Caenorhabditis Tamiz: Un instrumento de baja tecnología y metodología para la clasificación de los organismos multicelulares pequeños
4 de julio de 2018
El protocolo actual incluye una metodología para la clasificación y limpieza de las poblaciones de edad comparable de elegans de Caenorhabditis. Utiliza un simple, barato y eficaz herramienta a la medida para obtener una población experimental de nematodos para la investigación.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología molecular, involucrando ensayos que requieren etapas de desarrollo específicas de C. elegans. Al igual que los ensayos de los niveles de expresión de genes y proteínas. La ventaja de esta técnica es que permite una selección precisa y eficiente de un gran número de C. elegans por tamaño corporal, lo que facilita el uso de ensayos que normalmente serían prohibitivos en tiempo y costo.
Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no pueden realizar el paso de rotación arqueado o no mantienen el flujo de solución en el centro de la malla. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de lavado y volteo son difíciles de aprender. Algunos pueden tener problemas para interpretar y visualizar movimientos específicos en el texto.
Para comenzar, adquiera dos tubos cónicos de 50 ml con tapas, luego use una broca escalonada para quitar el centro del borde interior de las tapas. Si es necesario, use una lima, papel de lija o una herramienta rotativa para limpiar y lijar los bordes y la parte superior de las tapas. A continuación, corta un disco de malla tejida de monofilamento de nylon, ligeramente más pequeño que el diámetro de la tapa.
Texturiza las superficies superiores de los párpados y límpialas con etanol. Después de dejar que las tapas se sequen, aplique pegamento de cianoacrilato en las superficies superiores de ambas tapas. A continuación, coloque el disco de malla monofilamento en una tapa pegada.
Invierta la segunda tapa en la parte superior de la malla y presione las tapas firmemente juntas. Después de que se seque la primera capa de pegamento, aplique un anillo generoso de pegamento de cianoacrilato alrededor del espacio exterior entre las tapas. A continuación, etiquete el filtro con su respectivo tamaño de poro de malla.
Primero, coloque el tamiz sobre un tubo cónico de 50 mL etiquetado. A continuación, pipetee la solución salina por el centro del tamiz hasta que se forme una gota, se fusione y gotee por el centro del filtro. Con un tampón M9, lave una población de C. elegans de una placa de barrena, luego use una pipeta pasteur de vidrio para transferir el tampón que contiene los gusanos en la parte superior de la malla de monofilamento.
Operando en el centro de la malla, enjuague el filtro con tampón M9, repita este paso de enjuague según sea necesario para pasar todas las bacterias y gusanos más pequeños a través de la malla. A continuación, conecte un nuevo tubo cónico de 50 ml a la parte superior del tamiz, los gusanos recolectados anteriormente más grandes que los poros de la malla mirarán hacia el interior del nuevo tubo. Retire el tubo de desagüe y voltee rápidamente el tamiz.
A continuación, enjuague la malla con tampón M9 en el nuevo tubo de recolección. Deje que los gusanos recolectados se asienten durante aproximadamente un minuto, luego aspire con cuidado la solución tampón lejos de la bolita de gusanos. Con una pipeta de vidrio pasteur, cree gotas de gusanos en una placa NGM y deje que se sequen.
Finalmente, enjuague el tamiz con agua de ósmosis inversa y etanol. Después de que el colador se seque, guárdelo en un recipiente limpio para usarlo en el futuro. Deseche el tamiz cuando desarrolle una apariencia flácida.
En este protocolo se construyó un tamiz para clasificar y limpiar las poblaciones de C. elegans emparejadas por edad. Los animales del grupo de tratamiento con tamiz mostraron un patrón de movimiento normal y espontáneo a lo largo de la edad adulta. Además, los grupos de pico y tamiz no mostraron diferencias significativas en la tasa de bombeo faríngeo.
Los animales del grupo tamizado también respondieron normalmente a los estímulos mecánicos anteriores o posteriores en comparación con todos los grupos de tratamiento en cualquiera de los días de prueba. Finalmente, se comparó la fecundidad de los grupos de tratamiento; El uso del tamiz no tuvo un impacto significativo en el número de descendientes en comparación con el grupo de tratamiento PICK. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de diez minutos.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar operar en el centro del área de la malla. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar y usar correctamente un tamiz de Caenorhabditis para clasificar gusanos por tamaño corporal.
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Descripción general
Este protocolo describe una metodología para clasificar y limpiar poblaciones de Caenorhabditis elegans emparejadas por edad utilizando una herramienta fabricada a medida. Permite a los investigadores obtener una población experimental grande de forma eficiente y rentable.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Molecular
- Biología del Desarrollo
Antecedentes
- Las etapas de desarrollo específicas de C.elegans son cruciales para diversos ensayos.
- Los ensayos pueden implicar niveles de expresión génica y proteica.
- Los métodos tradicionales pueden ser largos y costosos.
- Las demostraciones visuales son esenciales para comprender la metodología.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método eficiente para seleccionar C.elegans según el tamaño corporal.
- Facilitar ensayos que requieren etapas de desarrollo específicas.
- Mejorar el acceso para investigadores nuevos en esta técnica.
Métodos Utilizados
- Herramienta personalizada para clasificar nematodos.
- Paso de volteo curvo para un lavado eficaz.
- Mantenimiento del flujo de solución en el centro de la malla.
- Demotraciones visuales para facilitar el aprendizaje.
Resultados Principales
- Selección precisa de un gran número de C.elegans lograda.
- El método reduce el tiempo y el costo de los ensayos de biología molecular.
- Mejor comprensión de movimientos específicos mediante ayudas visuales.
- Mayor accesibilidad para investigadores no familiarizados con el método.
Conclusiones
- El protocolo ofrece un método confiable para clasificar C.elegans.
- Los recursos visuales son cruciales para el aprendizaje efectivo de la técnica.
- Esta metodología puede beneficiar significativamente la investigación en biología molecular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
En la I+D de biofármacos, obtener poblaciones sincronizadas de organismos modelo como C. elegans es fundamental para ensayos reproductibles de cribado fenotípico y validación de dianas. El Cribado Caenorhabditis permite una clasificación rápida y rentable según el tamaño corporal, reduciendo el tiempo y la carga de recursos en los flujos de trabajo iniciales del descubrimiento. Esto respalda la confianza predictiva en la preparación de los ensayos y la selección de carteras al garantizar entradas biológicas uniformes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante poblaciones de gusanos de edad comparable para obtener lecturas fenotípicas consistentes.
- Valor operativo: Proporciona un método económico y escalable para generar cohortes sincronizadas sin necesidad de equipos especializados.
- Valor predictivo: Reduce la variabilidad biológica en los ensayos, mejorando la fiabilidad de los datos para la desaceleración de riesgos del blanco.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos posteriores de cribado de compuestos mediante el aislamiento de etapas específicas del desarrollo.
- Valor Operativo: Estandariza la preparación de gusanos, mejorando la reproducibilidad entre placas de ensayo y campañas de cribado.
- Escalabilidad: Satisface las necesidades de alto rendimiento mediante el procesamiento rápido de grandes poblaciones de gusanos en menos de diez minutos.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Mantiene la fidelidad fenotípica desde el descubrimiento hasta la validación preclínica, preservando marcadores de movilidad, respuesta al estrés y fecundidad.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Permite la evaluación confiable de los niveles de expresión génica y proteica en poblaciones sincronizadas, favoreciendo la alineación de biomarcadores.
- Avance Ajustado al Riesgo: Facilita las decisiones de avance o interrupción al proporcionar entradas consistentes del sistema modelo para el perfilado de eficacia y toxicidad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El Cernedor Caenorhabditis se integra en el continuo de descubrimiento desde el Descubrimiento Temprano hasta la Identificación de Compuestos Prometedores, apoyando específicamente la preparación de ensayos y la reproducibilidad de cribados para cribados fenotípicos basados en C. elegans.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al proporcionar poblaciones uniformes de gusanos para la aclaración de vías y la criba funcional.
- Criba: Permite la preparación de ensayos mediante clasificación por tamaño, asegurando un tamaño y estado larval consistentes de los gusanos para una evaluación fiable de compuestos.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos separados por tamaño que permiten a los equipos comparar condiciones a través de diferentes estadios de desarrollo con menor ruido.
- Investigación Translacional: Se conecta con la continuidad preclínica al mantener marcadores clave de salud (motilidad, respuesta al estrés, fecundidad) tras la clasificación, apoyando la validez de los biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una herramienta reutilizable y de bajo mantenimiento en distintos equipos y proyectos, promoviendo la estandarización en el manejo de organismos modelo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en los ensayos fenotípicos.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de los protocolos de preparación de nematodos.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante la eliminación temprana de riesgos.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en datos fiables del sistema modelo específicos de cada fase.
Consideraciones de Implementación
- Requiere habilidades básicas de laboratorio para el ensamblaje de tamices y el manejo de soluciones.
- Necesita acceso a tubos cónicos, malla de nailon, pegamento de cianoacrilato y tampones estándar (M9, solución salina).
- Exige capacitación entre equipos sobre la operación adecuada centrada en la malla y la técnica de volteo para garantizar consistencia.
- Las consideraciones de adaptación incluyen la selección del tamaño de poro de la malla según las etapas objetivo del gusano y la compatibilidad con diversos sistemas de cultivo en NGM o en medio líquido.
- Las limitaciones prácticas incluyen el posible hundimiento de la malla con el tiempo, lo que requiere reemplazos periódicos para mantener la precisión en la clasificación.
