Banco inmovilizado cromatografía de afinidad metálica, reconstitución y ensayo de un Polyhistidine etiquetada metaloenzima para el laboratorio pregrado

Este método permite a los estudiantes de pregrado purificar rápidamente las metaloenzimas que se unen al hierro y luego usar esa proteína para responder preguntas clave sobre la estructura y la función, todo dentro de los límites del laboratorio de enseñanza. La principal ventaja de esta técnica es que es aplicable a enzimas de unión al hierro no hemo. Es accesible para estudiantes de pregrado y se implementa fácilmente en el laboratorio de enseñanza.

Para comenzar este procedimiento, obtenga una columna de 1,5 por 20 centímetros equipada con una salida de luer lock, una tapa superior que también contenga un accesorio luer lock y un soporte de cama inferior para retener las partículas de resina. Coloque el accesorio de bloqueo luer inferior con una llave de paso para controlar el flujo. A continuación, obtenga una botella que contenga una suspensión del 50% de resina de ácido nitriloacético unida al níquel en un 20% de etanol que se almacenó previamente a cuatro grados centígrados.

Agita suavemente la botella para volver a suspender la resina de manera uniforme. Trabajando a temperatura ambiente, utilice una pipeta graduada para extraer dos milímetros de la lechada y transferirla a la columna. Después de que el exceso de solución de almacenamiento se drene de la resina, use una pipeta Pasteur para agregar con cuidado al menos 30 mililitros de tampón de unión de lisis enfriado, asegurándose de no alterar la superficie de la resina.

Pase el tampón por las paredes de la columna para evitar salpicaduras. Equilibre la resina permitiendo que el tampón se drene lentamente de la columna por gravedad hacia un vaso de precipitados de recolección. Para comenzar, prepare la columna de níquel-NTA para la adición de los extractos crudos libres de células abriendo la llave de paso y permitiendo que el tampón de unión de lisis restante drene por gravedad a través de la resina de níquel-NTA.

Cuando el tampón se haya drenado por completo y la superficie de resina esté expuesta, cierre la llave de paso. A continuación, utilice una pipeta Pasteur para pipetear cuidadosamente los extractos crudos libres de células sobre la resina, teniendo cuidado de no alterar la superficie. Pasa las extracciones crudas por la pared de la columna para evitar salpicaduras.

Después de que todos los extractos crudos se hayan transferido a la columna, abra la llave de paso para que la columna pueda drenar por gravedad. Recoja 100 microlitros del flujo para su posterior análisis. Use un trozo corto de tubo de plástico para conectar una jeringa Luer Lock de 10 mililitros a la tapa de la columna.

Saque el émbolo de la jeringa y luego llene firmemente la tapa de la columna en la parte superior de la columna. Comprima suavemente el émbolo mientras recoge el eluyente en un cilindro graduado para evaluar manualmente el caudal. Tasas entre uno y dos mililitros por minuto son compatibles con la resina y la configuración experimental.

Aumente suavemente la compresión del émbolo de la jeringa a medida que el caudal disminuye. Cuando el menisco del líquido aplicado alcance de cinco a 10 mililitros por encima del lecho de resina, retire la tapa de la columna y la bomba manual adjunta para evitar la introducción de aire en la resina. Deje que el volumen restante se drene por gravedad.

Una vez que los extractos crudos hayan terminado de drenar y la superficie de resina vuelva a quedar expuesta, utilice una pipeta Pasteur para añadir con cuidado unos 30 mililitros de tampón de lavado frío a la columna, teniendo cuidado de no alterar la superficie de la resina. Abra la llave de paso y deje que el tampón de lavado drene a través de la columna. Mientras se drena la columna, etiquete 16 tubos de microcentrífuga para la recolección de fracciones.

Cuando el tampón se haya drenado por completo y la superficie de resina vuelva a quedar expuesta, cierre la llave de paso. Con una pipeta Pasteur, agregue con cuidado unos 30 mililitros de tampón de elución enfriado a la columna, teniendo cuidado de no alterar la superficie de la resina. A continuación, abra la llave de paso lentamente para permitir que el tampón de elución eluya la proteína marcada con polihistidina de la columna.

Recoja un mililitro de eluyente en cada uno de los tubos de microcentrífuga marcados. Después de analizar la proteína, combine las fracciones que contienen proteínas en un tubo cónico limpio. Proceda con una reconstitución del cofactor de iones metálicos, o congele la proteína en alícuotas de tres mililitros a menos 80 grados Celsius.

Para comenzar la reconstitución del metal, ponga una alícuota de tres mililitros de la enzima purificada, suspendida en tampón de elución, sobre hielo. Usando el volumen de proteína en el tubo, calcule la cantidad de ascorbato de sodio y ditiotreitol necesaria de tal manera que la concentración final de cada uno sea de 12,5 milimolares en la muestra. Agregue el ascorbato de sodio sólido y el ditiotreitol, y mezcle suave pero bien para disolver por completo.

Golpea unos gránulos de un mililitro de sulfato de hierro sólido heptahidratado sobre un pedazo de papel de pesas. Dobla el papel sobre el gránulo y aplástalo con el lado plano de una espátula de metal. Agregue un grano del polvo resultante al tubo que contiene la solución de proteína.

Vórtice para mezclar, dando como resultado un color rosado-rosado. Tapa el tubo e incuba la solución rosa en hielo durante entre 10 y 30 minutos. El color rosa se desvanecerá con el tiempo.

Para la filtración en gel, utilice una columna de filtración en gel con 10 mililitros de gel esférico de poliacrilamida en una columna de 1,5 por 12 centímetros, que también está equipada con un depósito de 10 mililitros. A continuación, equilibre la columna como se indica en el protocolo de texto. Cuando el tope se haya drenado de la columna y el soporte del lecho superior esté expuesto, cierre la llave de paso.

Pipetee la solución de tres mililitros de metaloenzima reconstituida de hierro y dos sobre el soporte del lecho superior expuesto. Abra la llave de paso y deje que la muestra completa de tres mililitros ingrese a la columna por gravedad. Deseche los primeros tres mililitros de eluyente.

Cualquier color rosado que se forme mientras se manipula la solución quedará atrapado en la parte superior de la columna. Cuando la columna haya dejado de gotear y el soporte del lecho superior esté expuesto, agregue cuatro mililitros del tampón de filtración de gel y recoja cuatro mililitros de eluyente en fracciones de 8,5 mililitros. Después de combinar las fracciones que contienen proteínas, proceda con el ensayo o almacenamiento de la muestra como se describe en el protocolo de texto.

En este estudio, los estudiantes purificaron y posteriormente reconstituyeron una dioxigenasa no hemo de unión al hierro marcada con polihistidina. El análisis SDS-PAGE muestra que la proteína marcada se purifica de manera efectiva. Aquí se muestran los datos de actividad recopilados por los estudiantes sobre la acción enzimática de la L-dopa dioxigenasa purificada después de la reconstitución con hierro dos y la posterior filtración en gel.

El retraso de cinco segundos antes de que comience la recolección de datos es típico de los estudiantes que ejecutan esta técnica por primera vez. El ensayo de estado estacionario indica que los parámetros cinéticos, determinados mediante el ajuste de las curvas de progreso, son consistentes con los resultados publicados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que más hierro no es mejor, ya que demasiado hierro causará la precipitación de proteínas.

Las concentraciones de hierro en el exceso de tres a cinco molares de la proteína son suficientes. Siguiendo este procedimiento, los estudiantes pueden realizar experimentos adicionales para medir la estructura de la solución, observar la química dependiente de la enzima o el sustrato, todo para responder preguntas adicionales sobre el mecanismo de reacción.