Extracción rápido, seguro y sencillo Manual cabecera de ácido nucleico para la detección del Virus en muestras de sangre entera

Este método puede ayudar a la hora de realizar diagnósticos en el punto de atención de pacientes con signos de infecciones virales. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar sin equipo de laboratorio ni electricidad, por lo que se puede realizar en una sala de hospital. Demostrando el procedimiento de recolección de sangre, estarán el médico Anders Fomsgaard y el científico Morten Rasmussen, ambos de mi laboratorio.

Comience preparando los tubos de recolección de sangre. Utilice una aguja de una pulgada de calibre 25 conectada a una jeringa de 3 ml para inyectar 1,6 ml de un tampón de lisis comercial en un tubo de vacío EDTA de 4 ml. Es fundamental mantener el vacío en el tubo de extracción de sangre para la extracción de sangre.

Por lo tanto, siempre use una aguja para inyectar el tampón de lisis en el tubo de recolección de sangre. A continuación, vuelva a suspender por completo un volumen de 960 microlitros de partículas de vidrio magnético, o MGP, y transfiéralo a un tubo de 1,8 ml etiquetado. A continuación, pipetee 4 ML de tampón de lavado uno en un tubo de 4,5 ML etiquetado como WB-1,1,5 ML de tampón de lavado dos en un tubo de 3,6 ML etiquetado como WB-2, y 3 ML de tampón de lavado tres en un tubo de 4,5 ML etiquetado como WB-3.

Finalmente, agregue 100 microlitros de tampón de elución a un tubo de 1,8 ML etiquetado como EB y deje los tubos a temperatura ambiente hasta su uso. Para recolectar sangre entera intravenosa del paciente, use una aguja de mariposa con un tubo de extensión de pequeño diámetro y uno de los tubos de vacío de recolección de sangre previamente preparados que contengan tampón de lisis. Apoye el brazo del paciente en posición hacia abajo.

Inserte la aguja de mariposa en la vena del paciente y conecte el tubo de vacío de recolección de sangre a la extensión de diámetro pequeño. Después de la recolección de sangre, mezcle el contenido del tubo, volteándolo de cinco a diez veces. Desinfecte el exterior del tubo con etanol al 70%.

A continuación, incubar los tubos durante 20 minutos a temperatura ambiente para la inactivación del virus. Para purificar los ácidos nucleicos de la sangre recolectada, mezcle nuevamente el contenido del tubo volteando el tubo de vacío con la mano de cinco a diez veces. Vierta la alícuota preparada de MGP directamente en el tubo de extracción de sangre.

Coloque una nueva tapa de un tubo de recolección de sangre sin usar en el tubo que contiene la muestra. Coloque un dedo en la tapa para asegurarse de que el tubo esté bien cerrado y mezcle el contenido del tubo volteándolo de cinco a diez veces. Coloque el tubo en el soporte magnético y mantenga un dedo en la tapa, para asegurarse de que el tubo esté bien cerrado.

A continuación, voltee el soporte magnético con el tubo unas cuantas veces para dispersar los MGP antes de que se acumulen en el lado del tubo con el imán. Retire la tapa del tubo y deseche el contenido del tubo en un tubo de recolección de 50 ML, utilizando una pipeta desechable. Vierta la alícuota preparada de WB-1 directamente en el tubo de extracción de sangre y cierre la tapa del tubo.

Mezcle el contenido a mano de cinco a diez veces. A continuación, recoge las perlas en el lateral del tubo, utilizando el imán y retira el líquido como antes. Vuelva a suspender las perlas en la alícuota preparada de WB-2, luego deseche la solución y repita el procedimiento con una alícuota preparada de WB-3.

Finalmente, retire el tubo del soporte magnético y vierta la alícuota preparada de EB directamente en el tubo de extracción de sangre. Coloque la tapa en el tubo y vuelva a suspender los MGP golpeando de cinco a diez veces con un dedo. Por último, utilice una pipeta desechable de 1,5 ml para transferir una gota de los MGP resuspendidos a la mezcla de reacción de amplificación de ácido nucleico posterior.

Asegúrese de volver a suspender completamente los MGP antes de transferir solo una gota a la reacción de PCR. Para demostrar la prueba de concepto, la sangre total negativa se enriqueció con diluciones 10 veces del estándar del virus del Ébola, preparado a partir del reciente brote en el sur de Guinea, o tres concentraciones diferentes del virus de Epstein Barr. Los ácidos nucleicos extraídos se analizaron mediante qPCR o qPCR R2 específicos del virus interno.

Cuanto más bajo sea el umbral de cruzamiento, o CT, mayor será el número de copias del genoma viral. Aquí, una lámpara específica para el virus del Ébola detectó sangre entera con diferentes concentraciones del virus del Ébola. La concentración final de virus en la muestra de sangre entera enriquecida se ve en el eje X, y los minutos hasta positivo se ven en el eje Y.

En este caso, la sangre entera se enriqueció con diluciones 10 veces superiores de una muestra de suero estandarizada por la OMS para la hepatitis C, y se detectó mediante RT qPCR específica para el VHC. Finalmente, esta imagen muestra los resultados de una reacción de lámpara específica del virus de Epstein Barr, en sangre total positiva para el virus de Epstein Barr. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar el tampón de unión a lisis especificado.

Este es un paso crucial y un reactivo crucial para el método. Este tampón de unión a lisis inactivará el virus en la muestra. Siguiendo esta técnica se pueden realizar diferentes métodos de detección molecular como la lámpara y la PCR, y por lo tanto se puede realizar un diagnóstico diferencial.