Name: Modelado enfermedad del Charcot-Marie-diente In Vitro por transferencia primaria Motoneurons de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende a modelar la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth mediante el aislamiento y transfección de motoneuronas primarias de ratón. Esta técnica permite estudiar mecanismos neurodegenerativos in vitro con alta pureza celular.

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Nos gustaría agradecer a la "Association pour le développement de la neurogénétique" para la beca Dr. Jacquier y AFM Telethon por su apoyo a través del plan estratégico MyoNeurAlp. También nos gustaría agradecer al Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul y Dr. Georg Haase, que participaron en el desarrollo y mejora de la técnica y difundir sus conocimientos.

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aceptados por el Comité de ética de la institución.
1. preparación de la solución
<ol><li>Preparar 10 mL de BSA dializaron en medio L-15 el 4%.<ol>
<li>Albúmina de suero bovino en polvo al 4% (w/v) se disuelven en 10 mL de medio de L-15.</li>
		<li>Añadir la solución en una casete de diálisis 20 mL con corte 20 kDa. Dializan contra 500 mL de medio de L-15 durante 3 días en agitación a 4 ° C. Cambiar el medio L-15 cada día.</li>
		<li>Filtrar la solución a través de 0,22 μm membrana y Alicuotar en tubos de 15 mL. Almacenar los tubos a-20 ° C. Nota: Este protocolo usa las siguientes referencias: medio de L-15 raw sin modificar = L-15 medio, ácido L-15 = pH L-15 y medio de L-15 base = L-15 bicarbonato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 200 mL de pH L-15.<ol>
<li>Ajustar el pH del medio L-15: en primer lugar, llenar una botella de lavado con algunos pedazos de hielo seco. Inyectar gas (CO2) en el medio de L-15 hasta que el color vuelve naranja (~ presiones pH 6.4 y ~ 40). El pH puede ajustarse también con un medidor de pH estándar.</li>
		<li>Filtrar el medio a través de un 0,22 μm membrana y almacenar a 4 ° C durante un mes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 100 mL de bicarbonato L-15.<ol>
<li>Añadir 2,5 mL de bicarbonato de sodio 7% a 97,5 mL de medio de L-15 y almacenar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar los suplementos de IPCS (insulina Putrescin Conalbumin selenita).<ol>
<li>Disolver 2,5 mg de insulina de 0,5 mL de 0.1 M HCl. agregar 4,5 mL de agua destilada doble.</li>
		<li>Disolver 8 mg de putrescina en 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
		<li>Disolver 100 mg de conalbumin en 10 mL de PBS.</li>
		<li>Disolver 1 mg de selenito de sodio en 19,3 mL de agua, ajustar el pH a 7.4 y la solución diluida 10 veces.</li>
		<li>Mezclar 1 mL de solución de insulina, 1 mL de solución de putrescina, 1 mL de conalbumin y 0,1 mL de solución de selenito de sodio para obtener 3,1 mL de solución de suplemento de IPCS. La solución a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una solución de 0,02 mM progesterona.<ol>
<li>Disolver 1 mg de progesterona en 1,6 mL de etanol al 80%.</li>
		<li>Diluir la solución 100-fold en 100% de etanol y almacenar a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 100 mL de medio completo L-15.<ol>
<li>Agregue 1.8 mL de D-glucosa solución 200 mg/mL a 92 mL de pH L-15 para obtener una concentración final de 3,5 mg/mL glucosa.</li>
		<li>Combinar 1 mL de 100 x penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL), 2 mL de suero de caballo inactivado con calor, 3,1 mL de mezcla IPCS y 0,1 mL de solución de progesterona (2 x 10-5 M).</li>
		<li>Filtrar el medio de una membrana de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 5 mL de solución de gradiente de densidad (concentración final de 5,5%) por experimento.<ol>
<li>Añadir 476 μl del medio de gradiente de densidad 60% comercial a 4524 μl de L-15 (si es posible, sin rojo fenol para aumentar el contraste visual en la interfase; relación de dilución de 1:10. 5).</li>
		<li>Almacenar la solución a 4 ° C durante 2 semanas o congelar a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 10 mL de medio de cultivo.<ol>
<li>Añadir 200 μL de medio de suplemento a 9,6 mL de medio de cultivo celular de la neurona.</li>
		<li>Añadir 200 μL de suero de caballo inactivado con calor (que tiende a distinguir trabajos contra la proliferación y precursores de células gliales) en 25 μl de glutamina y 10 μl de 2-Mercaptoetanol.</li>
		<li>Filtro de los medios de comunicación a través de un filtro de 0,22 μm.</li>
		<li>Agregar los siguientes factores neurotróficos: factor neurotrófico ciliar (CNTF) a una concentración final de 10 ng/mL y el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) y el factor neurotrópico derivado de células gliales (GDNF) en concentraciones finales de 1 ng/mL.</li>
		<li>Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 50 mL de medio de disección.<ol>
<li>Añadir 2.25 mL de glucosa (200 mg/mL) a 47,05 mL de HBSS. Añadir 700 μl de 1 M HEPES con pH 7,4. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una solución PFA 4%.<ol>
<li>Disolver 20 g de PFA en 500 mL de PBS.</li>
		<li>Debajo de una campana química, calentar la solución a 60 ° C y añadir unas gotas de 1 M NaOH hasta que la solución sea clara.</li>
		<li>La solución a través de un filtro de papel del filtro y ajustar el pH a 7.2. Almacenar a-20 ° C. Nota: Alternativamente, otras soluciones comerciales de PFA pueden ser utilizados y diluidos al 4% en PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpiar las herramientas de disección como el fórceps, tijeras y silicona platos con etanol al 70% antes de su uso y con jabón y agua limpia después del uso.</li>
</ol>2. poly-ornitina/laminina (Po/L) plato capa
Nota: Volúmenes están adaptados para cubrir una placa de 24 pozos.
<ol><li>Si es necesario, poner un cubreobjetos estéril 12 m m en el pozo.</li>
	<li>Cubrir los pocillos con 500 μl de solución de μg/mL Poly-L-ornitina 10 disuelto en agua.</li>
	<li>Que los pozos reposar 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retirar la solución de la polivinílico-L-ornitina y deje secar al aire durante 30 minutos.</li>
	<li>Cubrir los pocillos durante la noche a 37 ° C con 500 μl de 3 μg/mL laminina en bicarbonato L-15. Nota: Pozos pueden almacenarse a 37 ° C por 7 días en la incubadora. Para incubaciones largas, añadir PBS estéril entre los pocillos puede ayudar a evitar la evaporación media.</li>
</ol>3. disección
<ol><li>Sacrificar un ratón embarazado cuando los embriones están en fase embrionaria E12.5. Limpiar el vientre con etanol al 70%.</li>
	<li>El útero cortando los dos oviductos y la vagina y colocarlos en una placa de Petri con PBS frío (sin Ca2 + Mg2 +).</li>
	<li>Recoger todos los embriones y transferirlos al fresco, PBS frío (sin Ca2 + Mg2 +) en una placa Petri.</li>
	<li>Poner un embrión en un plato cubierto con silicona y lleno de medios de disección (con HBSS, glucosa de 4.5 g/L y 7 mM HEPES pH 7.4). Nota: Disección de embriones se realiza bajo el microscopio utilizando tijeras y pinzas limpias bien. Alternativamente, puede utilizarse un plato de Petri regular sin silicona para disección.</li>
	<li>Quitar la cabeza, cola y vísceras, con unas pinzas como tijeras.</li>
	<li>Mantener el embrión con el vientre contra la silicona con el fórceps.</li>
	<li>Con un segundo par de pinzas, inserte uno de los consejos en el canal central de la médula espinal rostral.</li>
	<li>Cerrar las pinzas para romper el tejido dorsal unos milímetros.</li>
	<li>Repetir esta operación hacia el lado caudal hasta la médula espinal entera (figura 1B).</li>
	<li>Separar la parte rostral de la médula espinal (tronco cerebral) del cuerpo.</li>
	<li>Gire el embrión para mantener la médula espinal abierta contra la silicona.</li>
	<li>Pellizque la parte rostral de la médula espinal y tirando la cabeza para extraer la médula espinal del embrión. Nota: Meninges y ganglios de raíz dorsal (GRD) deben permanecer pegados al embrión. De lo contrario, cuidadosamente separe cualquier resto de meninges y GRD todavía unido a la médula espinal. En este paso, GRD también se recaudaban para cultura sensible neurona (ver discusión).</li>
	<li>Aplanar la médula espinal en la silicona y sacar la mitad dorsal de la médula por el corte a lo largo de cada lado con un bisturí. Corte la parte media en 10 trozos con un bisturí y transferir las piezas a un tubo nuevo.</li>
</ol>4. médula espinal células suspensión
<ol><li>Repita este procedimiento de disección en médulas espinales de 6 a 8.</li>
	<li>Que la médula espinal recoge en la parte inferior del tubo y reemplazar la HBSS con 1 mL de medio de jamón-F10.</li>
	<li>Añadir 10 μl de la tripsina (2.5% p/v; 0.025% de concentración final). Incubar los tubos durante 10 min a 37 ° C.</li>
	<li>Para detener la digestión enzimática, transferencia de los fragmentos a un nuevo tubo de 15 mL que contiene 800 μl de medio completo L-15, 100 μl de 4% (w/v) BSA y 100 μl de DNasa (1 mg/mL en medio L-15).</li>
	<li>Triturate aspirando dos veces 1 mL con una pipeta P1000. Que los fragmentos reposar 2 minutos recoger el sobrenadante en un nuevo tubo 15 mL.</li>
	<li>A los fragmentos, agregar 900 μl de medio completo L-15, 100 μl de 4% (w/v) BSA y 100 μl de DNasa (1 mg/mL en medio L-15).</li>
	<li>Triturate 6 veces aspirando 1 mL con una pipeta P1000. Que los fragmentos reposar 2 minutos añadir el sobrenadante en el tubo de 15 mL obtenido en el paso 4.5.</li>
	<li>A los fragmentos, agregar 900 μl de medio completo L-15, 100 μl de 4% (w/v) BSA y 100 μl de DNasa (1 mg/mL en medio L-15).</li>
	<li>Triturate 10 veces por aspirar 1 mL con una pipeta P1000. Que los fragmentos reposar 2 minutos añadir el sobrenadante en el tubo de 15 mL obtenido en el paso 4.5. Proceder con el sobrenadante.</li>
	<li>Utilizando una pipeta P1000, Coloque suavemente un cojín de 4% (w/v) 2 mL BSA en la parte inferior del tubo flotante. Centrifugue a 470 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células con 2 mL de medio completo L-15.</li>
</ol>5. MN enriquecimiento por gradiente de densidad
<ol><li>La suspensión de células se dividió en dos tubos de 15 mL (1 mL). Luego, agregar 2 mL de medio completo L-15. Si a partir de 6 embriones, utilizar el equivalente de 3 embriones por tubo en 3 mL de medio.</li>
	<li>Añadir 2 mL de solución de gradiente de densidad agregando lentamente la solución a la parte inferior de cada tubo para obtener una interfaz de sharp.</li>
	<li>Centrifugue a 830 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Después de este paso, pequeñas células deben ser en la parte inferior del tubo, que conviene células grandes como MNs en la interfaz de media solución gradiente de densidad.</li>
	<li>Recoger las células en la interfase por aspiración 1 o 2 mL y transferir a un nuevo tubo 15 mL. Ajustar el volumen a 10 mL con medio de pH L-15.</li>
	<li>Añadir 2 mL de la almohadilla de BSA de 4% a los fondos del tubo y centrifugar a 470 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 3 mL de medio completo L-15.</li>
	<li>Repita el paso 5.5.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 2 mL de medio de cultivo completo. Cuenta el numero de celular y viabilidad bajo un microscopio de contraste de fase con un hemocitómetro. Nota: Para 6 cables de espinal, el número de células se espera que sea alrededor de 1 x 105 MNs.</li>
</ol>6. MN cultura
<ol><li>Diluir el MNs a la densidad adecuada, generalmente de 5.000 a 10.000 células en 500 μl de medio de cultivo por pozo en una placa de 24 pozos. Nota: Densidad de siembra es alrededor 1.500 y 30.000 células para placas de 6 y 96 pocillos, respectivamente.</li>
	<li>Retirar la solución de laminina con una P1000.</li>
	<li>Transferir inmediatamente el MNs diluidos en medio de cultivo en las placas de revestimiento para evitar que se sequen.</li>
	<li>Incubar el cultivo durante 2 días a 37 ° C.</li>
</ol>7. Magnetofection de MNs
Nota: En los pasos siguientes, las cantidades utilizadas sirven para la transfección de un pozo de una placa de 24 pocillos. Consulte el protocolo del fabricante para otro formato.
<ol><li>Para la preparación de ADN, resuspender 1 μg de ADN en 50 μl de medio de cultivo neuronal y de vortex durante 5 s.</li>
	<li>Para la preparación del tubo de grano, resuspender 1,5 μl de granos en 50 μl de medio de cultivo neuronal.</li>
	<li>Añadir la solución de grano 50 μl de la solución de ADN de 50 μl e incubar por 20 min a temperatura ambiente (volumen total = 100 μL).</li>
	<li>Durante la incubación, retirar 100 μl de medio de cultivo del pozo que se transfectadas. Nota: Coloque la placa magnética en la incubadora para calentar a 37 ° C.</li>
	<li>Transferir 100 μl de la mezcla de ADN/tira al pozo e incubar la placa 20-30 min en la placa magnética a 37 ° C.</li>
	<li>Espere al menos 24 h antes de la detección de la expresión de cDNA.</li>
</ol>8. fijación y tinción
<ol><li>Lave la cultura 2 veces con PBS.</li>
	<li>Incubar el cultivo por 20 min a temperatura ambiente en 4% PFA/PBS.</li>
	<li>Lave la cultura 2 veces con PBS.</li>
	<li>Incubar el cultivo en 500 μl de solución amortiguadora de bloqueo (PBS BSA 4%, 2% de suero normal, 0,3% Tritón X-100, 0,1 M glicina) por 1 h a temperatura ambiente. Nota: Suero Normal debe derivarse de la misma especie que el anticuerpo secundario (p. ej., suero de cabra Normal).</li>
	<li>Incubar el cultivo durante la noche a 4 ° C con anticuerpo primario diluido en 250 μl de solución amortiguadora de bloqueo. Nota: por ejemplo, TUJ1 se utiliza en 1/1000, SMI32 se utiliza en 1/1.000 y Lc3b se utiliza a 1/200.</li>
	<li>Lave la cultura 3 veces con PBS.</li>
	<li>Incubar el cultivo con anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo diluidos en 250 μl de solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave la cultura 3 veces con PBS.</li>
	<li>Montar en portaobjetos de vidrio con medio de montaje.</li>
</ol>

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<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Uno de los puntos críticos de este protocolo es que se disecan los embriones de ratón en una ventana de tiempo preciso durante el desarrollo (E12.5) para optimizar la cantidad de MNs obtenida al final. Además, para un rendimiento óptimo, la disección debe realizarse por la mañana o temprano por la tarde. Antes de E12.5 (por ejemplo, en E11.5), la disección es difícil, especialmente con respecto a la eliminación de las meninges. Después de E12.5, el número de MNs obtenidas cae significativamente. Para controlar l...

Enfermedades neuromusculares abarcan una gran variedad de patologías clínicamente y genéticamente distintos que se caracterizan por la alteración del músculo o del sistema nervioso. Debido a los avances en tecnologías de secuenciación, se han identificado cientos de genes responsables de estas enfermedades raras durante la última década (lista disponible en el centro de enfermedad Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La variedad de mutaciones identificadas indica que diferentes mutaciones en un solo gen pueden producir diferentes fenotipos y enfermedades1,2,3 y que las mutaciones en distintos genes pueden producir fenotipos similares 4 , 5. en este contexto, hay esfuerzos para el desarrollo de modelos celulares que pueden convertirse en poderosas herramientas para el análisis de las consecuencias de la mutación y mecanismos patológicos.
MNs espinales tienen grandes somas en los cuernos ventrales de la médula espinal, axones largos forma a las fibras de músculo esqueléticas y permitir movimientos voluntarios a través de la liberación de acetilcolina en uniones neuromusculares. Desde MNs están afectados por enfermedades neuromusculares como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT), y la atrofia muscular espinal, Dr. Henderson y colegas desarrollaron el primer protocolo6 que permitió para el cultivo de in vitro espinales MNs y el descubrimiento de neurotrophic del factor GDNF7 (factor neurotrófico derivado de células gliales). Ajustes técnicos desde entonces han permitido la purificación más precisa de MNs espinales y sus subtipos utilizando FACS8y enriquecimiento por gradiente de densidad sigue siendo potente y ampliamente utilizado en laboratorios trabajando con MNs espinales primarias 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. posteriormente, también es posible obtener un mayor grado de purificación de MN a través de immunopanning tomando ventaja del marcador superficial p75(NTR)15,16,17.
La médula espinal contiene diferentes subtipos de MNs cervicales, torácicas y lumbares, así como columnas motor medianas y lateral que difieren según su ubicación en el cuerno anterior en un eje dorsoventral y entre los blancos inervan8, 18. las culturas MN primaria pueden recuperar todos estos subtipos de MN en proporciones fisiológicas. La principal limitación de esta técnica es el bajo número de MNs obtenidos al final del procedimiento. de hecho, puede esperarse obtener alrededor de 105 MNs de seis embriones, que es conveniente para microscopía pero limitante para experimentos de bioquímica. Para llevar a cabo experimentos con subtipos más estandarizados y MNs abundante (> 106 células), embrionario MNs derivados de la célula de vástago deben ser considerados18.
Transfección de transgenes salvaje-tipo/mutante o precipitación genes endógenos en MNs primarias es una herramienta rápida y útil para descifrar las vías fisiopatológicas, especialmente cuando no están disponibles modelos de ratón. Magnetofection es una técnica de transferencia primaria las neuronas, similares a lipofection sin la neurotoxicidad relacionada. Además, transfección puede realizarse en neuronas maduras, después de varios días en vitro, a diferencia de técnicas de electroporación9. Sin embargo, una desventaja de esta técnica es que los granos unen los ácidos nucleicos en la cultura, causando ruido en el etiquetado de DAPI. Infección viral es probablemente la técnica más eficaz para transfectar MNs; sin embargo, magnetofection no requiere de ciertos procedimientos de seguridad necesarios para la producción viral y la infección celular.

<table><tbody><tr><td>MaterialPlato de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>disección de silicona Instrumentación</td> para <td>sistemas vivos</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td>Sylgard</td></tr><tr><td>cubreobjetos redondos</td><td>NeuVitro, Knittel vidrio</td><td>GG-12-Pre</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Slide a Lyzer casetes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>66030</td><td>20,000 MWCO ; 30 mL</td></tr><tr><td>Unidad de filtro</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>GP Filtros de jeringa estériles</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>placa de 4 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>167063</td><td>Nunclon Delta pinza</td></tr><tr>de<td>placa</td><td>tratada FST de Dumont</td><td>11252-20</td><td>#5</td></tr><tr><td>tijera</td> de pinza <td>FST de Dumont</td><td>14060-10</td> bisturí <td>de tijera</td></tr><tr><td></td><td>fina FST de Dumont</td><td>10035-20</td><td></td></tr><tr><td>bisturí</td> de hoja curva <td>FST by Dumont</td><td>10316-14</td><td>micro-cuchillo bisturí Placa de</td></tr><tr><td>Petri</td><td>Greiner</td><td>663102</td><td>&oslash; x h = 100 x 15</td></tr><tr><td>mm Tubo de polipropileno de 15 mL</td> Papel de filtro <td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Watman Círculo</td> de <td>1001125</td><td>, 125 mm de diámetro</td></tr><tr><td>portaobjetos de cámara de vidrio</td><td>Lab-Tek</td><td>154526</td><td>4 cámaras</td></tr><tr><td>Plásmido pCAGEN</td><td>Addgene</td><td>#11160</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Soluciones y medios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina</td> <td>sérica bovinaSigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-15 medio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415056</td><td></td></tr><tr><td>L-15 medio, sin fenol rojo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Conalbúmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Poly-DL-Ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>tripsina 2,5%, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Ca Mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>sin Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>bicarbonato sódico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo de células neuronales</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Neurobasal Plus</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampón 1 M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Medio radiante de densidad</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep</td></tr><tr><td>medio de suplemento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>A3582801 B-27 Plus</td></tr><tr><td>Suero de caballo inactivado por calor ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immuno fluorescencia</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X0515</td><td>sin Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>normal suero de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Colina Acetil Transferasa (CHAT)</td><td>Chemicon</td><td>Ab144P</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilamento H no fosforilado (SMI32)</td><td>Biolegends</td><td>SMI-32P</td><td>IF a 1/1000</td></tr><tr><td>Islote-1</td><td>DSHB</td><td>40.2D6</td><td></td></tr><tr><td>Islote-2</td><td>DSHB</td><td>39.4D5</td><td></td></tr><tr><td>Hb9</td><td>DSHB</td><td>81.5C10</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Vectashield</td><td>Vector Lab</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Beta3 tubulina (clon Tuj1)</td><td>Biolegends</td><td>801201</td><td>IF a 1/1000</td></tr><tr><td>Lc3b</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>#2775</td><td>IF a 1/200</td></tr></tbody></table>

modelado enfermedad del charcot-marie-diente in vitro por transferencia primaria motoneurons de ratón

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneración de espinales motoneuronas (MNs) está implicada en un amplio espectro de los trastornos neurológicos como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, atrofia muscular, que son asociados con atrofia muscular. Cultivos primarios de MNs espinales se han utilizado extensamente para demostrar la implicación de genes específicos en este tipo de enfermedades y caracterizar las consecuencias celulares de sus mutaciones. Esta cultura de modelos un MN primaria protocolo deriva de la obra seminal de Henderson y colegas hace más de veinte años. En primer lugar, detalle un método de disección de los cuernos anteriores de la médula espinal de un embrión de ratón y aislar el MNs de los vecinos las células utilizando un gradiente de densidad. A continuación, presentamos una nueva forma de transferencia eficiente MNs con plásmidos de expresión utilizando magnetofection. Finalmente, ilustramos cómo solucionar y immunostain primaria que mns mediante mutaciones de neurofilamentos que causan la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2, este protocolo muestra un enfoque cualitativo a la expresión de proteínas de interés y estudiar su participación en MN el crecimiento, mantenimiento y supervivencia.

Después de 24 horas en la cultura, motoneuronas (MNs) ya deben mostrar un crecimiento axonal importante (por lo menos 6 veces más que el tamaño del soma). En los días siguientes, axones deben seguir creciendo y la exhibición de ramificación (figura 2). Habrá diferentes morfologías debido a las especificidades del subtipo. Por ejemplo, media columna MNs que inervan los músculos axiales tienen axones más cortos y más ramificadas que columna lateral motor MNs qu...

El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.

Modelado enfermedad del Charcot-Marie-diente In Vitro por transferencia primaria Motoneurons de ratón

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Este método puede ayudar a abordar cuestiones clave en neurobiología, como la polaridad de las neuronas motoras, la orientación de axón, el tráfico de axones y los mecanismos neurodegenerativos. La principal ventaja de esta técnica es obtener un cultivo de neuronas motoras altamente enriquecido mientras tomamos para expresar nuestra proteína knockdown por minuto de afecto. Para comenzar este procedimiento, coloque un embrión en un plato de medios de disección codificados con silicio.Bajo el microscopio, sostenga el embrión con el abdomen contra el silicio con fórceps. Con el segundo par de fórceps, inserte una de las puntas en el canal central de la médula espinal rostrad. Luego, cierre los fórceps para desgarrar ligeramente el tejido dorsal.Repita esta operación hacia el lado de la connell hasta que se abra toda la médula espinal. A continuación, coloque el embrión de modo que la médula espinal abierta esté contra el silicio. Posteriormente, separar la parte rostrad de la médula espinal del cuerpo.Pinche la parte rostrad de la médula espinal y tire del embrión por la cabeza para extraer la médula espinal. Retire con cuidado las meninges y los DRG restantes que aún estén unidos a la médula espinal. Aplanar la médula espinal en el silicio y usando un bisturí, retire la mitad dorsal de la cuerda cortando a lo largo de la mitad de cada lado.Corta la parte central en diez pedazos y transfiéralos a un tubo nuevo. Para preparar la suspensión celular de las médulas espinales, recoja las piezas de la médula espinal en la parte inferior del tubo. Sustituya HBSS por un mililitro de jamón F-10 medio y añada diez microlitros de trippsina.Incubar el tubo durante diez minutos a 37 grados centígrados. Para detener la digestión enzimática, transfiera los fragmentos a un nuevo tubo de 15 mililitros, que contiene 800 microlitros de medio L-15 completo, 100 microlitros de 4%BSA, y 100 microlitros de DNAs y valorría, dos veces. Deje que los fragmentos se asienten durante dos minutos antes de recoger el sobrenadante en un tubo fresco de 15 mililitros.Añadir suavemente dos mililitros de 4%BSA en la parte inferior del tubo de sobrenadante. Centro fusible a 470 x gravedad durante 5 minutos. Después de 5 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el palé celular con 2 mililitros de medio L-15 completo.Para el enriquecimiento de motoneurón, divida la suspensión celular en dos tubos de 15 mililitros. A continuación, añada dos mililitros de medio L-15 PH a cada tubo. Si comienza con seis embriones, utilice el equivalente a tres embriones por tubo y tres mililitros de medio.Añadir lentamente 2 mililitros de solución de gradiencia de densidad, en la parte inferior de cada tubo para obtener una interfaz nítida. A continuación, centro de fusible a 830 x gravedad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de este paso, las células pequeñas deben estar en la parte inferior del tubo, mientras que las células grandes, como la motoneuron, deben estar en la solución de gradiente de densidad/interfaz media.Asperae 1 a 2 mililitros de las células en la interfaz y transferirlos a un tubo fresco de 15 mililitros. Ajuste el volumen a diez mililitros con medio L-15 PH. Posteriormente, agregue dos mililitros del cojín 4%BSA en la parte inferior de los dos tubos.Y el fusible centro a 470 x gravedad durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de 5 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el palet y 3 mililitros del medio L-15 completo. Repita la centrifugación a 470 x gravedad durante 5 minutos a temperatura ambiente.A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el palé de celda y dos mililitros de medio de cultivo completo. Para cultivar neuronas motoras, diluirlas a 5.000-10.000 células en 500 microlitros de medio de cultivo por pozo en una placa de 24 pozos. A continuación, retire la solución de láminas con la punta de la pipeta P-1, 000.Transfiera inmediatamente las neuronas motoras diluidas en medio de cultivo. a las placas de codificación para evitar el secado. Para preparar el ADN, vuelva a suspender 1 microgramo de ADN en 50 microlitros del medio de cultivo neuronal.Y vórtice durante 5 segundos. Para preparar el tubo B, vuelva a suspender 1,5 microlitros de cuentas en 50 microlitros de medio de cultivo neuronal. Añadir 50 microlitros de solución de perlas a 50 microlitros de solución de ADN e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.Durante esta incubación, retire 100 microlitros del medio de cultivo del pozo que será trans infectado. Posteriormente, transfiera 100 microlitros de la mezcla de cuentas de ADN a cada pozo. Y incubar la placa de 24 pozos, 20-30 minutos en la placa magnética a 37 grados Celsius.Aquí se muestra, es la morfología de la neurona del módem revelada por la posición de la cadena pesada de neurofilamento endógeno no fosforilado después de cuatro días de cultivo. En estas imágenes, muestre la morfología de la neurona del módem después de cuatro días in vitro y trans infectado para el gen trans EGFP por magnetofección en el segundo día. Las neuronas lema fueron contratenidas con el marcador SMI-32 o el marcador pan-neuro TUJ-1 y las flechas indican el soma de las neuronas.Estas son sus imágenes confocales de neuronas motoras infectadas por magneto, expresando construcciones EGFP NEFH de tipo salvaje o mutante y manchadas por su marcador autofágico LC-3B. Las flechas muestran los agregados de proteínas NEFH EGFP mutantes que también son LC-3B positivos Después de este procedimiento, montoholda curcha puede ser analizado por microscopía de video para visualizar el tráfico de axones y agregar alguna orientación. Después de su desarrollo inicial para abordar cuestiones fundamentales en biología neuronal, esta técnica también demuestra ser una poderosa herramienta para explorar mecanismos fisiopatológicos que implican el espectro de trastornos de motoneuron, como la enfermedad del síndrome de shock tóxico, la esclerosis lateral trófica samuel, o la atrofia muscular espinal.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Las células cultivadas del músculo son un modelo inadecuado para recapitular músculo...

Una unidad motora funcional en la placa de cultivo: Co-cultivo de explantes de la médula espinal y las células musculares

Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

En este protocolo, se presentan los procedimientos para establecer modelos de distrofia miotónica de mioblastos 1, incluyendo el mantenimiento optimizado C2C12 celular, transfección de genes / transducción, y la diferenciación de los miocitos.

Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos

Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

La medición de la conducción nerviosa es una herramienta útil para evaluar modelos de neurodegeneración ratón pero es con frecuencia sólo se aplica para estimular el nervio ciático en miembros posteriores. Aquí, describimos una técnica para medir compuestos musculares potencial de acción (CMAP) en vivo en el ratón miembro anterior músculos inervados por el plexo braquial.

En Vivo Medición electrofisiológica de potencial de acción compuesto del músculo de las extremidades anteriores en modelos de ratón de la degeneración de la motoneurona

Este protocolo permite la conversión rápida y eficiente de células madre pluripotentes inducidas en neuronas motoras con una identidad espinal o craneal, mediante la expresión ectópica de factores de transcripción de vectores piggyBac inducibles.

Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

Este trabajo presenta un protocolo para producir cultivos celulares homogéneos de neuronas motoras primarias oculomotoras, trocleas y espinales. Estos cultivos se pueden utilizar para análisis comparativos de las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras oculares y espinales.

Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos

Aquí proporcionamos un protocolo para generar NMJ in vitro a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Este método puede inducir NMJ con morfología madura y función en 1 mes en un solo pozo. Los NMJ resultantes podrían utilizarse potencialmente para modelar enfermedades relacionadas, para estudiar mecanismos patológicos o para detectar compuestos farmacológicos para la terapia.

Unión Neuromuscular In vitro inducida a partir de células madre pluripotentes inducidas por el hombre

Describimos un método para generar unidades motoras humanas en dispositivos microfluídicos disponibles comercialmente mediante el cocultivo de neuronas motoras derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos con miotubos derivados de mesoangioblastos primarios humanos, lo que resulta en la formación de uniones neuromusculares funcionalmente activas.

Generación de Unidades Motoras Humanas con Uniones Neuromusculares Funcionales en Dispositivos Microfluídicos

Describimos un sistema de imágenes reproducible, automatizado e imparcial para caracterizar la función de la unión neuromuscular utilizando tejido muscular esquelético diseñado por humanos y motoneuronas optogenéticas. Este sistema permite la cuantificación funcional de la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y detecta la disminución de la función neuromuscular causada por las neurotoxinas y la miastenia gravis en el suero del paciente.

Ingeniería y caracterización de un modelo optogenético de la unión neuromuscular humana

La utilización de un modelo tumoral autóctono inmunocompetente impulsado por mutaciones comunes de los pacientes para las pruebas preclínicas es fundamental para las pruebas inmunoterapéuticas. Este protocolo describe un método para generar modelos de ratón con tumores cerebrales utilizando la administración de ADN plasmídico basado en electroporación que representa mutaciones comunes de los pacientes, proporcionando así un modelo de ratón preciso, reproducible y consistente.

Modelado de tumores cerebrales in vivo mediante la administración basada en electroporación de ADN plasmídico que representa las firmas de mutación del paciente

Aprende a modelar la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth mediante el aislamiento y transfección de motoneuronas primarias de ratón. Esta técnica permite estudiar mecanismos neurodegenerativos in vitro con alta pureza celular.

Modelado enfermedad del Charcot-Marie-diente In Vitro por transferencia primaria Motoneurons de ratón

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