Enriquecimiento de fosfopéptidos acoplada con espectrometría de masa libre de etiqueta cuantitativa para investigar la Phosphoproteome en cáncer de próstata

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cualquier campo de investigación donde la señal de fosforilación sea de interés, como el campo del cáncer, para evaluar los cambios en las redes de señalización después de la resistencia terapéutica. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden identificar miles de fosfopéptidos de una manera relativamente sencilla y económica para evaluar globalmente el fosfoproteoma. Para recolectar tejido tumoral, pese el tumor y en un tubo de ensayo de cultivo, agregue dos mililitros de tampón de lisis helado por cada 100 miligramos de tejido.

A continuación, utilice un homogeneizador de mano o de sobremesa para homogeneizar el lisado. Para reducir y alcoholizar la muestra, caliente el tubo a 95 grados centígrados durante cinco minutos, luego enfríe la muestra en hielo durante 15 minutos. Mientras aún está en hielo, sonique el lisado tres veces, luego caliente la muestra a 95 grados Celsius durante cinco minutos.

Coloque el tubo de sonicación en un rotor de cubo oscilante y centrifugue el lisado a 3.500 g y 15 grados centígrados durante 15 minutos, luego recoja el sobrenadante y deseche el pellet. Para digerir el lisado, use 100 milimolar tris para diluir la muestra 12 veces para reducir la cantidad de guanidinio. Para obtener cinco miligramos de proteína, agregue 10 microgramos de lisil endopeptidasa o lys-C e incube la muestra a temperatura ambiente durante cinco o seis horas.

Prepare un miligramo por mililitro de tripsina tratada con TPCK en un HCL milimolar con 20 milimolares de cloruro de calcio y tripsina agregados en una proporción de 1 a 100 de tripsina a proteína. Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante tres horas. A continuación, añada una alícuota adicional de tripsina al tubo e incube la muestra a 37 grados centígrados durante la noche.

Agregue la muestra a un filtro de corte de 15 mililitros y 10 kilodalton. Centrifugar la muestra en un cubo oscilante o en un rotor de ángulo fijo a 3.500 g y 15 grados centígrados hasta que el volumen del retenido sea inferior a 250 microlitros. A continuación, recoja el flujo y deseche el retenido.

Para acidificar la muestra, agregue aproximadamente 20 microlitros de ácido trifluoroacético al 5% o TFA por mililitro de lisado. Mezcle bien el tubo y use una tira de pH para medir el pH. Si es necesario, agregue 5% adicional de TFA para ajustar el pH a 2.5.

A continuación, conéctelo al extremo más corto de una columna C18 a un colector de vacío. Después de ajustar el vacío entre 17 y 34 kilopascales, use tres mililitros de acetonitrilo 100% y una pipeta de vidrio para humedecer la columna. Equilibrar la columna utilizando una pipeta de vidrio y aplicando dos alícuotas de tres mililitros de 0,1%TFA.

A continuación, cargue la muestra acidificada en la columna. Utilice tres volúmenes de tres mililitros de 0,1 TFA para lavar la columna. A continuación, aplique dos mililitros de 40%ACN 0.1%TFA para eluir la muestra y recoja dos fracciones de dos mililitros en tubos de cultivo de vidrio.

Con parafilm, cubra los tubos eluyentes y use una aguja de calibre 20 para perforar de tres a cinco agujeros en la cubierta antes de liofilizar las muestras durante la noche. Vuelva a suspender el polvo liofilizado con 0,5 mililitros de inmunoprecipitación helada o tampón de unión IP en cada fracción. Transfiera el volumen de resuspensión de 0,5 mililitros de la segunda fracción al tubo con la primera fracción y guarde la punta de la pipeta.

Utilice otros 0,5 mililitros de tampón IP para enjuagar cada tubo de liofilización antes de transferir el contenido al tubo criogénico, luego repita el enjuague con dos mililitros de tampón IP. Después de usar un P200 con una punta cortada para transferir el stock de 0,5 miligramos por mililitro de suspensión de perlas de anticuerpos al tubo de microfuga, agregue 450 microlitros de tampón de unión IP frío como hielo para lavar 50 microlitros de suspensión de perlas de anticuerpos 4G10 y 25 microlitros de suspensión de perlas de anticuerpos 27 B10.4 en un tubo de microfuga. Centrifugar el tubo a 100 g y cuatro grados centígrados durante un minuto.

Después de aspirar el sobrenadante, agregue un volumen igual al de la suspensión original del tampón de unión IP para volver a suspender las perlas. Agregue perlas de pY prelavadas a la solución de muestra resuspendida en los criotubos con tapón de rosca, luego incube a cuatro grados Celsius en un rotador de extremo a extremo durante la noche. Después de girar las perlas, guarde el sobrenadante que se utilizará para enriquecer los péptidos pST.

A continuación, utilice 300 microlitros de tampón de unión IP para resuspender las perlas y transferirlas a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Centrifugar las muestras a 100 g y cuatro grados centígrados durante un minuto. Luego, con 500 microlitros de tampón aglutinante IP, lave las perlas tres veces.

Lavar las perlas cuatro veces con 450 microlitros de bicarbonato de amonio de 25 milimolares pH 7,5. Sumerja una punta de carga de gel ligeramente por debajo de la superficie del cordón y aspire completamente el sobrenadante. Agregue cuatro veces el volumen de cuentas de 0.1%TFA a las cuentas.

Luego mézclalos bien e incuba el tubo en una termobatidora a 1.000 rpm y 37 grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera la resuspensión a un filtro de centrifugación de 0,2 micrómetros y centrifugue el filtro a 850 g durante un minuto. Después de transferir la elución a un tubo de microcentrífuga de unión a proteínas de baja proteína, concentre al vacío el eluyente hasta que se seque a 40 grados Celsius con un tiempo de calor de 300 minutos durante la noche.

Para preparar las perlas de óxido de titanio contenidas en las puntas, agregue 200 microlitros de 100% ACN. A continuación, inviértelo y mueva el extremo estrecho para mover el líquido hacia la tapa. Con una cuchilla de afeitar, corte la punta y colóquela sobre el tubo de unión bajo en proteínas.

A continuación, retire el tapón e inserte una micropipeta para extraer el ACN restante antes de repetir el lavado. Preacondicionar el dióxido de titanio con 500 microlitros de 100% ACN dos veces. A continuación, acondicionar el dióxido de titanio con 500 microlitros de tampón de fosfato de sodio 0,2 molar pH 7 dos veces.

Finalmente, use 300 microlitros de tampón de equilibrio para lavar las cuentas tres veces. Agregue 400 microlitros de 50%ACN 0.1%TFA al tubo de unión bajo en proteínas. A continuación, añade 84 microlitros de ácido láctico.

Transfiera los fosfopéptidos resuspendidos al tubo de unión de proteínas bajas e incube a temperatura ambiente utilizando un rotador de extremo a extremo durante una hora. Después de peletizar las cuentas, use 300 microlitros de tampón de equilibrio para lavarlas dos veces y girarlas. Con 300 microlitros de tampón de enjuague, enjuague las perlas dos veces.

A continuación, transfiéralos a un filtro de centrifugado de 0,2 micrómetros. Después de girar, transfiera la unidad de filtro a un tubo limpio de unión a proteínas de 1,5 mililitros y con 200 microlitros de amonio al 0,9% en agua, eluya el contenido dos veces. Después de verificar el pH, concentre al vacío el eluyente hasta que se seque durante la noche para evaporar el amoníaco.

Para desalar los péptidos para el análisis de MS, reconstituya los fosfopéptidos con 15 microlitros de 0,1% de TFA. Limpie la muestra con una punta C18 con una capacidad de unión de cinco microgramos y siga el protocolo del fabricante. Finalmente, después de secar completamente el volumen de elución por concentración de vacío, vuelva a suspender los fosfopéptidos secos en 12,5 microlitros de solución de espectrometría de masas.

Este gel de lisado predigerido teñido con Coomassie confirma la presencia de proteínas, mientras que la tinción del lisado postdigerido confirma la digestión completa. Para una digestión completa, no deben aparecer bandas por encima de 15 kilodaltons, excepto las bandas de 30 kilodalton y 23,3 kilodalton para lys-C y tripsina respectivamente. La adición de lys-C también reduce el número de escisiones perdidas.

La inmunoprecipitación de pY separa eficazmente el pY de los péptidos pST, donde en promedio el 85% de los fosfopéptidos identificados a partir de la preparación de pY son pY y más del 99% de los fosfopéptidos identificados a partir de la preparación de pST son pST. El dióxido de titanio se utiliza para enriquecer los fosfopéptidos en ambas preparaciones. El porcentaje esperado de péptidos fosforilados en la preparación MS ready está entre el 30 y el 50% y la mayoría de los fosfopéptidos detectados tienen un grupo fosforilo simple o doble.

Después de realizar la espectrometría de masas, los archivos RAW de MS se cargan en un software de análisis de MS. Como se ilustra aquí, establecer un límite de probabilidad de localización superior a 0,75 filtra aproximadamente el 5% de los péptidos pY y el 15% y el 34% de los péptidos pS y pT, respectivamente. Después de aplicar estos filtros, el número esperado de identificaciones de fosfopéptidos al final del análisis de MS es de aproximadamente 300 péptidos pY para cinco miligramos de la proteína de partida y alrededor de 7.500 péptidos pS y 640 péptidos pT para 2,5 miligramos de la cantidad de péptido de partida de las preparaciones de enriquecimiento respectivas.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis días si los pasos pY y pST se realizan en paralelo. Sin embargo, para más de ocho muestras, realice los pasos en secuencia para reducir el error técnico durante cuatro días adicionales. Al intentar estos procedimientos, es importante recordar que debe concentrarse en los detalles.

Cada paso es importante y puede afectar la calidad de las preparaciones finales, incluidos los controles de calidad necesarios es fundamental. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo extraer y digerir proteínas, seguido del enriquecimiento de fosfopéptidos para el análisis mediante espectrometría de masas para investigar los cambios globales en el fosfoproteoma.