Name: Producción semi automatizada de hepatocitos como células de células madre pluripotentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Aprenda a producir hepatocitos a partir de células madre pluripotentes mediante un protocolo semi automatizado en placas de 96 pocillos. Este método rápido y rentable permite la producción masiva de células con marcadores funcionales para modelado de enfermedades hepáticas y cribado de fármacos.

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Este trabajo fue financiado con los premios de la oficina del científico jefe (TCS/16/37) y una beca de doctorado de MRC.

1. siembra de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) en 96 bien las placas de hepatocitos diferenciación
Nota: Reactivos y equipos utilizados en el presente Protocolo ha sido incluido en la tabla 1. Medios utilizados para este experimento deben ser estéril y a temperatura ambiente para el cultivo celular. Todos los volúmenes de reactivo solución descritos en esta parte del Protocolo se basan en un único pozo de una placa de 96 pocillos, a menos que se especifique lo contrario.
<ol><li>
Preparar laminina cubierto 96 placas bien.
	<ol>
<li>Descongelar un vial de laminina recombinante 521 (100 μg/mL) (LN-521) por 2 h para toda la noche a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar una solución de 5 μg/mL diluyendo LN-521 en la helada 1 x tamponada con fosfato solución salina de Dulbecco (DPBS) (con Ca2 +/Mg2 +).</li>
		<li>Utilizar un manejo dispensador con un tubo estándar cassette de dispensación de líquidos automática para añadir 50 μl de la solución de LN-521 por pozo de una placa bien 96. Nota: Todo el volumen dispensa se realizan con un dispensador automático de manejo de líquidos con un tubo estándar cassette de dispensación a menos que se especifique lo contrario. Prime la solución hasta que llegue el dispensación final del cassette, luego proceda a dispensar. Múltiples placas bien 96 se pueden preparar en el mismo experimento repitiendo el procedimiento tantas veces como sea necesario.</li>
		<li>Incubar las placas de LN521-revestido en 37 °C/5% CO2 para 2 a 4 h. Nota: Las placas revestidas de LN521 pueden ser almacenadas dos semanas a 4 ° C. Mantener las placas de sellado sobre una superficie plana para evitar la evaporación y contaminación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caliente el número requerido de placas Prelacados a 37 ° C por 30 min a 1 h.</li>
	<li>Aspire la solución de LN-521 restante de la superficie recubierta con un adaptador de aspiración de 8 canales. Nota: Es fundamental para evitar el contacto con la superficie recubierta para evitar la degradación de la capa.</li>
	<li>Inmediatamente añadir 50 μL por pocillo mTeSR1 suplementado con inhibidor de cinasa Rho-associated (roca) de 10 μm Y27632 y mantenga la placa en la incubadora hasta la siembra en 37 °C/5% CO2de la célula. Nota: No permita que los pocillos recubiertos de laminina secar.</li>
	<li>
Preparar una suspensión de 3 x 105 células/mL en mTeSR1 suplementado con inhibidor de roca de 10 μm Y27632. Nota: La densidad de siembra para cada línea celular requieren de optimización.<ol>
<li>Aspirar el medio de una placa Petri con una cultura no diferenciada de hPSCs en cerca de 75% a 85% confluencia cultivada en LN-521, como describió anteriormente12. Nota: hPSCs se cultivan en LN-521, en mTSER1 con el medio cambiado cada 24 h y pasados regularmente una vez que las células alcancen el 80% de confluencia como se describió anteriormente12.</li>
		<li>Lavar las células con 5 mL de temperatura ambiente 1 x DPBS (sin Ca2 +/Mg2 +) y aspirar el búfer.</li>
		<li>Añadir 5 mL de 1 x suave reactivo de disociación celular a las células e incubar a 37 ° C durante 6 a 8 min de disociación celular. Nota: Para detener la reacción, examinar la separación de las células de la matriz bajo el microscopio. Las células deben ser parcialmente separadas de la placa. Si no, prolongar la incubación por un minuto extra de 1 a 2.</li>
		<li>Termine la reacción aspirando el reactivo de disociación celular suave y añadir 5 mL de mTeSR1 frescas, suplementado con inhibidor de roca 10 μm Y27632 a las células. Use un raspador celular para las células de la matriz y la pipeta hacia arriba y abajo usando una punta de P1000 varias veces para mezclar.</li>
		<li>Contar las células viables usando un hemocitómetro basado en exclusión tinción de azul de tripano y preparar la suspensión de células con concentraciones requeridas.</li>
		<li>Pipetear la cantidad deseada de las células en un tubo de centrífuga de 15 mL o 50 mL estéril y desactivación de las células por centrifugación a 115 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Nota: Para la placa bien uno 96, 5 mL de medio de mTeSR1 con 3 x 105 células/mL se requiere para la línea de celular H9.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender suavemente el precipitado de células hasta obtener una solución homogénea a 37 ° C en mTeSR1 suplementado con inhibidor de roca de 10 μm Y27632. Nota: Se recomienda el uso de inhibidor de la roca pues mejora celular supervivencia post re-galjanoplastia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 50 μl de la suspensión de células en la placa bien 96 con 50 μl de mTeSR1 con el inhibidor de roca de 10 μm Y27632.</li>
	<li>Después de la siembra, devolver las placas a la incubadora de la célula a 37 °C/5% CO2 durante 24 h permitir que las células a conectar.</li>
	<li>Examinar las células al día siguiente y retirar el inhibidor de la roca una vez que se ha establecido el contacto célula a célula. En el 40% de confluencia, cambie a medio de diferenciación (figura 1B). Nota: Si la confluencia celular es superior a 40%, las placas no son adecuadas para la diferenciación de CLH con la línea de celular H9.</li>
</ol>2. diferenciar hPSCs hepatocitos como células en Lamininas recombinante en 96 placas bien
<ol><li>
Preparar la diferenciación de factores de crecimiento y medio.
	<ol>
<li>Prepare humano Activin A solución (100 μg/mL) disolviendo polvo de activina A humanos en estéril 0.2% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Alícuota del caldo y almacenar a-20 ° C. Utilizar en el 1:1, 000.</li>
		<li>Prepare el ratón Wnt3a solución (10 μg/mL) por disolución de ratón Wnt3a polvo en BSA 0,2% estéril. Alícuota del caldo y almacenar a-20 ° C. Utilizar 1: 200.</li>
		<li>Prepare el hepatocito humano del factor de crecimiento (HGF) solución (10 μg/mL) disolviendo polvo HGF humano en BSA 0,2% estéril. Alícuota del caldo y almacenar a-20 ° C. Utilizar al 1: 1000.</li>
		<li>Preparar la solución stock de Oncostatina M (OSM) (20 μg/mL) disolviendo el polvo en BSA 0,2% estéril. Alícuota del caldo y almacenar a-20 ° C. Utilizar en el 1:1, 000.</li>
		<li>Endodermo definitivo: preparar medio de diferenciación de endodermo, que consiste en 2% B27 suplemento (x 50, sin insulina), el 1% de penicilina/estreptomicina (concentraciones finales: 100 UI/mL y 100 μg/mL, respectivamente) a Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) medio basal. Almacenar a 4 ° C y usar dentro de dos semanas. En cada cambio de medio, completar el volumen requerido con la activina A y Wnt3a en concentración final de 100 ng/mL y de 50 ng/mL, respectivamente.</li>
		<li>Hepatoblast diferenciación: preparar medio de diferenciación de hepatoblast, que consiste en reemplazo de suero 20% nocaut (KSR), 0.5% alternativa complemento de L-glutamina, 1% los de aminoácidos no esenciales (AANE), 0.1 mM beta-mercaptoetanol, DMSO 1% y 1% penicilina/estreptomicina (concentraciones finales de 100 UI/mL y 100 μg/mL, respectivamente) a nocaut DMEM (KO-DMEM). Filtrar al vacío y almacenar a 4 ° C. Utilizar dentro de dos semanas.</li>
		<li>Diferenciación del hepatocito: preparar medio de diferenciación del hepatocito, consisten en 1% alternativa complemento de L-glutamina, 10 μm hidrocortisona hemisuccinato 21 sodio sal (HCC), el 1% de penicilina/estreptomicina (concentraciones finales en 100 UI/mL y 100 μg/mL, respectivamente) añadido al medio de HepatoZYME. Almacenar el stock a 4 ° C y usar dentro de dos semanas. Para cada cambio de medio, completar el volumen requerido con HGF y OSM (concentraciones finales de 10 ng/mL y 20 ng/mL, respectivamente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 h post siembra, cuidadosamente Quite el medio utilizando un sistema de pipeta automática de canales electrónicos portátiles y añada 100 μl del endodermo-cebado dulce suplementado con 100 ng/mL A activina y Wnt3a de 50 ng/mL. Nota: El proceso de diferenciación comienza una vez que se ha agregado el medio del endodermo definitivo. Una vez que siembra celular está optimizado, la diferenciación celular se inicia normalmente en 24 h. Medio los cambios se realizan quitando el medio con un sistema de pipeta automática de canales electrónicos mano y dispensar 100 μl de medio fresco usando un dispensador automático de manejo de líquidos con un estándar tubo dispensador cinta a menos que lo contrario especificado. Se utiliza un sistema de pipeta automática de canales electrónicos portátiles con una cabeza del pozo, utilizando 300 μL puntas 96. En Resumen, 90 μl fueron aspirados de la bien evitando cualquier contacto con las células, y es importante no secar las células durante el cambio de medio para reducir el estrés celular.</li>
	<li>Para células de vástago embrionarias humanas (hESCs), cambiar el medio de la diferenciación del endodermo diariamente durante tres días. Si se realiza la diferenciación de las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs), ampliar la etapa de endodermo definitivo para 2 días extras uso de activina A sólo.</li>
	<li>Después de la inducción del endodermo definitivo, cambie a medio KSR/DMSO para la especificación de hepatoblast y cambiar el medio cada 2 días durante 5 días. Nota: Si hay un número de células no inscritos en el pozo, use KO-DMEM sin suplemento para lavar las células una vez antes del siguiente cambio de medio. Debido a la duración de la segunda etapa del Protocolo (5 días), habrá 3 cambios medio con la última de ellas en el último día de la especificación hepatoblast.</li>
	<li>Siguiendo la diferenciación de hepatoblast, interruptor en medio HepatoZYME para maduración de hepatocitos. Lavar las células una vez con HepatoZYME sin el suplemento después de quitar medio KSR/DMSO y añadir 100 μl de HepatoZYME maduración suplementado con 10 ng/mL HGF y 20 ng/mL OSM.</li>
	<li>Cambiar el medio cada 48 h durante 7 a 10 días. En el día 18 de la diferenciación, caracterizar HLCs mediante el análisis de la expresión génica y actividad metabólica P450 CYP.</li>
</ol>3. Caracterización de los hepatocitos como células diferenciadas en Lamininas recombinante
<ol><li>Detectar la expresión de marcadores específicos de hepatocito y polarización mediante inmunotinción.</li>
	<li>Prueba de función metabólica del hepatocito mediante ensayos de CYP P450 como se describe antes de las12.</li>
	<li>Determinar la variación de la placa, contando el número total de células por pocillo por placa.</li>
</ol>4. alto rendimiento Immunocytochemistry y la adquisición de la imagen
<ol><li>El día 18 de diferenciación, lavar los pocillos 3 veces con 1 x DPBS arreglar las HLCs dispensar 50 μl del 4% paraformaldehido (PFA) e incube a temperatura ambiente durante 15 a 30 min. Después de la fijación, lavar tres veces con SAFT (0,1% tween) (sin Ca2 +/Mg2 +) utilizando una arandela de placa automático. Nota: Todos lavados en esta sección se realizan utilizando una arandela de placa automático a menos que se especifique lo contrario. Todos los lavados se realizan siguiendo el mismo protocolo.</li>
	<li>Permeabilizar la membrana por dispensar 100 μl de SAFT (sin Ca2 +/Mg2 +) e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación, realizar el bloqueo de la proteína por dispensar 100 μl de BSA de 10% en SAFT e incubar durante 1 h en suave agitación con un agitador de placa. Después de bloquear la proteína, añada 50 μl de 1% de BSA en SAFT que contiene los anticuerpos primarios, incubar a 4 ° C durante la noche con suave agitación con un agitador de placa. Nota: No lave entre bloque y anticuerpos además de proteína.</li>
	<li>Después de 24 h, lavar tres veces con 1 x DPBS (sin Ca2 +/Mg2 +) y añadir el anticuerpo secundario por dispensar 50 μl de 1% de BSA en SAFT. Incubar 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Después de la incubación del anticuerpo secundario, lavar 3 veces con 1 x DPBS. Añadir 50 μl de DPBS con DAPI (10 μg/mL) e incúbelo durante 5 – 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Por último, lavar 3 veces con DPBS y dejar 100 μl de 1 x DPBS en el pozo. Las placas están listas para la proyección de imagen. Nota: Las placas deben almacenarse a 4 ° C en la oscuridad hasta la proyección de imagen.</li>
	<li>Imagen de la placa mediante un sistema de proyección de imagen de alto contenido y adquirir varios campos en el pozo para obtener una buena representación del pozo. Cuantificar la expresión de los diferentes marcadores en el HLCs mediante software de Columbus (software de sistema de análisis de imágenes alto contenido). Nota: Colón es un software de análisis de contenido de alta, que ofrece análisis de segmentación de la célula para el fenotipado de la célula. Resultados similares se pueden lograr mediante el uso de CellProfiler, un software de código abierto para el análisis cuantitativo de imágenes biológicas22.</li>
</ol>

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</ol>

Prof. David C. Hay es co-fundador y director de Stemnovate Limited.
Prof. David C. Hay es director de HigherSteaks Limited.

Nuestro procedimiento semiautomático es eficiente, confiable y económico, permitiendo la producción de HLCs a escala (figura 1). No hubo ninguna diferencia significativa en cuanto al número de células entre los pozos de la placa, haciendo de esta plataforma un enfoque adecuado para el cribado basadas en células (figura 2). Además, el flujo de trabajo de semiautomatización permite producir gran cantidad de placas a la vez, que no era posible antes de utilizar procesos manuales5,12.
Lo importante es el proceso de automatización no impacto sobre los rendimientos de la diferenciación, con la mayoría de las células que expresan HNF4α (89.2% ±2) y Alba (92.8% ±6) (figura 3). HLCs también expresaron las enzimas CYP P450 CYP2D6 y CYP3A4 y muestran actividad metabólica CYP1A2 y CYP3A comparable a anteriores experimentos divulgados (figura 3)5. A pesar de la estandarización del Protocolo, confluencia celular antes de la diferenciación es fundamental para la diferenciación de CLH pura. Por lo tanto, garantizar una distribución buena célula en el pozo es una consideración importante (figura 1). Esto ha demostrado para ser línea celular dependiente, por lo tanto es necesaria para cada célula línea antes escala optimización de siembra y densidad de la célula.
En su forma actual, esta plataforma no es conveniente producir grandes cantidades de HLCs para aplicaciones clínicas, y es muy probable que esto se logrará mediante el uso de biorreactores y las fábricas de la célula. Sin embargo, la metodología desarrollada permite la generación rápida de células del hígado humanas enfermedad modelado, detección de droga o drogas estudios de reasignación. Por otra parte, el ensayo es favorable a la multiplexación, permitiendo la generación de conjuntos de datos multiparamétrico para análisis mecanicista. A futuro, también creemos que esta tecnología podría aplicarse a sistemas más complejos en vitro como diferenciación 3D o como plataforma para mejorar el fenotipo HLC en vitro.
En conclusión, creemos que nuestro sistema simple y semi-automatizado aumentará rendimiento experimental y reducir la variación experimental, mejorando así la calidad de los conjuntos de datos biológicos y su extrapolación hacia la fisiología humana.

Hepatocitos primarios humanos (PHHs) representan el estándar actual para la investigación biomédica hígado. A pesar de sus ventajas, PHHs representan una fuente limitada de hepatocitos maduros con fenotipo inestable1. Células de vástago embrionarias humanas (ESCs) y las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSC) se han propuesto como un poderoso recurso para la investigación biomédica, que promete una fuente renovable de tejido humano, incluyendo hígado2,3,4 . Procedimientos actuales de la diferenciación del hepatocito generan células que expresan marcadores de hepatocitos, genes y funciones similares a PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Más recientemente, el uso de materiales definidos y matrices como Lamininas recombinante, tiene fenotipo de la célula mejorada y reproducibilidad experimental5,12,13,14.
Técnicas de cultivo tradicional de la célula dependen en gran medida el pipeteo manual, que es tiempo y propenso a errores. Esto limita el rendimiento de la prueba y el formato de placa se puede trabajar con. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios que describen la generación de HLCs es mano de obra en la naturaleza y por lo tanto, pequeñas en tamaño15,16,17.
Corriente de los avances en el manejo de líquidos y sistemas de pipeteo, en combinación con la microscopía automatizada y analizadores de laboratorio, han permitido desarrollar procedimientos que minimizan la necesidad de intervención humana. Hemos tomado ventaja de estas tecnologías y desarrollando un sistema semiautomático de diferenciación para generar grandes cantidades de tejido del hígado humano básica y la investigación biomédica aplicada. Este enfoque se puede realizar con líneas de iPSC con ajustes menores es necesarios, dependiendo de la línea celular y humana ESC. Combinando este sistema con alto contenido de análisis, nos demuestran que phenotyping HLC puede ser menos desperdiciador de tiempo y se realizan en escala18,19,20,21.
En Resumen, la automatización de las técnicas de cultivo celular descritos ha llevado a mejoras en rendimiento de análisis, gestión de tiempo experimental y confiabilidad.

<table><tbody><tr><td>405 LS Lavadora</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS con Calcio y Magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>14040133</tr><tr><td>Reactivo suave para la disociación celular</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>GripTips para VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Activina Humana A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de hepatocitos humanos</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatina humana M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Laminina recombinante humana 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona 21-hemisuccinato sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Reemplazo de suero</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Dispensador de reactivos</td><td>ThermoFisher</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Operetta Sistema de imagen de alto contenido</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante Wnt3a</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Casete dispensador de tubo estándar</td><td>ThermoFisher 24072670</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 Pipeta electrónica de 96 canales</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>solución de formaldehído 4%, tamponada, pH 6,9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1,00496&nbsp; EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Sistema de ensayo y cribado</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Sistema de ensayo y cribado</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (ratón)</td></tr><tr><td>Alfafetoproteína</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (ratón)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>Universidad de Dundee</td><td>Universidad de Dundee</td><td>1:200 (ovejas)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>Universidad de Dundee</td><td>Universidad de Dundee</td><td>1:200 (ovejas)</td></tr><tr><td>HNF-4&alfa;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (conejo)</td></tr><tr><td>E-cadherina</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (ratón)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 488 (anticuerpo secundario)</td><td>Life technologies</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-ovejas 488 (anticuerpo secundario)</td><td>Life technologies</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-conejo 488 (anticuerpo secundario)</td><td>Tecnologías de vida</td><td>A-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

producción semi automatizada de hepatocitos como células de células madre pluripotentes

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Células madre pluripotentes humanas representan una fuente renovable de tejido humano. Nuestra investigación se centra en generar tejido hepático humano de células madre embrionarias humanas (hESCs) e inducida por células madre pluripotentes (iPSCs). Los procedimientos actuales de diferenciación generan hepatocitos como las células humanas (HLCs) mostrando una mezcla de rasgos fetales y adultos. Para mejorar el fenotipo de la célula, totalmente definimos nuestro procedimiento de diferenciación y el nicho de la célula, dando por resultado la generación de poblaciones de células que muestran mejores genes y función. Mientras que estos estudios motivo de progreso, la capacidad para generar grandes cantidades de placas bien multi para la investigación ha estado limitada por procedimientos intensiva mano de obra y variación de lote a lote. Para abordar este tema, hemos desarrollado una plataforma semi-automatizada para diferenciar células madre pluripotentes en HLCs. vástago siembra celular y diferenciación se realizaron con el manejo de líquidos y sistemas automáticos de pipeteo en formato placa de 96 pocillos. A raíz de la diferenciación, fenotipo de la célula se analizó mediante microscopía automatizada y un luminómetro bien multi.

Diferenciación celular fue realizada usando una línea de células madre embrionarias (H9). La plataforma semiautomático se utilizó para distinguir y caracterizar las células (figura 1A). Un dispensador automático de manejo de líquidos fue utilizado para cubrir la matriz y las células de la semilla. Diferenciación celular se inició cuando las células alcanzaron confluencia de 40% (día 0). Cambios de medios de comunicación se realizaron mediante un sistema de pipeta automática de canales electrónicos portátiles para eliminar el medio y el dispensador de manejo de líquidos por medio además (figura 1A). Fijación de células y tinción se realizaron utilizando el dispensador automático de manejo de líquidos en combinación con la arandela de placa automático. La proyección de imagen y cuantificación se realizaron mediante un sistema de imágenes de alto contenido y software de Columbus. Actividad de citocromo P450 se midió mediante un ensayo establecido. Tras la incubación del substrato, sobrenadantes de células se cosecharon, y bioluminiscencia grabado usando un lector de microplaca multimodo (figura 1A). Además, la microscopía de contraste de fase convencional se utilizó para medir los cambios en la morfología celular durante la diferenciación del hepatocito (figura 1B).
El día 18, la variabilidad en el número de células entre pozos fue examinada tras DAPI tinción (figura 2A). Siete campos de vista fueron capturado por el bien y el número de núcleos cuantificados (figura 2A). No se detectó ninguna diferencia estadística entre pozos con un promedio de ±3 41.662, 366 células por pozo (figura 2B).
En el día 18, HLCs fueron fijo teñidos para marcadores de hepatocitos típico (figura 3A-G) y probados para la actividad del CYP P450. HLCs expresaron marcadores de hepatocitos como HNF4α (89.2% ±2 las células positivas), Alba (±6 92.8% de células positivas), AFP (61.8% ±2 células positivas). HLCs también expresan proteínas del CYP P450, CYP2D6 y CYP3A4 y muestran un aspecto distinto de la poligonal como se muestra en la expresión de la proteína cadherina. Actividad de CYP P450 HLCs fue medida en el día 18. HLCs mostraron actividad CYP1A2 en ±45 295.906, 828 RLU/mL/mg de proteína y CYP3A en 1.066.112 ±177, 416 RLU/mL/mg de proteína (figura 3 H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> Figura 1: diferenciación del hepatocito de PSCs en el 96 bien formato. (A). esquema del equipo utilizado para la diferenciación celular semi-automatizar, fijación, tinción, proyección de imagen y actividad funcional. (B). representante de cambios en la morfología celular durante la diferenciación de la HLC. Brevemente, PSC está preparado hacia el endodermo definitivo, seguido por la especificación de hepatoblast caracterizado por las células mostrando guijarro-como morfología y antes de la maduración del hepatocito con células adquiriendo forma poligonal. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> Figura 2: evaluación de la variabilidad de pozo a pozo de HLCs. (A) representación de una 96 placa bien vista de HLCs teñidas con DAPI. Barra de escala = 1 mm. (B) cuantificación de número de células por pocillo. Promedio de número de células por pozos en columnas (arriba) y filas (abajo), de siete campos de vista por bien y cuantificado utilizando el software de Columbus. Número promedio de la célula a través de la placa es 41.662 ± 3.366 SEM las células por pocillo. No hubo diferencias estadísticamente significativas se observaron entre pozos. Se empleó un ANOVA unidireccional con pruebas post-hoc de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> Figura 3: expresión de marcadores de hepatocitos y medición de la actividad del CYP P450 en HLCs al día 18. (A) el porcentaje de factor nuclear 4 alfa de hepatocito (HNF4α) expresión ± SEM se basa en treinta pozos con diez campos de vista por pozo. (B) el porcentaje de expresión de albúmina (ALB) +/-SEM, se basa en 3 pocillos distintos con diez campos de vista por pozo. (C) el porcentaje de alfa-fetoproteína (AFP) +/-SEM se basa en 3 pocillos distintos con diez campos de vista por pozo. (D) cadherina-tinción. (E) de CYP2D6 tinción. (F) tinción de CYP3A4. (G). inmunoglobulina G (IgG) control de la coloración. Barra de escala = 50 μm. (H) CYP P450 1A2 y 3A actividad metabólica en HLCs al día 18. El representa datos biológicos seis repeticiones +-actividad SEM. es citado como unidades relativas de luz (RLUs) /mL por 1 mg de proteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe un enfoque semiautomático para producir células similares a hepatocitos de células de vástago pluripotent humana en formato de 96 placa bien. Este proceso es rápido y eficiente, permitiendo que la producción de calidad asegurada lotes de hepatocitos como las células para investigación básica y aplicada.

Producción semi automatizada de hepatocitos como células de células madre pluripotentes

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Este método produce células similares a hepatocitos altamente reproducibles en un formato de 96 pocillos mediante el uso de plataformas semiautomatizadas. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, rentable, con variación reducida y permite la producción masiva de placas de 96 pocillos de células similares a los hepatocitos. Prepare una solución de cinco microgramos por mililitro de laminina 521 descongelada diluyéndola en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco o DPBS con calcio y magnesio.Utilice un dispensador automático de manejo de líquidos con un casete dispensador de tubo estándar para agregar 50 microlitros de la solución de laminina 521 por pocillo de una placa de 96 pocillos. Incubar las placas recubiertas de laminin 521. Después de la incubación, aspire la solución de laminina 521 de la superficie recubierta, utilizando un adaptador de aspiración de ocho canales y evite cualquier contacto con la superficie recubierta.Agregue inmediatamente 50 microlitros por pocillo de medio mTeSR1 suplementado con 10 micromolares de quinasa asociada a Rho o inhibidor de ROCK Y27632. Mantenga la placa en la incubadora hasta la siembra de la célula a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Desde una suspensión celular de tres veces 10 hasta la quinta célula por mililitro en medio mTeSR1 suplementado con 10 micromolares inhibidor de ROCK Y27632.Agregue 50 microlitros de la suspensión de celdas en la placa. Después de la siembra, regrese las placas a la incubadora de celdas a 37 grados centígrados, 5% de CO2, durante 24 horas para permitir que las celdas se adhieran. Después de tomar la placa de la incubadora, examínela al día siguiente y verifique que se haya establecido el contacto célula a célula y que la confluencia alcance el 40%Luego cambie a un medio de diferenciación.La confluencia celular apela el inicio de la diferenciación. Es clave para lograr una buena calidad de células similares a los hepatocitos. El inicio de la diferenciación, una vez que la confluencia alcanza el 40%Si la confluencia es mayor, las placas no son adecuadas para la diferenciación.24 horas después de la siembra, retire con cuidado el medio con una pipeta automática de canal electrónico manual. Y agregue 100 microlitros de medio de cebado endodermo fresco suplementado con 100 nanogramos por mililitro de activina A y 50 nanogramos por mililitro de Wnt3a. Después de la inducción definitiva del endodermo, cambie a un medio KSR DMSO para la especificación del hepatoblasto.Y cambie el medio cada dos días durante cinco días. Después de la diferenciación del hepatoblasto, retire el medio KSR DMSO y lave las células una vez con el medio HepatoZYME sin el suplemento. Después del lavado, agregue 100 microlitros de medio de maduración HepatoZYME suplementado con 10 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de hepatocitos y 20 nanogramos por mililitro de oncostatina M. Cambie el medio cada 48 horas durante siete a diez días.En el día 18 de diferenciación, fije las células y realice la inmunocitoquímica, utilizando el manejo de líquidos y el lavado automático de placas. Guarde las placas a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta la toma de imágenes. A continuación, con la obtención de imágenes y la cuantificación.El día 18, se examinó la variabilidad y el número de células entre pocillos después de la tinción con DAPI. Después de capturar siete campos de visión por pozo y cuantificar el número de núcleos, no se identificaron diferencias estadísticas. La tinción de células similares a hepatocitos humanos o HLC en el día 18 mostró expresión de los marcadores de hepatocitos HNF4 alfa, albúmina y AFP.Los HLC también expresaron las proteínas CYP P450, CYP2D6 y CYP3A4 mostraron actividad metabólica CYP P450. Los HLC también mostraron una apariencia poligonal distintiva, mostrada por E-cadherin. A pesar de la estandarización de este protocolo, la confluencia celular antes de la diferenciación es crítica para la diferenciación de las HRC.Vemos la célula independiente. Por lo tanto, se requiere la siembra de venta y la optimización de la densidad para cada línea celular. Una vez dominada, esta metodología permite la generación rápida de múltiples placas de células hepáticas humanas para el modelado de enfermedades, el cribado de fármacos o los estudios de propuesta de fármacos.Este sistema permite la generación de conjuntos de datos multiparamétricos para el análisis mecanicista de la biología de los hepatocitos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Aprenda a producir hepatocitos a partir de células madre pluripotentes mediante un protocolo semi automatizado en placas de 96 pocillos. Este método rápido y rentable permite la producción masiva de células con marcadores funcionales para modelado de enfermedades hepáticas y cribado de fármacos.

Producción semi automatizada de hepatocitos como células de células madre pluripotentes

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