes/repetición.</li>
	<li>Por cada 1 x 109 células, añadir 480 μl del tampón de lisis suministrado con el kit de 48 μl de SDS 10% y 480 μl de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol (25:24:1, v/v/v).</li>
	<li>Mezclar las células usando un mezclador de tipo vórtex y transferir a tubos que contienen los granos de zirconio helados.</li>
	<li>Acomodar los tubos en un adaptador de mezclador de vórtice, gire el vortex a máxima velocidad y batir por 10 min a lyse las células de levadura (en una habitación a 4 º C). Alternativamente, realizar la lisis de las células en un batidor automático de grano.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 16.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente y recoger cuidadosamente la fase superior (fase que contiene RNA) a un nuevo tubo falcon 15 mL. Por lo general, el volumen recuperado por cada tubo es alrededor de 500 – 600 μl.</li>
	<li>A los tubos de 15 mL que contiene el RNA parcialmente purificado, añadir el tampón de Unión suministrado con el kit y mezcla bien. Por cada 100 μl de solución de RNA, añadir 350 μl de tampón de unión (es decir, cuando el volumen de fase acuosa solución es 600 μl, 2,1 mL de la solución de enlace debe añadirse).</li>
	<li>A la mezcla anterior, añadir el etanol 100% y mezclar bien. Por cada 100 μl de solución de RNA, añadir 235 μl de etanol al 100% (es decir, cuando el volumen de fase acuosa solución es 600 μl, añadir 1,41 mL de etanol).</li>
	<li>Aplicar hasta 700 μl de la mezcla del paso 3.9 a un cartucho de filtro montado en un tubo de colección, tanto incluidas en el kit.</li>
	<li>Centrifugar por 1 min a 16.000 x g. Si la duración de la centrifugación no fue suficiente para el volumen total pasar a través del filtro, repetir la centrifugación durante 30 s.</li>
	<li>Deseche el flujo a través y reutilizar el mismo tubo de la colección. Añadir otro 700 μl de solución tampón etanol de unión de ARN al filtro y centrifugar a 16.000 x g durante 1 minuto.</li>
	<li>Deseche el flujo a través y repita los pasos 3.11 y 3.12 hasta que termine la solución de RNA.</li>
	<li>Lave el filtro 2 x con 700 μl de solución 1 de lavado. Recoger el lavado solución mediante centrifugación a 16.000 x g durante 1 min y mantenga siempre el tubo de la colección.</li>
	<li>Lave el filtro 2 x con 500 μl de solución 2 de lavado. Recoger el lavado solución mediante centrifugación a 16.000 x g durante 1 min y mantenga siempre el tubo de la colección.</li>
	<li>Centrifugar los tubos una vez más a 16.000 x g durante 1 min secar completamente el filtro.</li>
	<li>Transferir el cartucho del filtro al colección final (un tubo apropiado de RNA) y eluir el RNA con 50 μl de tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O (precalentado a 100 ° C).</li>
	<li>Centrifugar por 1 min a 16.000 x g.</li>
	<li>Eluir el RNA otra vez (en el mismo tubo) con 50 μl de precalentado tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O. Asegúrese de que el volumen ha pasado por el filtro; en caso contrario, centrifugar durante períodos más largos.</li>
	<li>Si se utilizan tubos múltiples para una sola muestra, les piscina todo en un tubo.</li>
	<li>Cuantificar y comprobar la pureza de la muestra utilizando el equipo adecuado. Nota: Mientras 4tU sólo se incorpora dentro de RNA recién sintetizada, hay una probabilidad de menor contaminación con ADN. Por ello, siempre es recomendable para tratar las muestras con DNasa I. Para ello, utilice los reactivos proporcionados con el kit de extracción de RNA (Tabla de materiales) siguiendo las recomendaciones del fabricante.</li>
</ol>4. específico de tiol Biotinilación de ARN recién sintetizado
<ol><li>Ajustar la concentración del RNA con el artículo 3 del Protocolo a 2 mg/mL. Alícuota de 200 μg de ARN total, calentar durante 10 minutos a 60 ° C y enfriarlas inmediatamente en hielo durante 2 minutos.</li>
	<li>
A la alícuota del RNA, añadir los reactivos que se mencionan a continuación en el siguiente orden: 600 μl de tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O, 100 μl de tampón de Biotinilación (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] y 10 mM EDTA, tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O) y 200 μL de biotina-HPDP de un stock de 1 mg/mL biotina-HPDP en DMSO o DMF.
	<ol>
<li>En algunas situaciones, la solución de biotina HPDP tiende a precipitar, es probable que debido a su baja solubilidad en agua. En esta situación, aumentar el volumen de DMSO/DMF hasta un 40% del volumen de la reacción (a la muestra de RNA, añadir 400 μL de tratada con DEPC H2O, 100 μl de buffer de Biotinilación y 400 μL de biotina HPDP de un stock de 0, 5 mg/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar la muestra a temperatura ambiente y protegido de la luz por 3 horas, con agitación suave.</li>
	<li>Después de la incubación, añadir un volumen aproximadamente igual de cloroformo en los tubos y mezclar vigorosamente.</li>
	<li>Girar la muestra a 13.000 x g durante 5 minutos, a 4 ° C. Este paso permite la eliminación de exceso biotina que no biotinylate el ARN. Por otra parte, realizar este paso mediante tubos de fase de bloqueo (pesados). Para ello, girar por los tubos de la fase de bloqueo durante 1 min a 13.000 x g, añadir la mezcla de RNA y una cantidad igual de cloroformo, Mezclar vigorosamente y centrifugar a 13.000 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente transferir la fase superior a nuevos tubos de 2 mL.</li>
	<li>Añadir una décima parte del volumen de 5 M NaCl y mezclar la muestra.</li>
	<li>Añadir un volumen igual de isopropanol, mezclar bien la muestra y exprimir a 13.000 x g durante al menos 30 minutos, a 4 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y agregar 1 mL de etanol 75% helada.</li>
	<li>Vuelta a 13.000 x g durante 10 min, 4 ° c.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante, rápido-hacer girar el tubo y la solución restante de etanol. Asegúrese de que no secar el pellet de RNA.</li>
	<li>Suspender el ARN en 100 μl de tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O.</li>
</ol>5. purificación de la fracción recién sintetizado del ARN Total y sin etiqueta con bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina
<ol><li>Calor biotinilado RNA durante 10 min a 65 ° C y luego enfriar las muestras en hielo durante 5 minutos.</li>
	<li>Añadir 100 μl de bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina a biotinilado RNA (en un volumen final de 200 μL). Específicamente, se recomienda utilizar las cuentas indicadas en la Tabla de materiales, ya que, después de conversaciones con otros laboratorios, estos parecían ser más consistente y confiable.</li>
	<li>Incubar la muestra con agitación leve durante 90 minutos, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Colocar las columnas con el kit (Tabla de materiales) en el soporte magnético.</li>
	<li>Agregar 900 μl de tampón de lavado temperatura (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], EDTA 10 mM, 1 M NaCl y 0,1% Tween 20, tratada con DEPC, libre de ARNasa H2O) a las columnas (de funcionamiento previo y equilibrar).</li>
	<li>Aplique la mezcla de granos ARN (200 μL) a las columnas.</li>
	<li>Recoge el flujo a través de tubos de 1,5 mL y aplicarlo de nuevo a la misma columna magnética. Si es necesario, mantenga este paso que representa la fracción de RNA sin etiqueta.</li>
	<li>Lavar las columnas 5 x con el aumento de volúmenes de tampón de lavado (600, 700, 800, 900 y 1000 μL).</li>
	<li>Eluir el RNA recién sintetizado con 200 μL de 0,1 M TDT.</li>
	<li>Realizar una segunda elución, 3 minutos más tarde, con un volumen igual de 0,1 M TDT.</li>
	<li>Después de liberador del RNA, Añadir 0,1 volúmenes de 3 M NaOAc (pH 5,2), 2 μl de glucógeno 20 mg/mL (RNA-grado) y 3 volúmenes de helados 100% de etanol y dejar el RNA precipitado durante la noche, a-20 ° C.</li>
	<li>El ARN se recuperan por centrifugación (13.000 x g durante 10 minutos, a 4 ° C) y resuspender en 15 μl de tratada con DEPC, libre de ARNasa H20. La proporción de ARN marcado en total se espera que alrededor 2% - 4% (generalmente más hacia el extremo inferior), haciendo aproximadamente 2.0 μg de RNA recién sintetizada. Esta cantidad es suficiente para hacer varios experimentos de qPCR, así como para análisis de microarray de la secuencia.</li>
</ol>6. RT-qPCR validación de las diferentes fracciones
<ol><li>Sintetizar el cDNA de 2 μg de ARN total o 10 μl de ARN marcados con random hexamers y la transcriptasa reversa de la opción, según las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).</li>
	<li>Amplifican el cDNA por qPCR en tiempo real usando un protocolo estándar (Tabla de materiales). Nota: Todas las muestras se llevará por triplicado de un mínimo de dos réplicas biológicas. Corregir todos los valores de materia prima para la expresión de S. pombe tubulina.</li>
</ol>7. microarrays de hibridación
<ol><li>Hibridar las muestras de RNA en chips de microarray recomendado: según las instrucciones del fabricante (para este protocolo específico, consulte la Tabla de materiales). Brevemente, preparar biotinilado cRNA objetivos de 150 ng de ARN usando el Premier Kit de amplificación de ARN (Tabla de materiales), según las instrucciones del fabricante. Hibridar 4 mg de anestesistas fragmentada de 16 h a 45 ° C y 60 rpm en los chips de microarray.</li>
	<li>Lavar, mancha y analizar las fichas con la estación indicada y escáner (Tabla de materiales). Extraer los datos raws (archivos de CEL intensidad) de las imágenes escaneadas utilizando la consola de comandos (AGCC, versión 4.1.2).</li>
	<li>Otro proceso de los archivos del CEL con versión de software de expresión consola 1.4.1 para calcular la sonda establece intensidades de la señal, usando los algoritmos basados en estadísticas MAS 5.0 con ajustes predeterminados y de escala global como método de normalización. Nota: La intensidad de blanco medio ajustado de cada chip se estableció arbitrariamente en 100. Realizar todos los experimentos usando al menos dos réplicas biológicas independientes. Normalizar datos en bruto a la señal de S. pombe y calcular veces cambios en los niveles de RNA total y recién sintetizados.</li>
</ol>8. los datos el análisis usando una tubería existente de R
<ol><li>Calcular síntesis y decaimiento de las tasas mediante un oleoducto y un paquete de R/Bioconductor públicamente disponible, como se describió anteriormente8,10.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mientras todavía están mejorando herramientas de genoma para analizar cambios en la transcripción, el único análisis de transcriptoma a través de la cuantificación de los niveles de estado estacionario del ARN podría no reflejan cambios en la actividad de RNA polimerasa II. De hecho, niveles de ARNm están regulados no sólo por la síntesis de ARN, sino también por su maduración y degradación. Para medir la síntesis de mRNA desacoplado de la degradación del mRNA, distintos protocolos se han desarrollado en los últimos años...

Las células responden a estímulos endógenos y exógenos, a través de la alteración de la dinámica de su programa de expresión génica. En los últimos años un enorme desarrollo de metodologías de genoma permite la descripción precisa y completa de transcriptoma cambios en diferentes condiciones. En la mayoría de los estudios de transcriptómicos, microarray hibridación o alto rendimiento de secuenciación se utilizan para cuantificar niveles de ARN de una fracción de RNA total de estado estacionario. Cambios transcripcionales bajo una perturbación específica pueden mostrar una amplia gama de resultados posibles, con un amplio espectro de genes ser para arriba - u o o cambios de expresión del gen específico. Expresión génica es el resultado de un equilibrio optimizado, o estado estacionario, entre la síntesis de RNA por polimerasas del RNA y otros procesos que afectan a niveles de ARN. Transcripción de ARN polimerasa II, incluyendo sus tres fases (iniciación, elongación y terminación), es altamente y estrechamente asociado con procesamiento de mRNA, exportación citoplasmática, traducción y degradación.
Varios estudios recientes demostraron que descomposición y síntesis de mRNAs son mecanismos acoplados y demostraron que efectos transcripcionales a mutación o bajo estímulos pueden ser pasado por alto cuando la cuantificación de ARN total de estado estacionario. En primer lugar, la detección de cambios transcripcionales a través de los análisis de los niveles de estado estacionario de mRNA siempre depende de mRNAs Half-Life. Una vez que la perturbación se introduce, los niveles de estado estacionario de mRNAs con vida media larga se verá afectados mucho menos que los mRNAs con una vida media corta. Por lo tanto, la detección de los cambios en la síntesis de ARN es sesgada fuertemente a favor de las transcripciones de breve duración, mientras que el análisis de especies de mRNA perdurable puede no revelar cambios dinámicos en la tasa de transcripción. En segundo lugar, varios informes han demostrado que, tanto en levaduras y mamíferos, cambios globales en la transcripción pueden ser pasado por alto al analizar los niveles de estado estacionario de mRNA. Esto es probablemente debido a los mecanismos que vinculan la síntesis de mRNA y degradación resultante en mRNA buffering. Esto incitó el desarrollo de nuevos protocolos para cuantificar la síntesis de mRNA desacoplado de la degradación, a través del análisis del ARNm recién transcrita. En los últimos años, se presentan varias alternativas, incluyendo la secuencia funcionamiento global (GRO-seq)1y transcripción elongación nativo secuenciación (NET-seq)2,3. Aquí, presentamos un protocolo, desarrollado inicialmente en células de mamíferos4,5,6 y luego adaptado a levadura7,8,9,10, 11, que se basa en RNA etiquetado con un nucleósido thiolated o base analógica, 4-thiouridine (4sU) o 4-tiouracilo (4tU), respectivamente.
Este método específicamente purifica ARN recién transcrito de las células en el que ARN son pulso marcado con 4sU prácticamente sin interferencia en la homeostasis celular. Por lo tanto, una vez que las células se exponen a 4sU, la molécula es rápidamente captados, fosforila a 4sU-trifosfato e incorporada en el ARN se transcribe. Una vez que pulso marcado, es posible extraer ARN celular total (correspondientes a niveles de estado estacionario del ARN) y, posteriormente, la fracción de RNA marcado con 4sU es tiol-específicamente modificado, dando lugar a la formación de un enlace disulfuro entre biotina y recién transcrito RNA4,5. Sin embargo, 4sU sólo pueden ser captados por las células expresando un transportador de nucleósidos, como el transportador de nucleósidos equilibrative humano (hENT1), impidiendo su uso inmediato en la levadura de gemación o fisión. Mientras que uno podría expresar hENT1 en S. pombe o en S. cerevisiae, se logra un acercamiento más fácil utilizando el 4tU base modificado, puesto que las células de levadura pueden tomar 4tU, sin la necesidad de expresión de un transportador de nucleósidos10, 11 , 12 , 13. de hecho, el metabolismo de 4tU requiere la actividad de la enzima uracilo fosforribosiltransferasa (UPRT). En varios organismos, incluyendo la levadura pero no mamíferos, UPRT es esencial para una vía de salvamento de pirimidina, reciclaje uracilo a monofosfato de uridina.
Un importante sesgo en estudios transcriptómicos puede ser introducido por la normalización entre diferentes muestras analizadas en paralelo. De hecho, muchos factores de la desviación pueden afectar el análisis comparativo del transcriptoma de cepas de tipo salvaje y mutante: la eficiencia de la lisis celular, las diferencias en la extracción y recuperación del RNA y las variaciones en la calibración del escáner para análisis de microarray , entre otros. Como hemos comentado anteriormente, estas variaciones pueden ser particularmente engañosas cuando se espera que los efectos globales en la transcripción del RNA polimerasa II. Un medio elegante para comparar con precisión las tasas de síntesis de mRNA entre diferentes muestras fue diseñado mediante el uso de la levadura del distante relacionado fisión Schizosaccharomyces pombe como estándar interno. Para ello, un número fijo de etiquetado S. pombe células se añade a las muestras de S. cerevisiae , células de tipo salvaje o mutantes, antes de la lisis celular y extracción de RNA10. Posteriormente, estado estacionario y recién sintetizados RNAs de S. pombe y S. cerevisiae se cuantifican por RT-qPCR o mediante el uso de chips de microarray o secuenciación de alto rendimiento10. Combinando estos datos con el modelado cinético, se pueden medir tasas absolutas de la síntesis de mRNA y decaimiento en levadura de florecimiento.
En el marco de este manuscrito, nos mostrará cómo el análisis del ARN recién transcrito permitió revelar un papel global para los complejos del coactivator SAGA y TFIID transcripción del RNA polimerasa II en florecimiento levadura14,15, 16. Lo importante, últimos estudios cuantificaron niveles de mRNA de estado estacionario en S. cerevisiae y sugirieron que SAGA desempeña una función predominante en un conjunto limitado de genes de levadura que son fuertemente afectadas por mutaciones en SAGA pero relativamente resistente a TFIID las mutaciones17,18,19. Sorprendentemente, las actividades enzimáticas de la SAGA fueron demostradas para actuar sobre el genoma transcrito entero, sugiriendo un papel más amplio para este coactivador en la transcripción del RNA polimerasa II. Se observó menor reclutamiento de RNA polimerasa II en genes más expresados sobre la inactivación de la SAGA o TFIID, sugiriendo que estos activación trabaja juntos en la mayoría de los genes. Por lo tanto, la cuantificación de ARNm recién transcrita reveló que SAGA y TFIID son necesarios para la transcripción de casi todos los genes de la RNA polimerasa II14,15,16. La implementación de mecanismos de compensación surge como una forma de las células hacer frente a una disminución global en la síntesis de mRNA que es protegida por una simultánea disminución global en la degradación del mRNA. SAGA suma a la lista de factores con un efecto global en la transcripción del RNA polimerasa II, como subunidades de ARN Pol II10, el mediador del coactivator complejo20, el general transcripción factor TFIIH21,22 e indirectamente, elementos de mRNA degradación maquinaria9,10,23. Tales eventos compensatorios universalmente fueron observadas en mutantes de la SAGA, son responsables de los cambios en los niveles de mRNA de estado estable a pesar de una disminución global y severo de la síntesis de mRNA14modestos y limitados. Análisis similares se realizaron en una cepa de eliminación BRE1 , resultando en una pérdida completa de ubiquitinación de histona H2B. Curiosamente, un mucho más suave pero consistente efecto global en la transcripción del RNA polimerasa II se podría detectar en ausencia de Bre1, indicando que el etiquetado metabólico del ARN recién transcrito en la levadura puede detectar y cuantificar una gran variedad de cambios en el ARNm tasas de síntesis.

<table><tbody><tr><td>4-Tiouracilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gato# 440736</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Euromedex</td><td>Cat# SYN-1185</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contador de células automatizado</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de ARN RiboPure, levadura</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM1926</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Espectrofotómetro</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Kit sin ADN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link HPDP Biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 21341</td><td></td></tr><tr><td>Tiolutina</td><td>Abcam</td><td>ab143556</td><td></td></tr><tr><td>&micro; MACS Kit de estreptavidina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-074-101</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptor Transcriptasa Inversa</td><td>Roche</td><td>03 531 295 001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Levadura Genome 2.0</td><td>ThermoFisher</td><td>900555</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Estación de fluidos 450</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0079</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Escáner 3000 7G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0210</td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mrna recién sintetizada como un proxy para la actividad de arn polimerasa ii

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Globales defectos en la transcripción del RNA polimerasa II podrían dominados por transcriptómicos estudios análisis de RNA de estado estacionario. De hecho, la disminución global en la síntesis de ARNm ha demostrado ser compensado por una disminución simultánea en la degradación del mRNA para restaurar los niveles de estado estacionario normales. Por lo tanto, la cuantificación del genoma de la síntesis de mRNA, independientemente del decaimiento del mRNA, es el mejor reflejo directo de la actividad transcripcional de RNA polimerasa II. Aquí, discutimos un método usando el etiquetado metabólico no perturbar de ARN naciente en Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). En concreto, las células se cultivan para el minuto 6 con un uracilo analógico, 4-tiouracilo y el etiquetado ARN recién transcrito es purificado y cuantificado para determinar las tasas de síntesis de los ARNm individuales. Por otra parte, utilizando etiquetado Schizosaccharomyces pombe células como estándar interno permite comparar la síntesis de mRNA en S. cerevisiae de diferentes cepas. Usando este protocolo y montaje de los datos con un modelo cinético dinámico, se pueden determinar las tasas de decaimiento de ARNm correspondiente.

Cuando se realiza el etiquetado metabólico del ARN recién transcrito, varios aspectos que controlar: el tiempo y la eficiencia de la rotulación, la proporción de espiga en, el protocolo de extracción y la eficacia de Biotinilación (incluyendo signal to noise ratio), entre otros. Estas condiciones han sido extensivamente y metódicamente demostradas por otros7,10,11. Aquí nos centramos principalmen...

El protocolo aquí descrito se basa en la cuantificación del genoma de mRNA recién sintetizada purificada de células de levadura con 4-tiouracilo. Este método permite para medir la síntesis de mRNA desacoplado del decaimiento del mRNA y por lo tanto, proporciona una medida exacta de la transcripción del RNA polimerasa II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

La principal ventaja de esta técnica es que refleja la actividad del ARN polimerasa II midiendo el ARNm recién sintetizado que no están influenciados por la degradación del ARN. Este protocolo se describió originalmente mediante hibridación de microarray, pero se puede adoptar fácilmente para una secuenciación a través del ARNm recién transcrito. Demostrar este procedimiento estará Tiago Baptista, un ex estudiante de posgrado de nuestro laboratorio.Después de inocular las células de S.cerevisiae, cultivarlas durante la noche a 30 grados Celsius con agitación constante a 150 RPM. Al día siguiente, mida la densidad óptica a 600 nanómetros. Diluir el cultivo a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 100 mililitros de medio YPD.Crecer las células hasta que el OD600 es alrededor de 0.8. Después de esto, medir el OD600 del cultivo de la noche S.pombe. Diluir este cultivo a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 500 mililitros de medio YAS y dejar que crezca hasta que el OD600 sea aproximadamente 0,8.En primer lugar, preparar una solución fresca de dos molares de cuatro tiouracil. Mantenga la solución preparada a temperatura ambiente y protegida de la luz. Añadir la solución de cuatro tiuralolos a los cultivos S.cerevisiae y S.pombe de forma que la concentración final sea de cinco mililitros.Incubar los cultivos S.cerevisiae y S.pombe a 30 grados centígrados y 32 grados centígrados respectivamente con agitación constante durante seis minutos. Después de esto, retire una pequeña alícuota de cada cultivo y cuente las células usando un contador celular automático o una cámara Neubauer. Centrifugar a 2.500 veces g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para recoger las células.Deseche el sobrenadante y lave las células con hielo frío una vez PBS. Centrifugar de nuevo a 2.500 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, resuspender las células en cinco mililitros de hielo frío una vez PBS.Mezclar las células S.cerevisiae y S.pombe en una proporción de tres a uno. Centrifugar las muestras mezcladas a 2.500 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, retire el PBS y congele las células en nitrógeno líquido.Almacene la muestra a 80 grados Celsius negativos hasta que esté lista para su uso. Cuando esté listo para continuar, descongele las células sobre hielo durante aproximadamente 20 a 30 minutos. Utilice un kit de extracción de ARN de levadura adaptado para extraer el ARN como se describe en el protocolo de texto.Después de esto, transfiera el cartucho del filtro al tubo de recogida final. Eluda el ARN con 50 microlitros de agua libre de RNase tratada con DEPC que se precalentaba a 100 grados centígrados. Centrífuga a 16.000 g durante un minuto.A continuación, utilice 50 microlitros de agua libre de RNase tratada con DEPC precalentada para eluir el ARN de nuevo al mismo tubo. Centrifugar a 16.000 veces g durante un minuto asegurándose de que todo el volumen de la muestra haya pasado a través del filtro. Si no lo ha hecho, centrifugar de nuevo durante un período de tiempo más largo.Cuando haya terminado, cuantifique y compruebe la pureza de la muestra utilizando el equipo adecuado. Utilice agua libre de nucleasa tratada con DEPC para ajustar la concentración del ARN adquirido anteriormente a dos miligramos por mililitro. Aliquot 200 microgramos de ARN total y calentarlo a 60 grados Celsius durante 10 minutos.Enfríe inmediatamente sobre hielo durante dos minutos. Agregue 600 microlitros de agua libre de RNase tratada con DEPC. Añadir 100 microlitros de tampón de biotinilación y luego añadir 200 microlitros de biotina HPDP.Si la solución HPDP de biotina se precipita fuera de la solución, aumente el volumen de DMSO o DMF hasta un 40% del volumen de reacción como se describe en el protocolo de texto. Proteja la muestra de la luz e incubarla a temperatura ambiente con agitación suave durante tres horas. Después de esto, añadir un volumen aproximadamente igual de cloroformo a los tubos y mezclar vigorosamente.Centrifugar a 13.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, transfiera cuidadosamente la fase superior a nuevos tubos de dos mililitros. Añadir una cantidad de cinco cloruros de sodio molar igual a aproximadamente 1/10 del volumen de la muestra.A continuación, mezcle la muestra. Primero, calienta el ARN biotinilado a 65 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, enfríe las muestras en hielo durante cinco minutos.Agregue 100 microlitros de cuentas magnéticas recubiertas de Streptavidin al ARN biotinilado. Incubar a temperatura ambiente con ligero temblor durante 90 minutos. Coloque las columnas provistas del kit en el soporte magnético.A continuación, agregue 900 microlitros de tampón de lavado a temperatura ambiente a las columnas. Aplique la mezcla de cordón de 200 microlitrotro y ARN en las columnas. Recoja el flujo a través en tubos de 1,5 mililitros y luego aplíquelo de nuevo a la misma columna magnética.Mantenga este flujo a través si es necesario, ya que representa la fracción de ARN sin etiquetar. Para comenzar la validación RT-qPCR de las diferentes fracciones, primero sintetice cDNA como se describe en el texto. A continuación, amplifique el ADNc mediante qPCR en tiempo real utilizando un protocolo estándar.Los niveles medidos de transcripciones en fracciones purificadas a partir de células de tipo salvaje cultivadas con y sin cuatro tiouracidas confirmaron este procedimiento purifica específicamente el ARN etiquetado. El análisis de la cepa delta spt20 revela que la cantidad de ARN total en estado estacionario no cambia en gran medida o sólo se reduce ligeramente para los genes analizados. Se observan resultados similares para las cepas eliminadas para bre1.Sin embargo, el análisis del ARN recién transcrito en la cepa delta spt20 revela una disminución de tres a cinco veces en la síntesis de ARNm para todos los genes probados. Mientras tanto, la pérdida de bre1 conduce a una disminución más discreta pero aún visible. Tras el agotamiento inducible de spt7, una subunidad estructural del complejo de la saga, los niveles de ARNm recién transcritos se reducen en una medida similar a la cepa de eliminación.Cuando los niveles totales de ARN se miden mediante análisis de todo el genoma, sólo unos pocos genes se ven alterados sus niveles de expresión tras la eliminación de spt20 ya sea regulando hacia arriba o regulando hacia abajo. Sin embargo, el análisis del ARN recién transcrito revela que los niveles de más de 4.000 genes se reducen significativamente al menos dos veces al delegar el spt20, lo que sugiere un efecto positivo global de la saga en la transcripción de ARN polimerasa II en levaduras en ciernes. Aunque este método puede proporcionar información sobre la transcripción en Saccharomyces cerevisiae, sólo se aplicó con ligeras variaciones al usar este protocolo, pudimos detectar una disminución global en la síntesis de ARNm que fue compensada por una disminución global en la degradación del ARNm.

saccharomyces-cerevisiae-metabolic-labeling-with-4-thiouracil

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El ARN celular total proporciona una plantilla pobres para el estudio de los cambios a corto plazo en la síntesis de ARN y la descomposición, así como la cinética de procesamiento del ARN. A continuación, describimos marcaje metabólico de ARN recién transcrito con 4-tiouridina seguido por biotinilación específico de tiol y la purificación de ARN recién transcrito que permiten superar estas limitaciones.

Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

Este protocolo describe un procedimiento experimental para la realización de...

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este artículo describe el uso de una proteína de fusión luciferasa de luciérnaga-GFP para...

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

El nivel de estado estacionario de ARNm específicos se determina por la velocidad de síntesis y la descomposición del ARNm. Las tasas de degradación de ARNm de todo el genoma o las tasas de descomposición de ARNm específicos se pueden medir mediante la determinación de ARNm de vida media. Este protocolo se centra en la medición de las tasas de descomposición de ARNm en Saccharomyces cerevisiae.

La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

El uso de uracilo tiolado para purificar sensible y específicamente el ARN recién transcrito de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Etiquetado metabólico extremadamente rápido y específico de ARN In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU)

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

Describimos dos protocolos complementarios para determinar con precisión la duración de la fase S en S. cerevisiae utilizando EdU, un análogo de la timidina, que se incorpora in vivo y se detecta mediante química Click por microscopía y citometría de flujo. Permite la fácil caracterización de la duración de la replicación del ADN y los defectos de replicación pasados por alto en los mutantes.

Determinación de la duración de la fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina en Saccharomyces cerevisiae

La estructura secundaria del ARN se ha observado principalmente en ARN maduro mediante métodos de sondeo estructural. La secuenciación de seguimiento de estructura co-transcripcional (CoSTseq) unifica el funcionamiento nuclear, que se ha utilizado para estudiar la posición de la polimerasa en ARN naciente, mediante sondeo estructural. CoSTseq permite así la observación de la estructura secundaria del ARN en ARN bajo transcripción activa.

Análisis comparativo de la estructura del ARN de transcritos nacientes y maduros en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a cuantificar mRNA recién sintetizado en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado con 4-tiouracilo. Este método permite medir la actividad de ARN polimerasa II separando la síntesis de la degradación del ARN.

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II (Video) | JoVE Journal

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

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