Name: Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a aislar células endocrinas pancreáticas de ratón para secuenciación de ARN unicelular. Este método permite analizar la diferenciación y heterogeneidad celular en el desarrollo pancreático.

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Agradecemos el Centro Nacional de Ciencias de la proteína, Beijing (Universidad de Pekín) y el centro Tsinghua de Pekín para la plataforma de computación de Ciencias de la vida. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de ciencia y tecnología de China (2015CB942800), la nacional Ciencias naturales Fundación de China (31521004, 31471358 y 31522036) y financiación del centro Tsinghua de Pekín para Ciencias de la vida a C. R.X.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, hemos demostrado un método efectivo y fácil de usar para el estudio de los perfiles de expresión de la sola célula de las células β pancreáticas. Este método podría utilizarse para aislar las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales y realizar análisis transcriptómico de unicelulares.
El paso más crítico es el aislamiento de las células β solo en buen estado. Páncreas totalmente inundadas responden mejor a la digestión subsiguiente. Insuficiente...

El páncreas es un órgano vital metabólico en mamíferos. El páncreas está compuesto por compartimientos endocrinos y exocrinos. Las células endocrinas pancreáticas, incluyendo las células β productoras de insulina y células productoras de glucagón α, se agrupan juntos en los islotes de Langerhans y coordinadamente regulan la homeostasis de la glucosa sistémica. Resultados de la disfunción de las células endocrinas en la diabetes mellitus, que se ha convertido en un problema de salud pública importante en todo el mundo.
Las células endocrinas pancreáticas derivan de Ngn3+ progenitores durante embriogénesis1. Más tarde, durante el período perinatal, las células endocrinas proliferan a islotes inmaduro forma. Estas células inmaduras continúan desarrollar y gradualmente se convierten en islotes de madurados, que se convierten en ricamente vascularizados para regular la homeostasis de la glucosa de sangre en adultos2.
Aunque se ha identificado un grupo de factores transcripcionales que regulan la diferenciación de la célula β, el camino preciso de la maduración de las células β es todavía confuso. Además, el proceso de maduración de la célula β implica también la regulación de la célula número expansión3,4 y la generación de heterogeneidad celular5,6. Sin embargo, los mecanismos de regulación de estos procesos no han sido bien estudiados.
Sola célula secuenciación del RNA es un enfoque potente perfil subpoblaciones celulares y traza de vías del desarrollo de linaje celular7. Tomando ventaja de esta tecnología, la clave de los eventos que ocurren durante el desarrollo de islotes pancreáticos pueden ser descifrados en el nivel unicelular8. Entre los protocolos de la secuencia de RNA unicelular, Smart-Sec2 permite la generación de cDNA de larga duración con mejor sensibilidad y precisión y el uso de reactivos estándar en menor costo9. Smart-Sec2 tarda aproximadamente dos días para construir una biblioteca de cDNA de la secuencia10.
Aquí proponemos un método para el aislamiento de las células β marcados con fluorescencia desde el páncreas del feto adulto Ins1 RFP ratones transgénicos11usando celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación, y el rendimiento de transcriptómicos analiza en el sola célula nivel, usando la tecnología Smart-Sec2 (figura 1). Este protocolo puede extenderse para analizar los transcriptomas de todos los tipos de células endocrinas pancreáticas en Estados normales, patológicos y el envejecimiento.

<table><tbody><tr><td>Colagenasa P</td><td>Roche</td><td>11213873001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25 %), rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #4 Roboz</td><td></td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>30 G Aguja BD 1/2" Longitud</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de poliestireno de fondo redondo con tapa de filtro de celdas</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de PCR de 96 pocillos</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-C</td><td></td></tr><tr><td>Estera de sellado de silicona</td><td>Axygen</td><td>AM-96-PCR-RD</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PCR de pocillo fino</td><td>Extragene</td><td>P-02X8-CF</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta capilar</td><td>Sutter</td><td>B100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Life Technologies 4456740</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>mix New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa recombinante</td><td>Takara</td><td>2313</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de primera cadena (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Betaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-43-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td><td>Vazyme</td><td>N411-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q121-02</td><td></td></tr><tr><td>TruePrep DNA Library Prep Kit de preparación V2 para Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD502</td><td>Incluye 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td></tr><tr><td>TruePrep Index Kit V3 para Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD203</td><td>Incluye 16 N6XX y 24 N8XX</td></tr><tr><td>Kit de análisis de fragmentos NGS de alta sensibilidad</td> Advanced <td>Analytical Technologies</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS sin Ca2+ y Mg2+</td><td></td><td></td><td>138 mM de NaCl; 5,34 mM KCl 4,17 mM NaHCO3; 0,34 mM Na2HPO4 0,44 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de aislamiento <td>1 y veces; HBSS que contiene 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,4</td></tr><tr><td>tampón</td><td></td><td></td> FACS <td>1 y veces; HBSS que contiene 15 mM de HEPES, 5,6 mM de glucosa, 1% de FBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN cebador</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR</td></tr> <tr><td>cebadores</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Imprimación</td><td></td><td></td> directa <td>5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Imprimación</td><td></td><td></td> inversa <td>5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Imprimación</td><td></td><td></td> directa <td>5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Imprimación</td><td></td><td></td> inversa <td>5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'</td></tr></tbody></table>

análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Las células endocrinas pancreáticas, que se agrupan en islotes, regulan la estabilidad de la glucosa sanguínea y el metabolismo energético. Los tipos de células distintos en islotes, incluyendo células β secretoras de insulina, se distinguen de los comunes progenitores endocrinos durante la fase embrionaria. Inmaduras células endocrinas amplían a través de la proliferación celular y maduran durante un periodo de desarrollo postnatal largo. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a estos procesos no están claramente definidos. Sola célula secuenciación del RNA es un enfoque prometedor para la caracterización de poblaciones celulares distintas y las vías de diferenciación de seguimiento celular linaje. Aquí, describimos un método para la secuenciación del RNA unicelular de células β pancreáticas aisladas de páncreas embrionarios, neonatales y postnatales.

Se disecaron páncreas de ratones embrionarios, neonatales y postnatales (figura 2A y 2B). Para los ratones mayores de postnatal día 18, el efecto digestivo depende del grado de perfusión; por lo tanto, la inyección es el paso más importante para el aislamiento de islotes pancreáticos (figura 2-2E y tabla 6). Se inyectó tanto colagenasa como fue posible llenar el...

Se describe un método para el aislamiento de las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales seguidos por la secuencia de RNA unicelular. Este método permite el análisis del desarrollo del linaje endocrino pancreático, de células dinámicas heterogeneidad y transcriptómicos.

Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Este método puede tener respuestas preguntas clave en el campo de los islotes pancreáticos sobre la diferenciación del linaje de los islotes pancreáticos, la maduración y la regeneración. La principal ventaja de esta técnica es que permite la recolección de células de islote pancreático único para la generación de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de alta calidad. La aplicación de esta técnica se extiende hacia la terapia de la diabetes y las otras enfermedades relacionadas con el endocrino pancreático a través del análisis transcriptómico de células monorinas pancreáticas en las condiciones patológicas.La demostración visual de este método es crítica, ya que la inserción de la aguja en el estrecho conducto biliar del páncreas para la perfusión puede ser complicada. Para embriones embrionarios día 17.5. Después de abrir la cavidad abdominal, usa pinzas de codo para transferir el tejido visceral a una placa inferior negra de seis centímetros que contenga PBS frío.Use fórceps para separar el páncreas del tejido visceral. Y coloque el tejido pancreático en un vial de 20 mililitros que contenga cinco mililitros de solución de colágeno frío. Para el día post natal de cero

single-cell-transcriptomic-analyses-mouse-pancreatic-endocrine

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Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se describe un método para el aislamiento, cultivo y manipulación de páncreas de ratón embrionario. Esto representa un...

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

El ensayo in vitro función de las células β usando islotes aislados de ratones de Langerhans es un componente importante en el estudio de la fisiopatología de la diabetes y la terapéutica. Mientras que muchas aplicaciones posteriores están disponibles, este protocolo se describe específicamente la medición de intracelular de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) como un parámetro esencial para determinar la función de las células β.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

En esta publicación, se describe un procedimiento rápido y conveniente para el aislamiento y cultivo de las células acinares pancreáticas primarias del páncreas murino. Este método constituye un enfoque valioso para el estudio de la fisiología de las células pancreáticas exocrinas normales / no transformada primarios frescos.

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

En ensayos de colonias in vitro para la detección de auto-renovación y diferenciación de células progenitoras aisladas de páncreas murinos adultos estén concebidas. En estos ensayos, los progenitores de páncreas dan lugar a colonias de células en el espacio de 3 dimensiones en un medio semi-sólido que contiene metilcelulosa. Se describen protocolos para la manipulación de células individuales y caracterización de las colonias individuales.

Los ensayos in vitro de colonias para la caracterización de células progenitoras Tri-potentes Aislado de los murinos adultos Páncreas

A continuación, describimos un método para el aislamiento de células en el microambiente de páncreas, tejido de ratón neonatal y adulto embrionario, centrándose en el aislamiento de las células mesenquimales. Este método permite que los perfiles de expresión génica de células y la secreción de proteínas con el fin de dilucidar las señales extrínsecas que regulan el desarrollo del páncreas, la función y la tumorigénesis.

Aislar y analizar células del páncreas mesénquima por Citometría de Flujo

Aquí, presentamos un protocolo para generar insulina expresando 3D pancreatoids murino de e10.5 flotante disociado progenitores pancreático y el mesenchyme asociado.

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

Aquí, presentamos un protocolo para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de células individuales de islotes pancreáticos humanos aislados utilizando una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basada en gotas.

Secuenciación y análisis de islotes pancreáticos humanos de una sola célula

Las células metaplásicas pancreáticas son precursoras de células malignas que dan lugar a tumores pancreáticos. Sin embargo, aislar células pancreáticas viables intactas es un desafío. Aquí, presentamos un método eficiente para la disociación del tejido pancreático. A continuación, las células pueden utilizarse para la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) o para el cocultivo bidimensional o tridimensional.

Disección de tejido pancreático para aislar células individuales viables

Este protocolo describe cómo generar cortes de páncreas humano a partir de donantes de órganos fallecidos para estudiar la función celular en condiciones casi fisiológicas. Este enfoque innovador permite la investigación de islotes normales y estructuralmente dañados y la intrincada interacción entre los compartimentos endocrinos y exocrinos.

Generación de cortes de tejido pancreático humano para estudiar la fisiología endocrina y exocrina del páncreas

Este protocolo describe el aislamiento de células endoteliales de ratón de páncreas completo.

Aislamiento de células endoteliales pancreáticas de ratón

Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.

Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones

Aprende a aislar células endocrinas pancreáticas de ratón para secuenciación de ARN unicelular. Este método permite analizar la diferenciación y heterogeneidad celular en el desarrollo pancreático.

Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

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