Name: Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Aprende una técnica quirúrgica novedosa para perfusión hepática in vivo en ratas, modelo esencial para avanzar en ingeniería hepática parcial y regeneración de injertos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean dar las gracias Jens Geiling desde el Instituto de Anatomía I, Hospital de la Universidad de Jena, para producir los dibujos esquemáticos de la anatomía del hígado de rata.

La vivienda y todos los procedimientos realizados fueron conforme a legislación de bienestar animal alemán. Toda la gasa, cubierta de ropa e instrumentos quirúrgicos son esterilizado y preparado antes de la operación. Todos los procedimientos se llevan a cabo en condiciones estériles.
1. preparación de la rata para el procedimiento quirúrgico
<ol><li>Colocar la rata en una cámara de inducción y anestesiar la rata con isoflurano vaporizado de 4% y oxígeno al 100% en 0,5 L/min durante aproximadamente 3 minutos, hasta que la rata está totalmente anestesiada.</li>
	<li>Sacar a la rata de la cámara de inducción y medir su peso corporal.</li>
	<li>Afeitarse la piel de la región quirúrgica en el abdomen.</li>
	<li>Coloque la parte trasera de animales en la cámara de isoflurano para un 2 minutos adicionales profundizar la anestesia.</li>
	<li>Colocar la rata en la mesa de operación en posición supina.</li>
	<li>Fijar la máscara de la anestesia en la región de la boca de la rata y que el animal anestesiado con un flujo de gas continuo de isoflurano vaporizado el 2% y el 100% de oxígeno a un flujo de 0.5 L/min.</li>
	<li>Fijar las extremidades con trozos de cinta.</li>
	<li>Aplique ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la sequedad.</li>
	<li>Administrar buprenorfina 0,05 mg/kg por vía subcutánea, para aliviar el dolor durante el período de operación.</li>
	<li>Desinfección del campo quirúrgico del abdomen con 3 rondas de tintura de yodo seguido de 2 rondas de alcohol al 70%.</li>
	<li>Lugar esteriliza gasas alrededor del área donde se realizará la incisión para dejar sólo el campo de la operación del abdomen expuesto.</li>
	<li>Proceder a realizar la operación cuando está ausente el reflejo del pellizco del dedo del pie retiro de la rata.</li>
</ol>2. laparotomía de la rata
<ol><li>Hacer una incisión de piel y músculo abdominal transversal usando tijeras y un coagulador eléctrico.</li>
	<li>Fijar y sacar el proceso del xiphoid hacia la cabeza mediante una sutura de polipropileno 4-0. Nota: Preste atención al levantar el proceso del xiphoid verticalmente para exponer mejor el hígado, pero proceda con precaución para evitar la restricción respiratoria severa y la asfixia.</li>
	<li>Abrir la cavidad peritoneal tirando de ambos lados de las paredes abdominales hacia la cabeza con dos ganchos subcostal para exponer el hígado.</li>
	<li>Cubrir el duodeno y el intestino en la cavidad abdominal con una gasa humedecida para evitar que se sequen.</li>
	<li>Levante lóbulos medianos derecho e izquierdos utilizando una gasa humedecida y mantenerlos contra el tórax para exponer mejor el hilio del hígado.</li>
	<li>Lugar la rata bajo un estereomicroscopio (aumento de X 8).</li>
	<li>Deje caer alguna solución salina tibia en el abdomen y en la superficie del hígado y los intestinos cada varios minutos, para evitar que se sequen durante todo el procedimiento.</li>
</ol>3. establecimiento de un pasaje de derivación dentro de lóbulo Lateral izquierdo
<ol><li>Disecar la vena porta izquierda y ligan con una sutura de seda 6-0 en la base (figura 2A).</li>
	<li>Bloque de la izquierda de la arteria hepática, el conducto biliar izquierdo junto con la vena media izquierda del portal, la arteria hepática media izquierda y la izquierda mediana vía biliar con micro pinzas para evitar un flujo de la solución en el lóbulo medio izquierdo (figura 2B).</li>
	<li>Separar el lóbulo lateral izquierdo cortando los ligamentos circundantes del lóbulo con micro tijeras.</li>
	<li>Bloquear la lateral izquierda de la vena hepática por fijación en la base del lóbulo lateral izquierdo con micro pinzas (figura 2). Nota: Asegúrese de no apretar la vena porta izquierda así por error.</li>
	<li>Utilice abrazaderas de mosquito la ligadura de la vena porta izquierda y mantener la vena con la tensión adecuada para la canulación más adelante.</li>
	<li>Cuidadosamente hacer una incisión en la pared frontal de la vena porta izquierda pinchando con un aguja-vivienda 24-G catéter ( Figura 3A). Nota: Para crear un puente, son necesarios puntos de acceso vascular en la izquierda de la vena porta y la vena hepática izquierda. Para este paso, es preferido para crear el acceso vascular por punción de los vasos con una aguja en lugar de hacer una incisión más grande con unas tijeras. Esto reduce el riesgo de sangrado y posterior estenosis.</li>
	<li>Retirar el catéter y tomar la aguja de la sonda para obtener una sonda de aguja-libre 24-G.</li>
	<li>Conectar el catéter a un tubo de perfusión, de que el otro extremo se conecta a una jeringa de 20 mL con 15 mL de 40 U/mL heparinizada solución salina en una bomba de perfusión.</li>
	<li>Encienda la bomba para perfundiendo el tubo para expulsar el aire hacia fuera del tubo y la sonda de aguja-libre.</li>
	<li>Apague la bomba de perfusión.</li>
	<li>Una vez más, inserte el catéter sin aguja en la vena porta izquierda a través de la incisión pinchada en la vena (figura 3B). Nota: Debido a espacio limitado para la fijación del catéter, no se fija en este punto. Por lo tanto, el cirujano debe usar cuidado para evitar el desplazamiento del catéter canulado.</li>
	<li>Cuidadosamente hacer otra incisión en el margen de la región expuesta de la vena hepática lateral izquierda pinchando con un catéter de aguja-vivienda de 22 o 24 G (figura 3). Nota: Se recomienda que el catéter sea ligeramente más pequeño que la nave.</li>
	<li>Retirar el catéter y tomar la aguja por el catéter para obtener un catéter sin aguja 22-G.</li>
	<li>Encienda la bomba de perfusión perfusión salina heparinizada en el lóbulo lateral izquierdo vía 24-G canulado sin aguja catéter de la vena porta izquierda a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min.</li>
	<li>Utilice una gasa seca para absorber el líquido que hacia fuera-fluye residuos alrededor de la zona de incisión de la vena hepática lateral izquierda.</li>
	<li>Canule la vena hepática lateral izquierda vía el pinchado de la incisión de la vena con el catéter de aguja 22-G, para generar una toma de fluidos para minimizar la contaminación intraabdominal (figura 3D). Nota: Es técnicamente difícil fijar el catéter canulado en el lóbulo hepático. Por lo tanto, el cirujano debe prestar atención a evitar el desplazamiento del catéter. Por otra parte, sin la canulación de la vena hepática izquierda lateral con un catéter, residuos líquidos también pueden ser absorbido en la región de la incisión de la vena con una gasa seca.</li>
	<li>Mantener perfundiendo el lóbulo lateral izquierdo con solución salina heparinizada para alrededor de 20 minutos (Grupo 1) y luego solamente con solución salina para 2 h, 3 h o 4 h (Grupo 2, grupo 3 y grupo 4, respectivamente).</li>
	<li>Apague la bomba para detener la perfusión.</li>
</ol>4. a fisiológica reperfusión del lóbulo Lateral izquierdo
<ol><li>Sacar ambos catéteres de la vena porta izquierda y el lateral izquierdo de la vena hepática.</li>
	<li>Cerrar la incisión de la vena porta izquierda con una sutura de poliamida 11-0.</li>
	<li>Cerrar la incisión de la vena hepática izquierda lateral con una sutura de poliamida 11-0 también.</li>
	<li>Suelte el lateral izquierdo de la vena hepática.</li>
	<li>Suelte la media izquierda de la vena porta, conducto biliar izquierdo y arteria hepática izquierda.</li>
	<li>Corte la ligadura de la vena porta izquierda a reabrir la vena.</li>
</ol>5. cierre de la pared Abdominal
<ol><li>Cerca de la capa muscular de la pared abdominal por la sutura interrumpida con una sutura absorbible Poliglactina 910 de 4-0.</li>
	<li>Cerrar la capa de la piel de la pared abdominal por la sutura interrumpida con una sutura de polidioxanona absorbible 4-0.</li>
	<li>Después de cerrar el abdomen, desinfectar la incisión de la piel con alcohol 70%.</li>
</ol>6. postoperatorio tratamiento de la rata
<ol><li>Coloque el animal en una cubierta térmica de colchón para la reanimación durante unos 10 minutos y luego ponerlo en una jaula nueva.</li>
	<li>Administrar buprenorfina 0,05 mg/kg por vía subcutánea 2 x día por 3 d consecutivo postoperatoriamente liberar el dolor.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OPTN+%2F+SRTR+2016+Annula+Data+Report%3A+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation.+Suppl%22%5BJournal%5D)">OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver.</a> American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).</li>
<li>Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+engineering+and+cell+sources%3A+issues+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges.</a> Liver International. 33, 666-676 (2013).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+matrix+microarray+for+probing+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation.</a> Nature Methods. 2, 119-125 (2005).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33, 448-458 (2013).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).</li>
<li>Jiang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-chemical+decellularization+of+the+whole+liver+for+mesenchymal+stem+cells-based+functional+hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering.</a> Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+heparinization+of+decellularized+liver+matrices+to+reduce+thrombogenicity+of+tissue+engineered+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts.</a> Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).</li>
<li>Park, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+Liver+Extracellular+Matrix+as+Promising+Tools+for+Transplantable+Bioengineered+Liver+Promotes+Hepatic+Lineage+Commitments+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).</li>
<li>Ko, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+transplantable+porcine+livers+with+re-endothelialized+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature.</a> Biomaterials. 40, 72-79 (2015).</li>
<li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+organ+engineering%3A+Perfusion+of+hepatocytes+in+a+single+liver+lobe+scaffold+of+living+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).</li>
<li>Madrahimov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginal+hepatectomy+in+the+rat%3A+from+anatomy+to+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery.</a> Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).</li>
<li>Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+Livers%3A+A+New+Tool+for+Drug+Testing+and+a+Promising+Solution+to+Meet+the+Growing+Demand+for+Donor+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs.</a> European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).</li>
<li>Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+engineering+as+a+new+source+of+donor+organs%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Der+Chirurg%22%5BJournal%5D)">Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review.</a> Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).</li>
<li>Xie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+systemic+and+hepatic+hemodynamic+parameters+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51955(2014).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+Recellularization+of+Rat+Livers+With+Hepatocytes+and+Endothelial+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells.</a> Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).</li>
<li>Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+co-culture+of+hepatocyte+spheroids+layered+on+non-parenchymal+cells+to+understand+heterotypic+cellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003(2013).</li>
<li>Bale, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+coculture+strategies+for+primary+hepatocytes+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+perfusion-decellularization+methods+of+porcine+livers+for+clinical-scale+whole-organ+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering.</a> BioMed Research International. , 785474(2015).</li>
<li>Barakat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+decellularized+porcine+liver+for+engineering+humanized+liver+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ.</a> Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).</li>
<li>Navarro-Tableros, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularization+of+rat+liver+scaffolds+by+human+liver+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Bloqueando y canular la vena porta izquierda con un catéter como una entrada de fluido y la vena hepática izquierda lateral con otro catéter como un fluido, con éxito generamos un puente fluido en vivo dentro del lóbulo lateral izquierdo, lo que indica que Aunque la técnica es muy difícil debido al tamaño pequeño de los vasos para la canulación y a un alto riesgo de causar hemorragias, es factible. Incluso las ratas en período de perfusión larga de 4 horas sobrevivieron por lo menos 1 semana, mostrando que las r...

Las indicaciones para el trasplante de órganos están ampliando constantemente. Por el contrario, están disminuyendo las tasas de donación de órganos y la calidad general de los órganos, llevando a una creciente demanda de injertos. Continuó aumentando el número de candidatos ha añadido a la lista de espera de trasplante de hígado (p. ej., en los Estados Unidos, 11.340 pacientes fueron agregados en el año 2016, en comparación con 10.636 en 2015)1. A pesar de considerables esfuerzos, el número de órganos disponibles necesidades clínicas. Debido a la incidencia creciente de enfermedad hepática, muchos pacientes con enfermedades hepáticas de fase final muere en lista de espera de trasplante ante un órgano de donante disponible. Para satisfacer la enorme demanda de injertos de donantes, alternativas, utilizando tejido del hígado principios de ingeniería están siendo activamente persiguen2. Hoy en día, una técnica biológica desarrollada recientemente de ingeniería hepática potencialmente podría superar esta escasez.
Ingeniería hígado consta de dos pasos: la generación de un andamio acelular, seguido de una repoblación del andamio. Para obtener un andamio biológico de hígado acelular, el hígado explanted es inundada por el sistema vascular con detergentes iónicos o no iónicos, que se puede quitar el material celular del hígado. En la mayoría de los estudios anterior, un andamio biológico de hígado acelular fue alcanzado por la perfusión del hígado con una combinación de dodecil sulfato de sodio y TritonX100. Como resultado, todas las células fueron quitadas, mientras que se mantuvo la estructura de la matriz extracelular. Las matrices de soporte de órgano fueron resembrados con células maduras, hepatocelular, así como líneas de células endoteliales y hepatocitos primarios con o sin la aplicación simultánea de las células endoteliales o células madre mesenquimales (MSC). Enfoque de los investigadores más en vivo ex hígado ingeniería3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Sin embargo, en la mayoría de los estudios anterior, sólo pequeños trozos de cubos repoblado andamio fueron transplantadas en sitios diferentes de implantación heterotópica. En algunos estudios, andamios repoblación parciales fueron trasplantados como injertos auxiliares. Sin embargo, la máxima supervivencia divulgada fue sólo 72 h8,14. Lo que sabemos, trasplante ortotópico de un injerto completo higado repoblado aún no ha sido realizado o publicado sobre. La función a largo plazo y trasplante de órganos modificados son todavía en su infancia. Por lo tanto, es necesario un enfoque alternativo a la ex vivo hígado ingeniería.
En vivo hígado ingeniería puede representar una alternativa para el estudio hepático repoblación bajo condiciones fisiológicas. Las ventajas de en vivo hígado ingeniería comparado con ingeniería ex de vivo hepática son múltiples. En vivo repoblado parcial hígado andamio está sometido a perfusión sanguínea fisiológica con la temperatura adecuada, suficiente oxígeno, nutrientes y factores de crecimiento en contraste con perfusión ex vivo con medio de cultivo artificial. Además, el hígado normal parcial restante mantiene la función hepática, principalmente, lo que permite la supervivencia a largo plazo. Puesto que un injerto de hígado implantado ex vivo diseñado es todavía incapaz de sostener la supervivencia a largo plazo de animales de experimentación por su función hepática8, imaginamos que en vivo parcial hígado engineeringwould en última instancia convertirse en un modelo prometedor para estudiar más la evolución de la ingeniería hígados con más observaciones de supervivencia de ex vivo.
Recientemente, un grupo de investigación (Pan y colegas) presentó, por primera vez, una técnica de en vivo hígado ingeniería15. Alcanzaron la perfusión aislada del lóbulo inferior derecho hígado en ratas vivas a pesar de los desafíos técnicos y anatómicos. Ellos reportaron los primeros resultados intraoperativos de en vivo repoblación mediante una línea de celular de hepatocitos primarios de rata. Sin embargo, el modelo de perfusión quirúrgica en vivo de Pan et al. tiene desventajas. Alcanzaron la perfusión sola lóbulo hepático en ratas a costa de bloquear totalmente la vena porta y vena cava inferior, que puede causar grave daño al animal. Las ratas experimentales fueron sacrificadas después de sólo 6 horas de tiempo de observación intraoperatoria. Por lo tanto, la técnica de perfusión en vivo lóbulo hepático necesita mejora para lograr la supervivencia postoperatoria.
Desarrollamos un modelo de supervivencia nuevo para en vivo lóbulo hepático de la perfusión, basado en estudios previos de la Anatomía hepática de rata16, la técnica de canulación de la vena porta para monitoreo hemodinámico en ratones17y Bioingeniería hígado 18 , 19. los pasos claves para el procedimiento se ilustración en la figura 1A - 1E.
Esta técnica es adecuada para aquellos que quieran utilizar este modelo de perfusión experimental en vivo para la investigación básica en el tratamiento de órgano parcial por infusión de drogas, descelularización en vivo como una resección química para las enfermedades de órgano (p. ej. , cáncer de hígado), en vivo el cultivo de células en una matriz decellularized comparar ex vivo bidimensional y tridimensional de la célula cultura sistemas20,21,22,23 , 24 , 25 , 26y en vivo hígado ingeniería descelularización y repoblación.

<table><tbody><tr><td>Bomba</td><td></td><td></td><td></td>de perfusión</tr><tr><td>Perfusor VI</td><td>B. Braun,</td> catéter Melsungen <td></td><td></td></tr><tr><td></td> Versatus-W&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Catéter</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2419PX</td><td>24G, 0,74 veces; 19mm</td></tr><tr><td>Versatus-W&nbsp; Catéter</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2225PX</td><td>22G, 0,9 veces; </td></tr><tr><td>Micro instrumento</td><td></td><td></td><td></td>quirúrgico</tr> de 25 mm <tr><td>micro tijeras</td><td>F & middot; S&middot; L</td><td>Nº 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>micro serrefine</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>No.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de micro abrazaderas</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>Nº 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Micropinzas rectas</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>Nº 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Micropinzas curvas</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>Nº 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>micro portaagujas</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>Nº 12061-01</td><td></td></tr><tr>instrumentos <td></td><td></td><td></td><td>quirúrgicos generales</td></tr><tr><td>sisjeras estándar</td><td>F&middot; S&middot; L</td> pinza para mosquitos F <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>& middot; S&middot; Pinza</td> dentada L <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>F&middot; S&middot; Pinza</td> dentada L <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>F&middot; S&middot; L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>portaagujas</td><td>F&middot; S&middot; Sutura</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> L <tr><td>4-0 prolene</td><td>ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 ETHICON*II</td><td>ethicon 6-0 ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>de seda</td><td></td></tr><tr><td>11-0</td><td>ethicon</td><td></td><td></td> de poliamida</tr></tbody></table>

una novedosa técnica quirúrgica como base para in vivo parcial ingeniería hígado de rata

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Ingeniería de órganos es una nueva estrategia para generar sustitutos de hígado órgano que potencialmente pueden ser utilizados en el trasplante. Recientemente, en vivo hígado ingeniería, incluyendo en vivo órgano descelularización seguido de repoblación, ha surgido como un enfoque prometedor sobre ingeniería ex de vivo hígado. Sin embargo, no se logró la supervivencia postoperatoria. El objetivo de este estudio es desarrollar una nueva técnica quirúrgica en vivo perfusión selectiva del lóbulo hepático en las ratas como requisito previo para la ingeniería en vivo hígado. Generamos un circuito bypass sólo a través del lóbulo lateral izquierdo. Entonces, el lóbulo lateral izquierdo es inundado con solución salina heparinizada. El experimento se realizó con 4 grupos (n = 3 ratas por grupo) basado en tiempos diferentes de la perfusión de 20 min, 2 h, 3 h y 4 h. supervivencia, así como el cambio macroscópico visible del color y la ausencia histológico determinada de células de la sangre en el tríada portal y los sinusoides, es tomado como un indicador para el establecimiento de un modelo de éxito. Después de la perfusión selectiva del lóbulo lateral izquierdo, observamos que el lóbulo lateral izquierdo, de hecho, dio vuelta de rojo a amarillo débil. En una evaluación histológica, células de la sangre no son visibles en la rama de la vena porta, la vena central y los sinusoides. El lóbulo lateral izquierdo cambia a rojo después de la reapertura de los vasos obstruidos. 12/12 ratas sobrevivieron el procedimiento más de una semana. Somos el primer para divulgar un modelo quirúrgico para la perfusión sola lóbulo hepático en vivo con un período de supervivencia larga de más de una semana. En contraste con el informe previamente publicado, la ventaja más importante de la técnica presentada aquí es que la perfusión del 70% del hígado se mantiene a lo largo de todo el procedimiento. El establecimiento de esta técnica proporciona una base para en vivo parcial ingeniería hepática en ratas, como descelularización y recelularización.

Doce hombre (edad 12 - 13 semanas) las ratas de Lewis fueron utilizadas para evaluar el efecto de la perfusión selectiva del lóbulo hepático El experimento se realizó en cuatro grupos (n = 3 ratas por grupo). Con períodos diferentes de la perfusión de 20 minutos, 2 horas, 3 horas y 4 horas, siguiendo los pasos descritos anteriormente, logra con éxito en vivo de la perfusión del lóbulo único.
En Vivo...

Establecemos una novedosa técnica quirúrgica para un modelo de perfusión en vivo solo lóbulo hepático de rata como requisito previo para el estudio adicional en vivo hígado parcial en el futuro de la ingeniería.

Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

En los últimos años, la ingeniería hepática se ha convertido en un tema candente en todo el mundo debido a su potencial de generar injertos de hígado capaces de trasplante. Sin embargo, la función viable a largo plazo y el trasplante de órganos de ingeniería siguen siendo una visión del futuro. Recientemente la profusión del lóbulo hepático in-vivo se ha convertido en una estrategia prometedora para iniciar la ingeniería hepática.Una de las principales ventajas de esta técnica es que el andamio hepático parcial repoblado in vivo somete a profusión de sangre escatológica. Esto proporciona al andamio la temperatura adecuada, suficiente oxígeno, nutrientes y factores de crecimiento en contraste con la profusión ex-vivo con medio de cultivo artificial. Otra ventaja es que el hígado restante mantiene la función hepática y por lo tanto permite principalmente la supervivencia a largo plazo.Sin embargo, el modelo de profusión de lóbulo único en vivo es técnicamente difícil y aún no se ha logrado la supervivencia postoperatoria. Aquí vamos a presentar otro modelo quirúrgico con supervivencia a largo plazo como base para la ingeniería de lóbulos hepáticos individuales in vivo. Antes de demostrar el modelo quirúrgico, nos gustaría dar una breve introducción a la anatomía del hígado de rata.Para establecer nuestro modelo de profusión de lóbulo hepático único seleccionamos el lóbulo lateral izquierdo. Este es el único lóbulo hepático con un suministro vascular distinto y drenaje que permite crear un bypass. Esta es una reconstrucción tridimensional del sistema venoso portal en rata.Nuestro enfoque aquí está en la vena porta izquierda que más tarde servirá como la entrada de líquido. Esta es una reconstrucción tridimensional del sistema venoso hepático en rata. Aquí nuestro enfoque está en la vena hepática lateral izquierda que más tarde servirá como una salida de fluido.Esta ilustración de la anatomía vascular hepática destaca los puntos de acceso vascular utilizados para el modelo de perfusión parcial. Esta animación ilustra el esquema de generar el modelo de perfusión del lóbulo hepático lateral izquierdo in vivo. Para establecer el modelo quirúrgico vamos a generar un bypass de circuito dentro del lóbulo lateral izquierdo.Para ello necesitamos bloquear los siguientes vasos la vena porta izquierda, la arteria hepática izquierda, el conducto biliar izquierdo, la vena protal mediana izquierda, la arteria hepática y el conducto biliar, y la vena hepática lateral izquierda. Entonces necesitamos cánular la vena porta izquierda con un catéter de 24 gage. Después, la vena hepática lateral izquierda se canula con un catéter de 22 gages.A continuación, el catéter en la vena porta izquierda se conecta a una bomba de perfusión. La gasa seca se coloca en la salida del catéter en la vena hepática lateral izquierda para absorber el líquido de desecho. De esta manera se crea un bypass.A continuación, el lóbulo lateral izquierdo se perfunde con solución salina heparinizada a un caudal de 0,5 mililitros por minuto. La perfusión fisiológica al lóbulo lateral izquierdo se restaura después de reabrir los vasos bloqueados. Ahora se establece el modelo de perfusión quirúrgica.Todos los procedimientos demostrados en este video fueron evaluados y aprobados por las autoridades locales. El campo de operación del abdomen se desinfecta con tres rondas de tintura de yodo seguidas de dos rondas de 70%alcohol. La gasa estéril se coloca en el abdomen dejando solo expuesto el campo de operación.Se realiza una incisión transversal en la pared abdominal de la rata. Una sutura de proleno 4-0 se utiliza para fijar el proceso de xifoide y tirar de él hacia la cabeza. Ambos lados de las paredes abdominales superiores se retraen utilizando dos ganchos subcostales para alcanzar la exposición completa del órgano.Entonces podemos ver los lóbulos hepáticos. Aquí está el lóbulo lateral izquierdo que se utiliza para la perfusión selectiva. Cubrimos el duodeno y el intestino delgado en la cavidad abdominal con gasa humedecida a sequedad ovoide.Exponemos el hilum del hígado levantando los lóbulos medios con gasa humedecida. La rata se coloca bajo un microscopio estéril. Diseccionamos la vena porta izquierda.Luego ligamos la vena protal izquierda con una sutura de seda 6-0. La arteria hepática izquierda, el conducto biliar izquierdo, así como la vena mediana izquierda del porta, la arteria hepática mediana izquierda y el conducto biliar mediano izquierdo se bloquean mediante micro-pinzas. Bloqueamos la vena hepática lateral izquierda con micro-pinzas en la base del lóbulo lateral izquierdo.Para crear la entrada de líquido, el tallo de la vena porta se perfora con un catéter de aguja de 24 medidores. Pero el catéter no está insertado. Luego retiramos la aguja del catéter y conectamos el catéter a una bomba de perfusión.Para expulsar aire del tubo y el catéter, perfumamos con solución salina heparinizada durante un minuto. Luego apagamos la bomba. A continuación, el catéter libre de agujas, que ahora está conectado a la bomba de perfusión, se inserta en la vena porta izquierda.De esta manera minimizamos las manipulaciones del recipiente canulado. Aquí hay una región expuesta de la vena hepática lateral izquierda que vamos a cannular de una manera similar. Primero creamos un orificio de drenaje en la vena hepática lateral izquierda punturándola con un catéter de 22 o 24 agujas de 24 gage.Recomendamos que el catéter sea ligeramente más pequeño que el recipiente. A continuación, comenzamos a perfumar el lóbulo lateral izquierdo con solución salina heparinizada a un caudal de 0,5 mililitros por minuto. El fluido de desecho que fluye se absorbe con gasa.Para minimizar la contaminación intraabdominal con el líquido de desecho, reinsertamos el catéter libre de agujas en la vena hepática lateral izquierda. Por lo tanto, la vena hepática lateral izquierda cannulada sirve como salida de fluido. Seguimos perfundiendo el lóbulo lateral izquierdo con solución salina heparinizada.Se puede ver líquido sangriento goteando de la salida. La flecha indica que el lóbulo lateral izquierdo se volvió amarillo durante la perfusión con solución salina heparinizada. Al final de la perfusión los catéteres son sacados de los vasos.La abertura de drenaje en la vena hepática lateral izquierda se cierra con una sola sutura de poliumita 11-0. La abertura de entrada en la vena porta izquierda también se cierra con una sutura de 11-0 poliguitas. La perfusión comienza con el contraflujo de la vena cava suprahepática después de quitar la abrazadera de la vena hepática lateral izquierda.La perfusión fisiológica se restaura aún más después de extraer la abrazadera de la arteria hepática izquierda y del conducto biliar, así como de las estructuras vasculares medianas izquierdas. La refusión completa se logra después de volver a abrir la vena porta izquierda como se indica mediante un cambio de color a rojo oscuro. Perfusión del lóbulo izquierdo posterior.La flecha blanca de esta imagen indica que el lóbulo hepático objetivo se perfundió selectivamente. Aquí las flechas blancas muestran que los lóbulos restantes, que representan alrededor del 70% del hígado retuvo la perfusión fisiológica durante todo el procedimiento. Perfusión del lóbulo lateral izquierdo.Aquí la flecha roja indica que el lóbulo lateral izquierdo se refunde fisiológicamente después de reabrir los vasos bloqueados. La flecha azul muestra que la isquemia sostenida del lóbulo medio izquierdo. El lóbulo lateral izquierdo, entrefundado selectivamente, se examinó histológicamente mediante tinción H E.La Figura A muestra que en el lóbulo lateral izquierdo perfundido no se pueden detectar células sanguíneas en la rama de la vena porta y los sinusoides. Como se esperaba, los glóbulos rojos son visibles en la rama de la arteria hepática. En la figura B el lóbulo caudado inferior sirve como control.Las células sanguíneas son claramente visibles y las ramas de la vena protal y la arteria hepática, así como los sinusoides. La figura C demuestra que en el lóbulo lateral izquierdo perfundido no hay células sanguíneas visibles en la vena central. Por el contrario, la figura D demuestra que en el control las células sanguíneas del lóbulo caudado inferior son visibles en la vena central.Logramos una tasa de supervivencia del 100% de una semana en 12 procedimientos consecutivos. Comparamos nuestro modelo de perfusión de lóbulos hepáticos in vivo con el modelo de Pan y colegas. Las principales diferencias en metodología y resultados entre Pan y nuestro grupo son: seleccionaron el lóbulo inferior derecho mientras elegimos el lóbulo lateral izquierdo como lóbulo hepático objetivo;bloquearon la vena cava y la vena porta principal que conduce a la hipertensión portal.Por el contrario, mantuvimos la perfusión del portal del 70% del hígado;sacrificaron a las ratas interoperatoriamente mientras que nuestra tasa de supervivencia de una semana es del 100% las ventajas de nuestro nuevo modelo quirúrgico son: que es técnicamente difícil pero factible; y que es bien tolerado como lo demuestra la tasa de supervivencia del 100%. Sin embargo, una limitación es que la isquemia sostenida del lóbulo medio izquierdo sostuvo isquemia debido a la obstrucción de la vena porta. Las posibles aplicaciones de nuestra técnica incluyen: que se puede utilizar para el tratamiento de órganos parciales in vivo por perfusión con fármacos;descelularización parcial de órganos in-vivo como resección química;sistema de cultivo celular in-vivo en comparación con la ingeniería hepática ex-vivo;y in vivo.

a-novel-surgical-technique-as-foundation-for-vivo-partial-liver

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se presenta una revisión fácil de establecer de la clásica banda de dos técnicas para el trasplante ortotópico de hígado en ratas.

Trasplante ortotópico de hígado en ratas

Trasplante ortotópico de hígado en ratas es un modelo experimental indispensable para la investigación biomédica. A continuación les presentamos nuestros procedimientos quirúrgicos de trasplante ortotópico de hígado de rata con la reconstrucción arterial hepática mediante un injerto parcial del 50%.

Procedimientos Quirúrgicos para un modelo de rata de trasplante hepático ortotópico parcial con reconstrucción arterial hepática

Se describe el diseño del dispositivo "quick-linker" para el trasplante ortotópico de hígado de rata más fácil.

Fabricación de aparatos e instrumentos para facilitar la rata Trasplante de Hígado

Un modelo de abrazadera hiliar hígado de rata única fue desarrollado para estudiar el impacto de moléculas farmacológicas en la mejora de la lesión por isquemia-reperfusión. Este modelo incluye la canulación directa del suministro de portal al segmento de hígado isquémico a través de una rama de la vena porta, lo que permite la entrega hepática directa.

Método de la entrega directa segmentaria intra-hepática utilizando un modelo de hígado de rata hiliar abrazadera

Hemos descrito un protocolo para la realización de hepatectomía parcial (PHx) y trasplante de la célula vía bazo en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratones. En este protocolo, se realiza una incisión para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, seguido por otra incisión para el intrasplenic trasplante de células.

Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID

Aquí, se presenta un protocolo de trasplante hepático parcial rata vuelva a arterializada. Específicamente, hígado 70% fue resecado en vivo mediante el uso de una técnica actualizada de hepatectomía orientada al buque. La arteria hepática fue reconstruida de manera final a otro. La técnica del manguito fue modificada para acortar el tiempo de anastomosis de la cava de infrahepatic.

Volver a arterializada rata parcial trasplante del hígado con una en vivo orientada al barco 70% hepatectomía

La reconstrucción de la cava suprahepática (SHVC) sigue siendo un paso difícil en el trasplante orthotopic del hígado de rata. En este artículo, se muestra un protocolo paso a paso para la reconstrucción de SHVC en ratas usando una técnica de anastomosis magnética novela.

Un modelo de rata de Orthotopic trasplante del hígado usando una técnica de Anastomosis magnética novela para la reconstrucción de la Vena Cava suprahepática

Aquí, presentamos un nuevo método para la resección parcial del lóbulo izquierdo hepático en ratones neonatales (día 0). Este nuevo protocolo es adecuado para el estudio de la lesión del higado aguda y la respuesta de lesiones en el ámbito neonatal.

Hepatectomía parcial lobulado: Un modelo quirúrgico para regeneración hepática morfológico

Aquí, describimos una plataforma que permite la obtención de imágenes in vivo no invasivas de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo del ratón. El flujo de trabajo abarca desde la generación de esferoides a partir de células hepáticas primarias hasta el trasplante en el ojo del ratón y la obtención de imágenes in vivo a resolución celular mediante microscopía confocal.

Obtención de imágenes in vivo de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo de ratón

El protocolo de trasplante hepático auxiliar heterotópico en ratas descrito aquí ofrece una herramienta práctica de investigación para explorar los mecanismos de rechazo del aloinjerto hepático. Este modelo ayuda a aliviar los obstáculos quirúrgicos y el estrés animal del trasplante ortotópico de hígado en ratas.

Modelo de trasplante heterotópico auxiliar de hígado entero en rata que utiliza una hepaticoureterostomía para estudios de rechazo de aloinjertos

Aprende una técnica quirúrgica novedosa para perfusión hepática in vivo en ratas, modelo esencial para avanzar en ingeniería hepática parcial y regeneración de injertos.

Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata

Explorar más videos