Name: Banco inmovilizado cromatografía de afinidad metálica, reconstitución y ensayo de un Polyhistidine etiquetada metaloenzima para el laboratorio pregrado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a purificar y reconstituir metaloenzimas de hierro no hemo etiquetadas con polihistidina mediante cromatografía de afinidad metálica inmovilizada. Este protocolo práctico permite a estudiantes de pregrado explorar la estructura y función enzimática en el laboratorio docente.

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Esta publicación está basada en trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo la subvención no.  CHE 1708237.

1. preparación para la purificación
<ol><li>Preparación del extracto crudo sin células<ol>
<li>Obtener un precipitado de células de g ~ 9-10 de e. coli (BL21) que sobreexpresa la etiqueta del polyhistidine metalloprotein25 en un tubo cónico de 50 mL.</li>
		<li>Añadir 5 mL por gramo de tampón de lisis/bind temperatura habitación (50 mM fosfato, 300 mM de NaCl, imidazol de 10 mM a pH 8) ~ 9-10 g de precipitado de células para un volumen total ~ 45-50 mL. Periódicamente vortex a disolución. Si el pellet se congela, descongela en un baño de agua tibia.</li>
		<li>Usando el baño de agua helada, enfriar la suspensión de células a ~ 3 ° C en la preparación de lisis celular. Nota: En este punto, es posible lisis celular por sonicación, molienda del grano o cualquier otro método. Molienda de grano se demuestra aquí porque es rápido, relativamente barato y no requiere protección para los oídos.</li>
		<li>Montar un cordón de 50 mL fresado según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Llenar la cámara de molino de grano la mitad llenos de frío 0,1 granos de cristal de mm que se han almacenado a-20 ° C.</li>
		<li>Llene el resto de la cámara con la suspensión de células refrigeradas y buffer de lisis/bind de 4 ° C para llenar completamente la cámara.</li>
		<li>Utilice una pequeña espátula para girar el eje del molino de grano y la suspensión de células se mezclan con los granos.</li>
		<li>Eliminar las posibles burbujas grandes con una pipeta y luego atornille la tapa.</li>
		<li>Seco de la cámara de cualquier fuga.</li>
		<li>Añadir aproximadamente 1 taza de hielo a la chaqueta claro, plástico, incorporar la cámara de llenado de 50 mL a la chaqueta llena de hielo y el tornillo cerrado.</li>
		<li>Sujete la cámara con cubierta de hielo en el motor.</li>
		<li>Apague el motor en el molino de bolas durante 15 segundos a 15.800 rpm, luego dejar para reposar durante 45 segundos. Repetir 8 veces.</li>
		<li>Cuando terminan los 8 ciclos, decantar la suspensión de lisis de la célula entera en un tubo más grande clasificado para la centrifugación de alta velocidad (25.000 x g o superior) o 50 mL. Coloque un par de tubos equilibrados en la centrifugadora y vuelta a 25.000 x g durante 40-45 minutos a 4° C para que sedimenten residuos y cristal cuentas de celular. Nota: Si no dispone de 50 mL o más grandes tubos de centrifugación de alta velocidad, quitar los granos de cristal por centrifugación a 1000-2000 x g durante 2-3 minutos en un tubo cónico de 50 mL para obtener un menor volumen de suspensión celular (~ 25 mL) que puede decantar en un volumen más pequeño tubo e clasificada para la centrifugación de alta velocidad.</li>
		<li>Al terminar la centrifugación, decantar los extractos en un tubo cónico de 50 mL limpio claro, amarillo, sin células, crudos. Tenga cuidado de no para transferir los residuos de la célula.</li>
		<li>Recoger una pequeña muestra de los extractos crudos libres de células para su posterior análisis de la purificación por SDS-PAGE26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la columna IMAC<ol>
<li>Obtener una columna de 1,5 x 20 cm equipada con un soporte inferior de la cama para retener las partículas de resina, una toma de la cerradura de Luer y una tapa superior que también contiene un tipo Luer lock. Encaja en el tomacorriente de la Luer-cerradura con una llave de paso para controlar el flujo.</li>
		<li>Trabajar en el Banco, Monte firmemente la columna en un soporte de anillo.</li>
		<li>Obtener una mezcla de 50% de níquel-limite nitriloacetic la resina del ácido (Ni-NTA) en etanol al 20% que ha sido almacenada a 4 ° C.</li>
		<li>Agitar suavemente la botella para resuspender uniformemente la resina.</li>
		<li>Trabajando a temperatura ambiente y en el escritorio, uso una pipeta graduada a retirar 2 mL de la mezcla, que producirá 1 mL de colocado resina capaz de atar 50-60 mg de polyhistidine etiquetado proteína y transferir la mezcla a la columna.</li>
		<li>Abra la llave de paso y deje que la solución de almacenamiento de exceso de drenaje por gravedad de la resina.</li>
		<li>Cierre la llave de paso bien</li>
		<li>Con cuidado utilizando una pipeta Pasteur, añadir tampón de lisis frío/bind (50 mM fosfato, 300 mM de NaCl, imidazol de 10 mM a pH 8) y a la columna de resina – por lo menos 30 mL. Tenga cuidado de no para perturbar la superficie de la resina. Ejecutar el buffer por las paredes de la columna para evitar salpicaduras.</li>
		<li>Equilibre la resina al permitir que el tampón de lisis/bind drene lentamente la columna por gravedad en un vaso de colección.</li>
		<li>Cuando el búfer de lisis/bind ha drenado sobre todo, cerrar la llave de paso para detener el flujo de buffer cuando ~ 5 mL de tampón de lisis se mantiene por encima de la resina y dejar la columna, montada verticalmente, hasta que esté listo para continuar, o hasta 1 semana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificación del Polyhistidine-etiqueta meta por IMAC
<ol><li>Preparar el tampón de lavado (50 mM fosfato, 300 mM de NaCl, pH de imidazol 20 mM 8) y tampón de elución (50 mM fosfato, 300 mM de NaCl, imidazol de 250 mM, glicerol al 10% pH 8). Enfriar a 4° C.</li>
	<li>Preparar la columna Ni-NTA para la adición de los extractos crudos libres de células abriendo la llave de paso y permitiendo el restante buffer de lisis/obligatorio para drenar por gravedad a través de la resina de Ni-NTA. Cuando se ha vaciado el buffer, y se expone la superficie de la resina, cierre la llave de paso.</li>
	<li>Utilizando una pipeta Pasteur, pipeta extrae el crudo libre de la célula en la resina, teniendo cuidado de no para perturbar la superficie. Ejecutar los extractos crudos abajo las paredes de la columna para evitar salpicaduras. El volumen de extractos crudos aplicado es dependiente en el nivel de expresión de la proteína del polyhistidine-etiqueta; asegurar el volumen total de extractos crudos contiene 50-60 mg o menos de la proteína diana por mL de resina Ni-NTA (ver paso 1.2.4).</li>
	<li>Cuando todos los extractos crudos se han transferido a la columna, abra la llave de paso para que la columna puede drenar por gravedad. Este flujo a través de está compuesto por proteínas que no se unen a la resina – recoger 100 μL para su posterior análisis de la purificación por SDS-PAGE. 26
</li>
	<li>La viscosidad de los extractos crudos libres de células puede reducir considerablemente el flujo de la gravedad de la columna. Para aumentar la velocidad de flujo, aplicar un simple "bomba de mano":<ol>
<li>Tome una jeringa de 10 mL Luer-lock y conecte a la tapa de la columna usando un tramo corto de tubería plástica y conexiones Luer-lock entre la tapa de la columna y la jeringa. Extraer el émbolo de la jeringa y luego ajuste bien la tapa de la columna en la parte superior de la columna.</li>
		<li>Comprimir suavemente el émbolo de la jeringa mientras evaluar manualmente el caudal por recoger el eluyente en una probeta graduada; las tasas de 1-2 mL por minuto son compatibles con la resina y esta configuración. Irá aumentando la compresión del émbolo de la jeringa como la tasa de flujo disminuye.</li>
		<li>Para evitar la introducción de aire en la resina, retirar la tapa de la columna une bomba de mano cuando el menisco del líquido aplicado alcanza 5-10 mm por encima de la capa de resina y permite el volumen restante drenar por gravedad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuando los extractos crudos libres de células han terminado el drenaje y la superficie de la resina se expone otra vez, utilice una pipeta Pasteur cuidadosamente agregar 30 mL de tampón de lavado frío a la columna, teniendo cuidado de no para perturbar la superficie de la resina. Ejecutar el buffer por las paredes de la columna para evitar salpicaduras.</li>
	<li>Abra la llave de paso y permitir que el tampón de lavado al desagüe a través de la columna. Este proceso es quitar las proteínas débilmente consolidadas de la resina. Deseche el eluyente.</li>
	<li>Mientras que el tampón de lavado está drenando, preparar dieciséis, etiquetado, tubos de microcentrífuga para recoger fracciones de 1 mL.</li>
	<li>Cuando se haya drenado todo el tampón de lavado, y la superficie de la resina se expone otra vez, cerrar la llave de paso. Utilice una pipeta Pasteur para añadir cuidadosamente 30 mL de tampón de elución refrigerados a la columna, teniendo cuidado de no para perturbar la superficie de la resina. Ejecutar el buffer por las paredes de la columna para evitar salpicaduras.</li>
	<li>Abrir la llave de paso lentamente y permitir que el tampón de elución eluir la proteína polyhistidine con la etiqueta de la columna. Recoger 1 mL de eluyente en cada uno de los tubos de microcentrífuga marcada, 1 a 16.</li>
	<li>Prueba de las fracciones de proteína mediante un ensayo colorimétrico de proteína como el ensayo de Bradford o espectroscopia UV-Visible de acuerdo con los métodos específicos de reactivo o instrumento fabricantes27,28. Como se muestra aquí, el ensayo colorimétrico con azul de Coomassie es reducido a un volumen μL 100 para sacrificar solamente un pequeño volumen de cada fracción.</li>
	<li>Mezcla 3 μL de cada fracción con 100 μl de una proteína colorimétrica reactivo de ensayo y manualmente, observar la formación de cualquier color para indicar la presencia de proteína en la fracción; no es necesaria la detección con un espectrómetro.</li>
	<li>Si la proteína se encuentra en la fracción 16, continúe liberador de fracciones de 1 mL y análisis para la proteína periódicamente, hasta que las fracciones eluídas ya no contienen una cantidad significativa de proteína.</li>
	<li>Fracciones que contienen proteínas se combinan en un tubo cónico limpia y retirar una muestra de 100 μL para su posterior análisis por SDS-PAGE26.</li>
	<li>Proceder a la reconstitución del cofactor iones metálicos o congelar la proteína en alícuotas de 3 mL a-80 ° C. Asegurar que glicerol al 10% se incluye en la elución buffer es un crioprotector para estabilizar la proteína pura durante la congelación.</li>
	<li>Elución de la columna de Ni-NTA es completa, es decir, la proteína es la columna y en fracciones, pasar otros 25 mL de tampón de elución a la columna y almacenar la columna a 4 ° C en ~ 5 mL de tampón de elución para almacenamiento a corto plazo , o tampón de lisis/bind con 20% de etanol para el almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>3. reconstitución de la proteína de la blanco con el Fe2 +
<ol><li>Adición de Fe2 + Nota: Un hierro no hemo (II) enlace enzima, como la l-dopa dioxigenasa en este ejemplo, requiere un ión de Fe2 + para la actividad; sin embargo, el hierro (II) se oxida fácilmente al hierro (III), que es inactivo, y una fracción de la proteína se purifica sin cualquier hierro a todos.<ol>
<li>Para empezar la reconstitución del metal, obtener 3 mL de la enzima purificada suspendida en tampón de elución. Si se congela, descongelar rápidamente a través de un baño de agua tibia y una vez descongelados, puesto la proteína en el hielo.</li>
		<li>Mediante el volumen de la proteína en el tubo, calcular la cantidad de ascorbato de sodio (198.1 g/mol) necesario para que la concentración final 12.5 mM en la muestra. También, calcular la cantidad de Ditiotreitol (DTT, 154.25 g/mol) necesario para que la concentración final 12.5 mM en la muestra.</li>
		<li>Añadir el ascorbato de sodio sólido y TDT y suavemente pero a fondo, mezclar para disolver totalmente. Tenga cuidado de no para causar precipitación de proteínas con una mezcla demasiado agresiva. Agregue una pequeña cantidad de hierro (II) sulfato heptahidrato (MW 278.01 g/mol) a la muestra de proteína.</li>
		<li>Para obtener una cantidad bastante pequeña del toque de sal, hierro 1 unos mm gránulos de FeSO4•7H2O sólido hacia fuera en un pedazo de pesan papel, doblan el papel sobre el gránulo y aplastar con la parte plana de una espátula de metal.</li>
		<li>Añadir un grano del polvo resultante en el tubo de la proteína.</li>
		<li>Vortex para mezclar y una rosa color rosa aparece en el tubo.</li>
		<li>Incubar la solución rosa de proteína, capsulada, de 10 a 30 minutos en hielo. El color rosa se desvanecerá lentamente con el tiempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtración de gel<ol>
<li>Utilice una columna de gel filtración con 10 mL de gel de poliacrilamida al esférico con un límite de exclusión del peso molecular de aproximadamente 6.000 y un rango de tamaño de partícula hidratada de 90 – 180 μm en una columna de 1,5 x 12 cm, que también está equipada con un depósito de 10 mL. Asegúrese de que la columna está equipada con inferior y superior de la cama apoya en forma de 30 discos de Umm poroso de polietileno para retener la resina en la columna y evitar que la capa de resina seco. Monte la columna de gel filtración en un soporte de anillo.</li>
		<li>Si utiliza una columna de filtración de gel envasado, retire la tapa y quite el exceso de tampón sobre el soporte superior de la cama.</li>
		<li>Para equilibrar la columna, comience por llenar el depósito con buffer compatible con posterior análisis y almacenamiento de información, por ejemplo, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, glicerol al 10% a pH 8.0.</li>
		<li>Si utiliza una columna de filtración de gel envasado, quite la punta inferior de la columna de gel filtración para iniciar el flujo de buffer y exponer el luer deslizante. Montar una llave de paso hasta el final de la resbalón de Luer de la columna, pero dejo abierto y permitir que la columna de goteo por gravedad.</li>
		<li>Cuando el buffer se haya drenado de la columna y se expone el apoyo superior de la cama, cerrar la llave de paso y agregar el ~ 3 mL de la metaloenzima de Fe (II) reconstituido a la columna pipetear la solución en el soporte de la cama superior expuesta.</li>
		<li>Abrir la llave de paso y deje que la muestra entera 3,0 mL entrar en la columna por gravedad. Deseche estos primeros 3 mL del eluyente. Cualquier color rosa que se forma durante la manipulación de la solución será atrapado en la parte superior de la columna.</li>
		<li>Cuando la columna ha dejado de gotear y se expone el apoyo superior de la cama, agregar 4 mL de la solución de la filtración de gel (por ejemplo, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, glicerol al 10% a pH 8.0) a la columna. Abra la llave de paso y recoger el eluyente en tubos de microcentrífuga en ocho fracciones de 0,5 mL.</li>
		<li>Prueba de las fracciones de proteína mediante un ensayo colorimétrico de proteína o de27,UV-Vis28 como se describió anteriormente.</li>
		<li>Combinar fracciones de proteína que contienen.</li>
		<li>Retirar una muestra para análisis de SDS-PAGE26.</li>
		<li>Proceder con el ensayo o el almacenamiento de la muestra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen ninguna revelación.

Mientras que la adición de etiquetas polyhistidine para proteínas recombinantes y su purificación por IMAC se ha convertido en prácticamente ubicua en la literatura bioquímica3,4,5, aplicaciones de IMAC a la purificación de la enzima en la bioquímica laboratorio de enseñanza siguen siendo escasos, y los métodos publicados no siempre consideran las limitaciones de recursos de la enseñanza de laboratorio20. Además, el uso del IMAC en el laboratorio de enseñanza es más eficaz cuando está junto a los experimentos que evalúan la actividad y pureza, haciendo la purificación de una enzima, una actividad educacional ideal del IMAC. Con el fin de ampliar la aplicación de IMAC para la purificación de enzimas, incluyendo metaloenzimas, en el laboratorio de enseñanza, se necesitan métodos confiables y de bajo costo. En este protocolo, demostramos sobremesa IMAC con suministros de laboratorio fácilmente disponibles y baratos, al tiempo que también las limitaciones en la aplicación de IMAC a de metaloproteinas22, reconstituyendo el hierro (II) dependiente metaloenzima, l-dopa dioxigenasa, post purificación. Usando los reactivos y materiales descritos, estimamos que el costo de consumibles para ocho grupos de estudiantes es de entre $500-$ 600 por semestre para ejecutar este protocolo, incluyendo los pasos de análisis descritos en la figura 1 y figura 2.
Debido a la facilidad con que Fe2 + puede disociar de aminoácido ligandos24 y la fácil oxidación del Fe2 + O2 a Fe3 +, reconstitución del no-heme, amino ácido-quelatado (II) en una metaloenzima recombinante es un componente típico de la purificación de la enzima. Cuando se utiliza la cromatografía clásica, es posible evitar la pérdida total de hierro en algunos casos32, pero más a menudo, el hierro (II) se agrega nuevamente en presencia de agentes reductores33,34,35, 36 a menudo bajo un atomosphere anaerobio37,38,39y en algunos casos el exceso de hierro no es quitado33,34,36, que complica la cualquier análisis posterior. Pasos consecutivos de cromatografía clásica y un ambiente anaerobio no son realistas para el laboratorio de pregrado, lo que provocó el desarrollo de este protocolo.
Mientras que la preparación manual de la columna de Ni-NTA y el procesamiento de muestras en gran parte por la gravedad llevará más tiempo y esfuerzo cuando comparado con las columnas y automatizado de instrumentación de la cromatografía, los pasos manual permiten prácticas el estudiante que resultan en mayor comprensión de la ciencia detrás del proceso de aprendizaje. La adición de una sal de hierro (II) bajo las condiciones indicadas aquí es particularmente sensible al exceso Ditiotreitol. Si un estudiante por error añade un exceso de Ditiotreitol, un evento de precipitación es probable. Nos hemos encontrado útiles a los estudiantes realizar cálculos de cantidades de reactivo antes de llegar en el laboratorio, por lo que el tiempo de laboratorio se puede utilizar más eficazmente en el Banco. La purificación de la IMAC de sobremesa todo - de lisis celular para la elución de la proteína - se puede lograr en un período de 4 horas laboratorio, seguida de reconstitución y análisis en un período de laboratorio posterior.

Los primeros informes de la purificación de una proteína con la etiqueta del polyhistidine de extractos de un organismo anfitrión mediante quelación de la etiqueta histidina por un metal inmovilizado entraron en la literatura en 19881,2. Desde entonces, la adición de etiquetas polyhistidine para proteínas recombinantes y su purificación por cromatografía de afinidad metálica inmovilizados (IMAC) se han vuelto prácticamente ubicua en la literatura bioquímica3,4, 5. Métodos de purificación de IMAC pueden ser implementados en el escritorio, usando la cromatografía automatizada y en formatos de spin-columna. Mientras que los métodos de purificación de afinidad, sobre todo IMAC, son ampliamente utilizados en el laboratorio de investigación, son menos comunes en el laboratorio de enseñanza de pregrado. Los libros de texto de laboratorio más utilizado para el laboratorio de bioquímica rutinaria no enseñan estos métodos, en lugar de otro optar por la más tradicional intercambio iónico o cromatografía de unión a la tinte6,7,8 , 9. por ejemplo, la purificación de la lactato deshidrogenasa por Anderson10 utiliza afinidad de unión a la tinte, y la purificación de la leche bovina de7,α-lactoalbúmina11 por Boyer utiliza un níquel-nitriloacetic matriz de ácido, pero ninguna etiqueta de poly-histidina recombinante, confiando en cambio en afinidad intrínseca de la proteína de la resina. Algunos libros de texto modernos laboratorios universitarios y publicaciones aplicar cromatografía de afinidad metálica inmovilizados sobre objetivos de proteína poli-histidina etiquetado como verde o rojo fluorescente proteínas12,13, 14,15,16de anticuerpos y enzimas seleccionadas17,18,19,20, incluso algunos de función desconocida21. Sin duda, la purificación de una enzima es preferible en el laboratorio de enseñanza, porque el blanco puede ensayarse para la actividad en sesiones posteriores, enriqueciendo la experiencia de la "ciencia real" por parte del estudiante; de hecho, estos tipos de experiencias de laboratorio han sido publicados y los resultados beneficiosos en el aprendizaje de los estudiantes reportó17,18,20,21. Y sin embargo, aplicaciones del IMAC a la purificación de la enzima en el laboratorio siguen siendo escasos, y los métodos publicados pueden presumir incluso acceso a instrumentación de cromatografía que no está típicamente disponible para la enseñanza de Bioquímica en el laboratorio del aula 20. también existen limitaciones en la aplicación de IMAC a metaloproteínas, especialmente aquellos que se unen metales divalentes redox-sensibles que son esenciales para la actividad22. Con frecuencia, el ion del metal está perdido u oxidado durante la purificación que rinde una enzima inactiva inadecuados en el laboratorio de pregrado.
Un tercio completo de las enzimas unen un ion de metal23, y a pesar de un requisito casi universal para hierro en todas las formas de vida23, el hierro es sin duda entre los iones metálicos más problemáticos en la enzimología. No-heme Fe2 + atar enzimas son particularmente propensas a la pérdida y oxidación del metal durante el IMAC; probablemente debido a la falta de un ligando orgánico dedicado como heme y la facilidad con que Fe2 + puede disociar del aminoácido ligandos24. Además, la oxidación dependiente de oxígeno de Fe2 + a Fe3 + es espontánea en solución acuosa, debido al cambio de energía libre negativa y la relativa estabilidad de Fe3 +. A menudo, estos retos se superan por medio de anaerobio ambiente o IMAC no métodos cromatográficos22. En este artículo, demostraremos el uso de sobremesa IMAC para purificar la Fe2 + metaloenzima dependiente de l-dopa dioxygenase usando fuentes de cromatografía simple, bajo costo, seguidos por la reconstitución del sitio activo del Fe2 +, y análisis enzimático. Estos métodos son estándar en nuestro propio laboratorio de pregrado bioquímica de los grupos de estudiantes 6-12 y se pueden utilizar para ampliar el repertorio de investigaciones de la enzima en el pregrado.

<table><tbody><tr><td>consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater Perlas de vidrio de 0,1 mm</td><td>Productos BioSpec</td><td>11079101</td><td>1 libra cada uno</td></tr><tr><td>50 ml Tubos cónicos con tapones de rosca, estériles</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Bioreactivos</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, monobásico</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato de sodio</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC35268-1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Lab Scientific</td><td>D-115</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de hierro (II) heptahidratado</td><td>Sigmaaldrich</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>HisPur NiNTA Resina&nbsp;</td><td>Fisher (pierce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de cromatografía Econo-Column - 1,5 x 20 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&nbsp;</td><td>1,5 x 20 cm, 35 ml, 2 unidades, etc.</td></tr><tr><td>Válvula de llave de paso, unidireccional, luer hembra a macho</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>paquete de 50</td></tr><tr><td>jeringas BD 10mL luer-loc (no estéril, sin aguja)</td><td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Racor para tubos: Lengüeta de 1,6 mm a Luer Biorad</td><td></td> hembra <td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>Racor para tubos: 1,6 mm Barb a Luer macho&nbsp;</td><td></td> Tubo de silicona <td>Biorad</td> 7318225 <td></td></tr><tr><td>(1,6 mm de diámetro interior/0,8 mm de pared, para 0,2-5 ml/min en bomba peristáltica)</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>Paquete de 1, 1,6 mm de diámetro interior/0,8 mm de pared, 10 m, tubo de baja presión para la manipulación de líquidos</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus (Bradford) Ensayo de proteínas</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, tapón a presión, 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas desechables de poliestireno Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pipeta universal Fiserbrand</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-955-110</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Transfer Pipets</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de desalinización Econo-Pac 10DG</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>caja de 30</td></tr><tr><td>tampones de muestra ExpressPlus PAGE 5x</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5mL (Diluir 1:5 con muestra)</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 pocillos</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 geles</td></tr><tr><td>Cubetas Desechables Fisherbrand, Metyacrylate</td><td>Fisher</td><td>14-955-128&nbsp;</td><td>Caja de 500</td></tr><tr><td>Tapas de cubeta cuadradas desechables</td><td>Fisher</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA (3,4-dihidroxifenilalanina)</td><td>Acros</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>Equipo permanente:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara BeadBeater 50mL&nbsp;</td><td>BioSpec Products</td><td>110803-50SS</td><td>1 cámara</td></tr><tr><td>BeadBeater</td><td>BioSpec Products</td><td>1107900-101 Cámara de</td><td>policarbonato de 350 ml, conjunto de rotor, base de motor, camisa de enfriamiento de agua helada y una libra de perlas de vidrio.</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, PPCO de alta velocidad, 50 ml</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>Célula de electroforesis vertical Mini-PROTEAN Tetra para mini geles prefabricados, 4 geles</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>&nbsp; Sistema de electroforesis vertical de 4 geles, incluye conjunto de electrodos, módulo de funcionamiento complementario, tanque, tapa con cables de alimentación, mini presa de almacenamiento intermedio de celdas</td></tr><tr><td>PowerPac HC Fuente de alimentación</td><td>Bio-Rad 1645052</td><td></td><td>100&ndash; 120/220&ndash; 240 V, fuente de alimentación para aplicaciones de alta corriente, incluye cable</td></tr><tr><td>de alimentación UV-1800 con software UV-Probe Shimadzu</td><td></td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Global Kinetic Explorer Kintek</td><td>Corp</td><td>versión 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

banco inmovilizado cromatografía de afinidad metálica, reconstitución y ensayo de un polyhistidine etiquetada metaloenzima para el laboratorio pregrado

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Cromatografía de afinidad metálica de sobremesa inmovilizado (IMAC), de proteínas con la etiqueta del polyhistidine es fácilmente dominado por estudiantes de pregrado y se ha convertido en el método de purificación de proteínas más ampliamente utilizado en la literatura moderna. Sin embargo, la aplicación de la cromatografía de afinidad a proteínas de Unión metálicos, especialmente los metales sensibles redox tales como el hierro, a menudo se limita a laboratorios con acceso a una caja de guante - equipo que no está disponible rutinariamente en el pregrado laboratorio. En este artículo demostramos nuestros métodos de trabajo de aislamiento, purificación y metal iones reconstitución de una histidina polivinílico con la etiqueta IMAC, redox-activo, no heme hierro obligatoria extradiol dioxygenase y el ensayo de la dioxigenasa con variado sustrato concentración y saturación de oxígeno. Estos métodos son ejecutados por estudiantes de pregrado e implementados en el laboratorio de docencia e investigación universitario con instrumentación que es accesible y asequible en principalmente instituciones de pregrado.

Estos resultados representativos fueron recolectados por estudiantes de pregrado como ejecuta este protocolo durante dos períodos de laboratorio curso de BCM 341: Bioquímica Experimental Universidad de Muhlenberg. Figura 1 muestra los resultados de la purificación de un poli-histidina de 20 kDa tagged metaloenzima, l-dopa dioxigenasa, realizado por dos estudiantes durante un período de 4 horas aula laboratorio y analizan por SDS-PAGE por el mismo estudiantes durante un período de laboratorio posterior. La proteína poli-histidina tagged es efectivamente purificada (figura 1, carril 2). Un immunoblot del gel usando anticuerpos contra la etiqueta de poly-histidina indica que se pierde una pequeña cantidad de la proteína diana de poly-histidina etiquetado en el paso (datos no mostrados), probablemente porque la mayor cantidad de 100 mg de proteína diana en la lisado excedió la capacidad de unión de la resina.
Figura 2 muestra los datos de actividad recogidos por el estudiante en la reacción enzimática de la blanco de etiquetado metaloenzima poly-histidina, dioxygenase del l-dopa, después de la reconstitución con hierro (II) y posterior filtración de gel como se describe en el protocolo en este documento. Los cinco segundos comienza el tiempo muerto antes de que los datos recogidos es típica de los estudiantes ejecutando esta técnica por primera vez. La actividad fuerte de la metaloenzima fue detectada usando un análisis publicado y rindió el estado estacionario parámetros cinéticos consistentes con resultados publicados29. Se determinaron parámetros cinéticos estacionaria ajustando las curvas de progreso30 que se muestra en la figura 2; sin embargo, el ajuste de mínimos cuadrados no lineales de tasas iniciales recogidos en una serie de concentraciones de sustrato es igualmente posible31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Figura 1. Análisis de SDS-PAGE26 de poly-histidina etiquetan proteína antes, durante y después de la purificación. Carriles 1 - marcadores de peso Molecular, proteína purificada 2 (20 kDa) post Ni-NTA, 3-Ni-NTA atraviesa, 4 lisis pelotilla del post - celular gratis extractos crudos antes de la purificación, 5 - restos celulares. Muestras fueron preparadas con 5 x buffer de carga de muestra y separadas en geles de poliacrilamida de prefabricado 4-20% mediante un sistema de electroforesis de gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Figura 2. Análisis de estado estacionario de hierro (II) reconstituyen metaloenzima (es decir, l-dopa dioxigenasa, 10) con sustrato (l-dopa-5 μm (rojo), 25 μm (verde), 50 μm (azul)) en tampón (fosfato de 50 mM, 200 mM NaCl, pH 8). Rastros representan la formación de producto a 414nm. Datos de absorbancia fueron adquiridos continuamente utilizando cubetas de metacrilato de 1 mL en un espectrómetro UV-Visible análisis de split-beam29. Datos se adapten a un modelo de Michaelis-Menten de la aproximación de estado estacionario (KM 30.8 μm ± 14,4, kgatoaparente 2.3 s-1 ± 0.05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí presentamos un protocolo para la sobremesa inmovilizado metal afinidad cromatografía purificación y posterior reconstitución de un polyhistidine etiquetada, es hierro no hemo enlace dioxygenase conveniente para el laboratorio de enseñanza de pregrado.

Banco inmovilizado cromatografía de afinidad metálica, reconstitución y ensayo de un Polyhistidine etiquetada metaloenzima para el laboratorio pregrado

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Este método permite a los estudiantes universitarios purificar rápidamente metaloenzimas que se unen al hierro y luego utilizar esa proteína para responder preguntas clave sobre su estructura y función, todo dentro del entorno del laboratorio de enseñanza. La principal ventaja de esta técnica es que es aplicable a enzimas que se unen al hierro no hémico. Es accesible para estudiantes universitarios y se puede implementar fácilmente en el laboratorio de enseñanza.Para comenzar este procedimiento, obtenga una columna de 1,5 por 20 centímetros equipada con una salida luer lock, una tapa superior que también contiene un adaptador luer lock y un soporte inferior para retener las partículas de resina. Coloque una pinza en el adaptador luer lock inferior para controlar el flujo. A continuación, obtenga un frasco que contenga una suspensión al 50 % de resina de ácido nitrilotriacético unida a níquel en etanol al 20 %, que se almacenó previamente a cuatro grados Celsius.Agite suavemente el frasco para re-suspender uniformemente la resina. Trabajando a temperatura ambiente, utilice una pipeta graduada para retirar dos milímetros de la suspensión y transfiéralos a la columna. Después de que la solución de almacenamiento en exceso drene de la resina, use una pipeta de Pasteur para agregar cuidadosamente al menos 30 mililitros de tampón frío de lisis y unión, asegurándose de no perturbar la superficie de la resina.Corra el tampón por las paredes de la columna para evitar salpicaduras. Equilibre la resina permitiendo que el tampón drene lentamente de la columna por gravedad hacia un vaso de recolección. Para comenzar, prepare la columna de níquel-NTA para la adición de los extractos crudos libres de células abriendo la llave de paso y permitiendo que el tampón de lisis y unión restante drene por gravedad a través de la resina de níquel-NTA.Cuando el tampón haya drenado completamente y la superficie de la resina esté expuesta, cierre la llave de paso. A continuación, utilice una pipeta Pasteur para pipetear cuidadosamente los extractos crudos libres de células sobre la resina, teniendo cuidado de no perturbar la superficie. Pase los extractos crudos por la pared de la columna para evitar salpicaduras.Después de transferir todos los extractos crudos a la columna, abra la llave de paso para que la columna drene por gravedad. Recoja 100 microlitros del flujo directo para su análisis posterior. Utilice un tramo corto de tubo de plástico para conectar una jeringa de 10 mililitros con cierre luer a la tapa de la columna.Extraiga el émbolo de la jeringa y luego coloque firmemente el tapón de la columna en la parte superior de la columna. Comprima suavemente el émbolo mientras recoge el eluyente en un cilindro graduado para evaluar manualmente la velocidad de flujo. Velocidades entre uno y dos mililitros por minuto son compatibles con la resina y el montaje experimental.Aumente suavemente la compresión del émbolo de la jeringa a medida que disminuye la velocidad de flujo. Cuando el menisco del líquido aplicado alcance entre cinco y 10 mililitros por encima del lecho de resina, retire la tapa de la columna y la bomba manual conectada para evitar la introducción de aire en la resina. Deje que el volumen restante drene por gravedad.Después de que los extractos crudos hayan terminado de drenar y la superficie de la resina quede expuesta nuevamente, utilice una pipeta Pasteur para agregar cuidadosamente aproximadamente 30 mililitros de tampón de lavado frío a la columna, teniendo cuidado de no perturbar la superficie de la resina. Abra la llave de paso y deje que el tampón de lavado drene a través de la columna. Mientras la columna está drenando, etiquete 16 tubos de microcentrifugado para la recolección de fracciones.Cuando el tampón haya drenado completamente y la superficie de la resina quede expuesta nuevamente, cierre la llave de paso. Utilizando una pipeta de Pasteur, agregue cuidadosamente aproximadamente 30 mililitros de tampón de elución frío a la columna, teniendo cuidado de no perturbar la superficie de la resina. Luego, abra lentamente la llave de paso para permitir que el tampón de elución retire la proteína marcada con polihistidina de la columna.Recolecte un mililitro de eluyente en cada uno de los tubos microcentrífugos marcados. Después de comprobar la presencia de proteína, combine las fracciones que contienen proteína en un tubo cónico limpio. Proceda con la reconstitución del cofactor de ion metálico, o congele la proteína en alícuotas de tres mililitros a menos 80 grados Celsius.Para comenzar la reconstrucción del metal, coloque una alícuota de tres mililitros de la enzima purificada, suspendida en tampón de elución, sobre hielo. Utilizando el volumen de proteína en el tubo, calcule la cantidad de ascorbato de sodio y dithiotreitol necesaria para que la concentración final de cada uno sea de 12,5 milimolar en la muestra. Añada el ascorbato de sodio y el dithiotreitol en forma sólida, y mezcle suave pero completamente hasta disolverlo por completo.Toque unos pocos gránulos de un mililitro de sulfato de hierro heptahidratado sólido sobre una hoja de papel para pesar. Doble el papel sobre el gránulo y tritúrelo con el lado plano de una espátula metálica. Añada un grano del polvo resultante al tubo que contiene la solución de proteína.Vortexee para mezclar, lo que dará como resultado un color rosado. Tape el tubo e incube la solución rosada en hielo durante entre 10 y 30 minutos. El color rosado se desvanecerá con el tiempo.Para la filtración en gel, utilice una columna de filtración en gel empaquetada con 10 mililitros de gel esférico de poliacrilamida en una columna de 1,5 por 12 centímetros, que también está equipada con un depósito de 10 mililitros. A continuación, equilibre la columna según se describe en el protocolo del texto. Cuando el tampón haya drenado de la columna y quede expuesto el soporte superior del lecho, cierre la llave de paso.Pipetee la solución de tres mililitros de hierro dos de la metaloenzima reconstituida sobre el soporte superior expuesto. Abra la llave de paso y deje que toda la muestra de tres mililitros entre en la columna por gravedad. Deseche los primeros tres mililitros del eluyente.Cualquier color rosa que se forme durante el manejo de la solución quedará atrapado en la parte superior de la columna. Cuando la columna haya dejado de gotear y quede expuesto el soporte superior del lecho, agregue cuatro mililitros del tampón de filtración en gel y recoja cuatro mililitros de eluyente en fracciones de 8,5 mililitros. Después de combinar las fracciones que contienen proteína, continúe con el ensayo o el almacenamiento de la muestra según se describe en el protocolo del texto.En este estudio, los estudiantes purificaron y posteriormente reconstituyeron una dioxygenasa no hemo que une hierro y que posee una etiqueta polihistidina. El análisis mediante SDS-PAGE muestra que la proteína etiquetada se purifica eficazmente. Aquí se presentan los datos de actividad obtenidos por los estudiantes sobre la acción enzimática de la dioxygenasa de L-dopa purificada tras la reconstitución con hierro dos y la posterior filtración en gel.El retraso de cinco segundos antes de que comience la recopilación de datos es típico en estudiantes que ejecutan esta técnica por primera vez. El ensayo en estado estacionario indica que los parámetros cinéticos, determinados mediante el ajuste de las curvas de progreso, son coherentes con los resultados publicados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que más hierro no es mejor, ya que demasiado hierro provocará la precipitación de la proteína.Concentraciones de hierro en exceso molar de tres a cinco veces la del proteína son suficientes. Siguiendo este procedimiento, los estudiantes pueden realizar experimentos adicionales para medir la estructura en solución, observar la química dependiente de enzimas o sustratos, todo con el fin de responder preguntas adicionales sobre el mecanismo de reacción.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este video, demostramos la técnica de cromatografía de afinidad de níquel para purificar enzimas pirofosfoquinasas marcadas con histidina de la bacteria Clostridium difficile.

Purificación de proteínas basada en cromatografía de afinidad de níquel: una técnica para purificar proteínas recombinantes marcadas con polihistidina a partir de lisado de células bacterianas

Este video muestra un procedimiento para la producción de anticuerpos recombinantes contra la metaloproptisasa. Los plásmidos recombinantes portadores de genes para el anticuerpo, la proteína fluorescente verde y la resistencia a los antibióticos se transfectan a las células epiteliales con lipofectamina. Las células transfectadas se seleccionan y cultivan para generar anticuerpos recombinantes.

Un método para producir anticuerpos recombinantes contra la metalopéptidasa

Los reactivos de detección robustos son cada vez más necesarios para desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico de la malaria. Se diseñó una sonda de iridio (III) que emite una señal luminiscente de larga duración en presencia de un biomarcador de proteína de la malaria rico en histidina. La detección de la proteína, ya sea en solución o inmovilizada en una partícula magnética, ofrece flexibilidad en la aplicación.

Iridium (III) luminiscentes Sonda para la detección de la proteína malaria biomarcador histidina Rich Protein-II

La cromatografía de exclusión por tamaño con guiones con plasma acoplado inductivamente - espectrometría de masas (ICP-MS) es una poderosa herramienta para medir cambios en la abundancia de metaloproteínas directamente a partir de muestras biológicas. Aquí describimos un conjunto de patrones de metaloproteínas utilizados para estimar la masa molecular y la cantidad de metal asociado con proteínas desconocidas.

Estándares para el Análisis Cuantitativo de Metalloproteomic Uso de exclusión por tamaños ICP-MS

Se presenta un procedimiento para el refolding el dCACHE periplasmic dominio obligatorio del ligand del jejuni del Campylobacter quimioreceptor Tlp3 de cuerpos de inclusión y de la purificación para producir cantidades de miligramos de proteína.

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

Aquí, describimos un método para purificar enzimas pyrophosphokinase etiqueta histidina y utilizando cromatografía en capa fina de sustratos marcados radiactivamente y productos para análisis de la actividad enzimática in vitro. El ensayo de actividad de la enzima es ampliamente aplicable a la quinasa, ciclasa de nucleótidos o reacción de transferencia de fósforo cuyo mecanismo incluye la hidrólisis de nucleótidos trifosfato.

Una purificación y análisis de actividad In Vitro de una (p) ppGpp sintetasa de Clostridium difficile

Las técnicas de modelado molecular y espectrometría de masas de movilidad ión pueden caracterizar el rendimiento selectivo de quelantes metálicos de los péptidos de unión a metales diseñados y el péptido de unión de cobre methanobactin. El desarrollo de nuevas clases de péptidos quelantes metálicos ayudará a llevar a terapias para enfermedades asociadas con el desequilibrio de iones metálicos.

Técnicas de Espectrometría de Masa de Movilidad de Iones para Determinar la Estructura y Mecanismos de Reconocimiento de Iones Metálicos y Actividad Redox de Oligopéptidos de Unión De Metal

Presentamos un ensayo para una fácil cuantificación de metales introducidos en muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas. El método utiliza el azul hidroxinaphthol como indicador de metal colorimétrico y un espectrofotómetro UV-Vis como detector.

Cuantificación de la lixiviación de metal en la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada

En este trabajo se describen protocolos para la caracterización biofísica de la formación de complejos ternarios inducidos por quimeras dirigidas a proteólisis (PROTACS) que involucran a las ubiquitinas ligasa Von Hippel-Lindau E3 ligasa (VHL) y Cereblon (CRBN).  Los métodos biofísicos que se ilustran en este documento incluyen la resonancia de plasmones de superficie (SPR), la interferometría de biocapas (BLI) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC).

Desarrollo y Aplicación de Ensayos Biofísicos para la Evaluación de la Formación de Complejos Ternarios Inducida por Quimeras Dirigidas a la Proteólisis (PROTACS)

Este artículo proporciona un procedimiento para la purificación por afinidad de una proteína recombinante humana, la endonucleasa flap 1 (FEN1), que ha sido marcada con una etiqueta de histidina 6X. El protocolo implica la utilización de dos columnas de iones metálicos inmovilizadas distintas para la purificación de la proteína marcada.

Purificación por afinidad de una proteína marcada con 6X His utilizando un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas 

Aprende a purificar y reconstituir metaloenzimas de hierro no hemo etiquetadas con polihistidina mediante cromatografía de afinidad metálica inmovilizada. Este protocolo práctico permite a estudiantes de pregrado explorar la estructura y función enzimática en el laboratorio docente.

Banco inmovilizado cromatografía de afinidad metálica, reconstitución y ensayo de un Polyhistidine etiquetada metaloenzima para el laboratorio pregrado (Video) | JoVE Journal

Banco inmovilizado cromatografía de afinidad metálica, reconstitución y ensayo de un Polyhistidine etiquetada metaloenzima para el laboratorio pregrado

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