Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

Este método puede tener respuestas preguntas clave en el campo de los islotes pancreáticos sobre la diferenciación del linaje de los islotes pancreáticos, la maduración y la regeneración. La principal ventaja de esta técnica es que permite la recolección de células de islote pancreático único para la generación de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de alta calidad. La aplicación de esta técnica se extiende hacia la terapia de la diabetes y las otras enfermedades relacionadas con el endocrino pancreático a través del análisis transcriptómico de células monorinas pancreáticas en las condiciones patológicas.

La demostración visual de este método es crítica, ya que la inserción de la aguja en el estrecho conducto biliar del páncreas para la perfusión puede ser complicada. Para embriones embrionarios día 17.5. Después de abrir la cavidad abdominal, usa pinzas de codo para transferir el tejido visceral a una placa inferior negra de seis centímetros que contenga PBS frío.

Use fórceps para separar el páncreas del tejido visceral. Y coloque el tejido pancreático en un vial de 20 mililitros que contenga cinco mililitros de solución de colágeno frío. Para el día post natal de cero a 15 ratones, disecciona cuidadosamente todos los lóbulos del páncreas antes de colocar el tejido en la colagenasa.

Para el día post natal 18 a 60 ratones, primero retire el xifoide y extraiga el intestino al lado derecho de la cavidad abdominal. Empuje los lóbulos mediales izquierdo y derecho del hígado a cada lado para exponer la vesícula biliar y el conducto biliar común. Y sujeta el duodeno con un par de pequeñas abrazaderas de recipiente en las posiciones superior e inferior para flanquear el sitio donde el conducto biliar entra en el duodeno.

A continuación, cargue una jeringa de 5 mililitros equipada con una aguja de calibre 30 con solución de colagenasa fría. Y usa el microscopio para insertar la punta de la aguja en la vesícula biliar. Manipule cuidadosamente y suavemente la aguja a través del conducto biliar común.

Y presione el émbolo para perfumar el páncreas con uno a cinco mililitros de la solución de colagenasa según el tamaño del ratón. Cuando se haya perfusado toda la solución, utilice fórceps para transferir inmediatamente el páncreas a un vial de 20 mililitros que contenga cinco mililitros de solución de colágeno frío fresco. Cuando se haya recogido todo el tejido pancreático, coloque el vial en un baño de agua Celsius de 37 grados durante tres minutos, seguido de tres a cinco minutos de agitación suave.

A continuación, filtre el producto digerido a través de un colador de nylon de 0,25 milímetros en un nuevo tubo centrífugo de 50 mililitros. Y utilice una jeringa de 20 mililitros que contenga PBS helado para lavar a fondo el colador. Para el día post natal 18 a 60 pancreata, centrifugar la muestra filtrada y resuspend el tejido en 30 mililitros de PBS frío.

A continuación, decantar la suspensión del tejido en un plato inferior negro de seis centímetros, y utilizar una pipeta de 200 microlitros y un microscopio deseccionamiento para recoger los islotes para su transferencia en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene un pequeño volumen de PBS frío. Para el día embrionario 17.5 después del día natal 15 pancreata, centrifugar el tejido pancreático filtrado y resuspend el pellet en solución de trippsina-EDTA para una incubación de cuatro minutos en un baño de agua de 37 grados Celsius. Al final de la incubación, tratar suavemente de calificar el pellet durante un minuto con una pipeta de 200 microlitro, seguido de la adición de 0,5 veces el volumen de suero bovino fetal frío con un vórtice suave para detener la digestión.

A continuación, recoja el resumen por centrifugación y resusppend las células en 200 microlitros de tampón FACS en un tubo FACS de 5 mililitros para la clasificación por citometría de flujo. Para la recolección y la lysis de una sola célula, alícuota el búfer de lysis celular recién preparado en tubos de PCR de ocho tiras, y transfiera una sola célula a cada uno. Vórtice las muestras para angarer las células para la liberación del ARN, seguido de centrifugación durante 30 segundos a cuatro grados Centígrados, y almacenamiento inmediato en hielo.

Para la transcripción inversa, incuba los lysates durante tres minutos a 72 grados Celsius seguido de un minuto sobre hielo. Centrifugar brevemente las muestras durante 30 segundos a cuatro grados Celsius y añadir 5,7 microlitros de mezcla de transcripción inversa a cada muestra para llevar el volumen total a 10 microlitros para cada muestra. Después de un suave vórtice y centrifugación, cargue las muestras en un termociclador e inicie el programa de transcripción inversa.

Para la preamplificación de la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, agregue 15 microlitros de mezcla de PCR a cada muestra que contenga las primeras reacciones de hebra, seguido de vórtice suave y centrifugación. A continuación, cargue las muestras en el termociclador e inicie el programa PCR. Para la purificación de PCR, agregue 25 microlitros de perlas de purificación de ADN resuspendidas a cada muestra, y mezcle bien por vórtice.

A continuación, gire rápidamente las muestras a temperatura ambiente para recoger el líquido evitando la liquidación de las cuentas. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, coloque las muestras en un soporte magnético adecuado, retirando y descartando cuidadosamente el sobrenadante cuando la solución esté transparente. Lave las cuentas con dos lavados de 30 segundos en 200 microlitros de 80% de etanol recién preparado por lavado.

Y deseche el etanol restante después del segundo lavado. Cuando las perlas se hayan secado al aire, agregue 11 microlitros de agua sin nucleasas para eluir el objetivo del ADN de las cuentas, seguido de vórtices. A continuación, centrifugar rápidamente las muestras, devolver las muestras al soporte magnético hasta que la solución esté clara y transferir 10 microlitros de cada muestra a un nuevo tubo de PCR.

El ADNn arriba amplificado con éxito debe tener una longitud completa por encima de 500 pares base, y enriquecerse de 1,5 a dos pares de bases de kilos. Además, generalmente se observa un enriquecimiento de 500 a 600 pares base de ADNc en insulina un RFP más, que puede representar las transcripciones de insulina. Sin embargo, los fragmentos de ADNn a cerca de 100 pares base son dimers de imprimación, que generalmente son causados por imprimaciones excesivas y que deben ser eliminados repitiendo el paso de purificación del ADN.

Los fragmentos de ADNc entre 100 y 500 pares base suelen representar adNn a causa de un ADN. degradado, que es causado por problemas de estado celular o región deficientes, como la contaminación por RSE y debe excluirse. Después de la purificación de las bibliotecas de ADNc para la secuenciación, el ADNc que oscila entre 250 y 450 pares base se puede obtener mediante la adición de perlas de purificación de ADN a la primera y segunda rondas de purificación. Después de la purificación del cordón de ADN, la puntuación de calidad de secuenciación debe ser superior a 30 durante la evaluación de la calidad de la secuenciación.

Para obtener células de alta calidad para análisis posteriores, se excluyen las células con menos de 0,5 millones de lecturas mapeadas o con menos de 4.000 genes detectados, facilitando la caracterización de diferentes grupos de células y la identificación de genes que se expresan heterogéneamente en diferentes grupos después del análisis de componentes principales y la agrupación jerárquica. Al intentar este procedimiento, es importante recordar perfumar el páncreas rápidamente antes de la digestión de la colagenasa para evitar la digestión excesiva del islotes y mantener el ambiente libre de RNase durante los procedimientos de una sola célula. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la toma de imágenes de islotes y el cultivo para facilitar la visualización de la estructura del islote y examinar las respuestas celulares y la estimulación de fármacos.

Después del desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación pancreática exploraran los mecanismos de desarrollo y regeneración del linaje de islotes, así como la progresión de la diabetes en los mamíferos.