Name: Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende a amplificar provirus VIH-1 de longitud casi completa desde células individuales infectadas para secuenciación de próxima generación. Este método permite identificar provirus genéticamente intactos y potencialmente competentes para la replicación.

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Este trabajo fue apoyado el Delaney SIDA investigación empresa (DARE) para encontrar una cura (1U19AI096109 y 1UM1AI126611-01); un amfAR Consorcio de investigación sobre la erradicación del VIH (ARCHE) Collaborative Research Grant de la Fundación para la investigación del SIDA (amfAR 108074-50-RGRL); Centro Australiano para el VIH y Hepatitis investigación de Virología (ACH2); UCSF-GIVI centro para investigación del SIDA (P30 AI027763); y el nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica (AAP1061681). Nos gustaría agradecer a Dr. Joey Lai, Gerente de centro de genómica en el Instituto de Westmead para la investigación médica para su entrenamiento en la preparación de la biblioteca y el uso de sus instalaciones y el centro de Ramaciotti genómica (Universidad de New South Wales, Sydney, Australia) para la realización de la secuencia. Reconocemos con gratitud los participantes quienes donaron muestras para este estudio.

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de VOLTERETAS es un método eficiente y de alto rendimiento para la amplificación y secuenciación individuales, cerca de larga duración provirus VIH-1. Se han identificado múltiples factores y pasos críticos en el protocolo que influyen en la cantidad y calidad de las secuencias obtenidas. En primer lugar, el número de células y la frecuencia de infección de VIH-1 de la población de células influyen en el número de provirus amplificado. Por ejemplo, en una publicación anterior, aproximadamente la mitad como muchas secuencias se obtuvieron el mismo número de ingenuo CD4+ T las células en comparación con memoria efectoras CD4+ T las células. Esto es porque las células ingenuas suelen tienen una menor frecuencia de infección de las células de memoria efectora2. En segundo lugar, la lisis celular es preferible a métodos basados en la columna de extracción para la obtención de ADN genómico como no hay riesgo de perder el ADN en el proceso de extracción. Por último, como con cualquier análisis de la polimerización en cadena-basado, prevención de la contaminación es crítico. Separadas las áreas limpias deben ser designadas para la preparación de mezclas principales, manejo de ADN genómico, agregar controles positivos, purificación de DNA y cuantificación y preparación de la biblioteca. Esto es particularmente importante para los ensayos de solo copia como la que aquí se presenta.
Aplicación de la prueba de saltos debe incluir primero ejecuta un control positivo como plásmidos pNL4-3 en lugar de las muestras participantes. Esto permitirá que cualquier solución de problemas antes de la utilización de las células positivas VIH-1, como se pueden comparar las secuencias obtenidas con secuencias de referencia disponibles para estos plásmidos. Cuando se utilizan las células positivas VIH-1, es importante considerar el subtipo VIH-1 (cartillas diseñadas para FLIPS son específicos de subtipo B) y la frecuencia de infección de la población de células si poco no provirus se amplifica. Secuencias de la cartilla pueden ser modificado/rediseñado para que coincida con otros subtipos. Además, un bien que contiene un control positivo se debe incluir en cada PCR realizada.
VOLTERETAS ha superado las limitaciones del anterior análisis de la secuencia, incluyendo SPS. A través de la amplificación y secuenciación cerca de provirus VIH-1 integrales, tirones pueden determinar la potencial competencia de replicación del provirus VIH-1. Esto no fue posible utilizar SPS, que ordenados sólo las regiones sub-genómica y por lo tanto seleccionada para secuencias con sitios de unión del primer intacto. Además, FLIPS supera las limitaciones asociadas con la utilización de múltiples amplificación y secuenciación cartillas, como fue contratado por la anterior secuencia largos ensayos1,4. A través de dos rondas de PCR dirigidas a las regiones LTR de HIV-1 combinadas con NGS, FLIPS disminuye el número y la complejidad de los primers requeridos. TIRONES por lo tanto es menos susceptible a las consecuencias de los desajustes de la cartilla, es decir, la identificación errónea de provirus defectuosos y una incapacidad para amplificar algunos provirus dentro de una población. El protocolo de FLIPS también es más eficiente y permite una mayor transferencia de secuencia que los métodos anteriores.
Evidentemente, FLIPS ofrece ventajas sobre los métodos existentes que determinan la composición genética del provirus VIH-1. Sin embargo, es importante reconocer las limitaciones de tirones. En primer lugar, el ensayo de tirones no se ha desarrollado como una herramienta para medir el tamaño de la reserva latente de VIH-1, como no se han completado los análisis para determinar si los tirones amplifica cada provirus VIH-1 en una población celular. TIRONES en cambio es útil para hacer comparaciones relativas de la composición del embalse entre las poblaciones de células diferentes2. En segundo lugar, la capacidad de replicación de intactas provirus VIH-1 no se puede determinar con certeza sin análisis en vivo , como los realizados por Ho et al. 4. en tercer lugar, tirones no está diseñado para determinar el sitio de integración del provirus VIH-1.
Pequeñas variaciones en el protocolo de tirones pueden aumentar su aplicación. Por ejemplo, cambios en la cartilla secuencias pueden permitir diferentes y múltiples subtipos de VIH-1 amplificado y secuenciado. La secuencia de viriones de VIH-1 de plasma es posible mediante la adición de la síntesis de cDNA antes de la polimerización en cadena jerarquizada. Futura utilización de métodos de secuenciación de molécula única eliminará la necesidad para el montaje de novo .
Secuenciación genética de integrado provirus VIH-1 ha aumentado nuestra comprensión de la reserva latente de VIH-1. FLIPS es una herramienta importante para futuros estudios elucidar la composición y distribución del reservorio latente. Sin embargo, la aplicación de tirones puede extenderse más allá del depósito. Los estudios futuros pueden utilizar FLIPS para determinar objetivos particulares para tecnología CRISPR-Cas, o ayudar en la identificación de la codificación y las regiones no codificantes que hacen más sensible a la latencia de agentes de inversión el virus. Recombinación viral puede entenderse mejor observando los sitios de cruce de grandes deleciones internas.

Caracterización genética de la reserva latente de VIH-1, que persiste en personas en tratamiento antirretroviral a largo plazo (ART), ha sido vital para la comprensión de que la mayoría de los provirus integrados es defectuosos y replicación incompetente1 , 2. durante el proceso de transcripción reversa, se introducen errores en la secuencia proviral integradora. Algunos mecanismos que generan secuencias proviral defectuosas incluyen los errores de enzima de transcriptasa inversa de VIH-13, plantilla de conmutación4o5,de hipermutación APOBEC inducido6. Dos estudios recientes han encontrado que aproximadamente el 5% del provirus VIH-1 aisladas de individuos en el arte a largo plazo son genéticamente intacto y potencialmente réplica-competente y puede contribuir a la rápida recuperación en los niveles plasmáticos de VIH-1 sobre el abandono del hábito de arte 1 , 2 , 7. los estudios anteriores han identificado que provirus VIH-1 réplica-competente persisten en ingenuo y la reclinación memoria CD4+ T subconjuntos (incluyendo central, transicional y células de memoria T efectoras), indicando la importancia de la célula dirigidos a estas células en el futuro estrategias de erradicación2,8,9.
Primeras ideas sobre la distribución, dinámica y mantenimiento de la reserva latente de VIH-1 fueron alcanzados mediante la utilización de métodos de secuenciación solo proviral (SPS) que genéticamente caracterizar regiones sub-genómicas del VIH-1 genoma10 ,11,12,13. SPS es una herramienta versátil, capaz de secuenciar un provirus VIH-1 solo desde dentro de una sola célula infectada. Sin embargo, MSF es incapaz de determinar la capacidad de replicación de provirus, ya que sólo secuencias de sub-genomic provirus regiones y falta que contienen grandes deleciones dentro de sitios de unión del cebador. Un estudio anterior ha demostrado que SPS sobreestima el tamaño del depósito réplica-competente de 13 a 17 veces por secuenciación selectivamente las regiones sub-genómica intacta2.
Para abordar las limitaciones de los SP, Ho et al. 4 y Bruner et al. 1 desarrollado análisis de la secuencia cerca de larga duración provirus VIH-1. Esto permitió que la frecuencia de provirus de HIV-1 genéticamente intactos y potencialmente réplica-competente, en los individuos en el arte a largo plazo a ser determinado. Estos ensayos amplificado y secuenciado (vía Sanger secuenciación) sub-genomic regiones que luego se ensamblaron para obtener un provirus de HIV-1 secuencia del (intacta o defectuoso). Tres limitaciones de este enfoque son: 1) el uso de cebadores de secuencia múltiple aumenta el riesgo de involuntariamente introducir defectos en la secuencia proviral, 2) cartilla desajustes pueden prevenir la amplificación de provirus particular y 3) a menudo el toda secuencia proviral no puede resolverse debido a la tecnicidad de estos métodos.
Para superar las limitaciones de los ensayos de la secuencia proviral de VIH-1 integrales existentes, hemos desarrollado el Full -Length yoindividual Proviral Sequencing (FLIPS) ensayo. FLIPS es una secuenciación de próxima generación (NGS)-ensayo basado que amplifica y secuencias cerca de larga duración (intactas o defectuosos) de provirus VIH-1 de una manera eficiente y de alto rendimiento. FLIPS proporciona ventajas sobre el análisis anteriores, ya que limita el número de iniciadores utilizados; por lo tanto, disminuye la probabilidad de la cartilla desajustes, que pueden limitar la población de provirus capturaron o defectos sin querer introducen una secuencia viral. FLIPS también menos técnicamente es difícil que los anteriores y consiste en 6 pasos principales: células de lisis 1), de infectados por VIH-1, 2) la amplificación de solo provirus VIH-1 por PCR anidada realizada en limitación de dilución utilizando primers específicos para el altamente conservado HIV-1 5' y la región 3' LTR U5 (figura 1A), 3) purificación y cuantificación de productos amplificados, 4) preparación de la biblioteca de provirus amplificados para NGS, 5) NGS y 6) Asamblea de novo de provirus secuenciados para obtener contigs de cada uno los provirus.
Secuencias generadas por tirones pueden someterse a un riguroso proceso de eliminación para identificar a los que son genéticamente intacto y potencialmente réplica-competente (figura 1)2. Provirus intactos genéticamente carecen de todos los defectos conocidos que resultan en la generación de un provirus replicación incompetente. Estos defectos incluyen: secuencias de la inversión, canceladuras internas grandes, codones de parada hypermutation/deletéreos, mutágeno ' frameshift ' o mutaciones en el 5' empaquetado mayor o señal empalme sitio dispensador de aceite (MSD).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> Figura 1: pasos críticos en el análisis de la secuencia proviral individuales completos (FLIPS). (A) genoma de ADN de VIH-1 con sitios de unión de cartilla en 5' y 3' regiones U5 litros utilizados por tirones para amplificar cerca de larga duración (defectuosas e intactos) VIH-1 provirus por PCR anidada. (B) diseño de una placa PCR de 96 pocillos que contienen 80 pozos de muestra (20 pozos para cada dilución), 4 pozos de control negativo y control positivo 1 bien. (C) proceso de eliminación para identificar genéticamente intactos y potencialmente réplica-competente, provirus VIH-1. Esta figura ha sido modificada desde Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Diluido a 5 mM para PCR anidada</td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Solución sustitutiva</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K Solución (20 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td> de 96 <td>pocillos Se puede utilizar cualquier termociclador de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerasa High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón de alta fidelidad [600 mM Tris-SO4 (pH 8,9), 180 mM (NH4)2SO4]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO4</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de nucleótidos de PCR, 10 mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>PCR1 y PCR2 Imprimaciones</td><td></td><td></td><td>desalinizadas. Diluir a (100 &micro; M) con H2O</td></tr><tr><td>Placa de PCR de 96 pocillos, media falda, esquina de una sola muesca, transparente</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Sellos adhesivos</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>necesario para sellar placas de PCR de 96 pocillos</td></tr><tr><td>VIH-1 NL4-3 Clon molecular infeccioso (pNL4-3)</td><td>El siguiente reactivo se obtuvo a través del Programa de Reactivos para el SIDA de los NIH, División de SIDA, NIAID, NIH: Hiv-1 NL4-3 Clon Molecular Infeccioso (pNL4-3) del Dr. Malcolm Martin (Cat# 114).</td><td></td><td>Diluido a 105 copias/mL y utilizado como</td></tr><tr>centrifugadora <td></td><td></td><td></td>de placas de PCR de control positivo<td>o centrífuga de sobremesa</td></tr><tr><td>E-GEL 48 1% Agarose</td><td>Invitrogen G800801</td><td></td><td>Geles prefabricados de agarosa al 1% (se utilizan dos geles por placa de 96 pocillos). Se puede sustituir cualquier gel de agarosa al 1%. Contiene bromuro de etidio.</td></tr><tr><td>DirectLoad Marcador de ADN de amplio rango</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>Cualquier escalera con un alcance de hasta 10 kb puede ser sustituida por</td></tr><tr><td>el dispositivo Mother E-Base</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>Necesario para el funcionamiento de geles de agarosa prefabricados de 48 pocillos al 1% Gel</td></tr><tr><td>Doc EZ Gel Sistema de documentación</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>Se puede utilizar cualquier sistema de visualización para geles de bromuro de etidio que contienen agarosa</td></tr><tr><td>PlateMax Sellado</td> <td>térmico pelableAxygen</td><td>HS-200</td><td>Película de termosellado para almacenamiento a largo plazo</td></tr><tr><td>Placa de almacenamiento de 96 pocillos de 0,8 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>0,8 mL Placa de 96 pocillos necesaria para la purificación de PCR basada en perlas magnéticas</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP (kit de purificación de PCR)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Kit de purificación de PCR basado en perlas magnéticas. Aquí se pueden sustituir otros kits de purificación de PCR (p. ej. Kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen Cat#28106)</td></tr><tr><td>Alcohol etílico, puro. 200 grados, para biología molecular</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td></td><td></td> de microplacas <td></td></tr><tr><td>Tampón opcional EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Tampón de elución</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>Una tinción basada en fluorescencia para medir la concentración de dsDNA Lector</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>microplacas</td></tr><tr><td>Nextera XT Kit de preparación de bibliotecas de ADN</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Placas PCR rígidas de 96 pocillos</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Necesario para el kit de preparación de bibliotecas de ADN Nextera XT</td></tr><tr><td>Kit de cuantificación de bibliotecas - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>Se pueden sustituir otros kits de cuantificación de bibliotecas (p. ej. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technology</td><td></td><td>Sistema de electroforesis automatizado . Úselo junto con un kit de ADN de alta sensibilidad</td></tr><tr><td>Kit de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq Platform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amplificación de cerca integrales provirus vih-1 para secuenciación de próxima generación

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

El ensayo de largometraje individuales Proviral secuenciación (FLIPS) es un método eficiente y de alto rendimiento diseñado para amplificar y secuencia única, cerca de provirus de HIV-1 (intactos y defectuosos), integrales. FLIPS permite la determinación de la composición genética del HIV-1 integrado dentro de una población celular. A través de la identificación de defectos dentro de secuencias de HIV-1 proviral que ocurren durante la transcripción inversa, tales como canceladuras internas grandes, codones de parada deletéreos/hipermutación, mutaciones del mutágeno ' frameshift ' y mutaciones/deleciones en cis elementos temporarios requeridos para la maduración del virión, tirones pueden identificar provirus integrados capaces de replicación. El análisis de saltos pueden ser utilizado para identificar el provirus de HIV-1 que carecen de estos defectos y por lo tanto son potencialmente réplica-competente. Consiste en el protocolo de FLIPS: lisis de células infectadas por VIH-1, nested PCR de cerca integrales provirus VIH-1 (usando las cartillas para el VIH-1 5' y 3' LTR), purificación de DNA y cuantificación, preparación de biblioteca para Next generation Sequencing (NGS), NGS, Asamblea de novo de contigs proviral y un simple proceso de eliminación para identificar provirus réplica-competente. FLIPS ofrece ventajas sobre los tradicionales métodos diseñados para secuencia integran provirus VIH-1, como la secuencia proviral solo. FLIPS amplifica secuencias cerca de provirus integrales permitiendo la competencia de replicación que se determinará y también utiliza menos los cebadores de amplificación, previniendo las consecuencias de los desajustes de la cartilla. FLIPS es una herramienta útil para la comprensión del paisaje genético de provirus de HIV-1 integrados, especialmente dentro del reservorio latente, sin embargo, su utilización se puede extender a cualquier aplicación en que se requiere la composición genética del HIV-1 integrado.

El ensayo de FLIPS amplifica y secuencias individual, cerca de larga duración provirus VIH-1. El protocolo consiste en 6 pasos para obtener cerca de secuencias proviral integrales. Estos pasos incluyen: infectaron por lisis de las células, polimerización en cadena jerarquizada de larga duración (intactos y defectuosos) de provirus VIH-1, purificación de DNA y cuantificación, secuencia de preparación de la biblioteca, NGS, y montaje de novo de secuenciado provirus. Al final de cada paso puede ser considerado un puesto de control en el que puede evaluarse la calidad del producto (e.g. amplificado ADN, el ADN purificado, biblioteca de la secuencia o secuencia) antes del siguiente paso. Un resumen de la evaluación realizada al final de cada paso y los resultados esperados se describe a continuación.
Después de la polimerización en cadena jerarquizada, productos amplificados se ejecutan en un gel de agarosa al 1% (figura 3). La calidad inicial de la PCR se puede determinar por la inspección de los controles positivos y negativos. Pozos de control negativo que contiene el producto amplificado indican contaminación y pozos de control positivo ausente del producto amplificado indican la amplificación insuficiente. A continuación, pozos que contienen producto amplificado se seleccionan para la secuencia. Para evitar pozos que contienen mezclas de múltiples provirus amplificados, se consideran sólo pozos que contienen producto amplificado en dilución de punto final para la secuencia. Según la distribución de Poisson, la dilución de punto final se encuentra al 30% de los pozos son positivo para el producto amplificado. A esta dilución, hay un 80% la oportunidad de estos pozos contienen un único provirus amplificado. Además, pozos que contienen múltiples provirus amplificados de diferentes longitudes se pueden visualizar en esta etapa como múltiples bandas aparecerán en el gel. Estos pozos no deben seleccionarse para la secuencia (figura 3).
Tras la purificación de los provirus amplificados para secuenciación, cuantificación asegura que ninguna DNA proviral se pierde durante la etapa de purificación. Si la concentración de ADN de un provirus amplificado es &lt; 0,2 ng/μl, la muestra restante en la PCR2 placa puede ser purificada. Un control similar ocurre después de la preparación de la biblioteca, en la que se cuantifica cada biblioteca individual. Esto asegura provirus individuales han sido correctamente fragmentados, Tags y amplificada antes de la secuencia. Bibliotecas proviral individuales son agrupadas en cantidades equimolares a una concentración final de la biblioteca de 4 nM (o como especificado por el proveedor de secuenciación). Si la concentración de una biblioteca proviral individual es demasiado baja, puede ser excluido de la piscina de la biblioteca de la secuencia, o la biblioteca individual preparado otra vez. Una verificación final de la concentración de la biblioteca combinada se realiza antes de la secuencia junto con confirmar la longitud media del fragmento.
Medidas de control de calidad antes de la etapa de montaje de novo asegura la calidad de la Lee solía montar el final contig proviral. Estos pasos incluyen: eliminación de secuencias de adaptador, corte de 5' y 3' nucleótidos, un límite de calidad y haciendo caso omiso de lecturas cortas. CLC genómica Workbench puede proporcionar informes de control de calidad que pueden utilizarse antes de evaluar la calidad inicial de los ajustes de recorte guía y Lee y entonces después de determinar si el ajuste fue suficiente para eliminar regiones de baja calidad. Además, para el montaje de novo , evaluó la calidad de los contigs montado puede ser de suficiente profundidad (&gt; 1000 X) y de la uniformidad de la cobertura (Figura 4A). Poblaciones mixtas pueden identificarse también en esta etapa. Mezclas de provirus múltiples de larga duración (~ 9 kb) se identifican por la presencia de múltiples SNPs con una frecuencia de más de 40%, mientras que mezclas de corto (contiene una canceladura grande interna) y larga duración provirus pueden ser identificados por desigual Lea la cobertura de después de asignación para una referencia completa del misma participante (Figura 4B).
Dependiendo de la aplicación, la alineación final se puede visualizar usando herramientas como ggtree disponible como un paquete de "R: A lenguaje y entorno para computación estadística"27. En un reciente estudio, se utilizó tirones a provirus secuencia VIH-1 de ingenuo, central, transición y efectoras memoria CD4+ T células aisladas de individuos en el arte a largo plazo, con el objetivo de identificar si los subconjuntos de la célula particular demostraron mayor proporciones de HIV-1 genéticamente intacto y potencialmente réplica-competente2. Aquí, la representación visual de las secuencias aisladas de un participante de este estudio (participante del 2026) se presenta (figura 5). Este participante, la mayoría (97%) de las secuencias era defectuosa, con secuencias intactas encontradas efectoras y de memoria transitorio CD4+ T las células. Esta herramienta de visualización es útil para mostrar el número de secuencias con grandes deleciones internas y su posición en el genoma. Puede anotarse más para indicar secuencias de codones de parada deletéreo mutaciones del mutágeno ' frameshift ' y eliminaciones/mutaciones en el sitio MSD o señal de empaquetado.
Una aplicación de la prueba de saltos es la identificación de provirus de HIV-1 genéticamente intactos y potencialmente réplica-competente. En un estudio reciente de 531 secuencias aisladas de CD4+ T células de 6 participantes en el arte a largo plazo, 26 provirus de HIV-1 genéticamente intactos (5%) fueron identificados2. El provirus defectuosos restantes incluyen aquellos con secuencias de inversión (6%), grandes deleciones internas (68%), codones de parada deletéreos/hypermutation (9%), mutaciones del mutágeno ' frameshift ' (1%) y defectos en la señal de empaquetado o mutaciones en el sitio MSD (11%) .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> Figura 2: Resumen de flujo de trabajo para el montaje de novo del provirus VIH-1. Los pasos principales en el flujo de trabajo incluyen: 1) secuencia de lectura de control de calidad, 2) fusión de pares superpuestos, 3) montaje de novo y 4) reasignación y consenso ha sido de color rojo, azul, verde y naranja, respectivamente. Esta figura ha sido modificada desde Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> Figura 3: gel de agarosa al ejemplo de PCR amplificado provirus VIH-1. Pozos 1, 2, 3, 6, 9 y 10 contienen el provirus de HIV-1 amplificados. Bien 10 contiene un provirus con una canceladura interna grande, bien 2 contiene la amplificación de dos provirus VIH-1 de diferentes longitudes (mezcla), y 12 bien contiene control positivo. Tenga en cuenta el porcentaje de pozos que contienen producto amplificado es 60%, que es superior el porcentaje requerido para aislar solo plantillas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> Figura 4: ejemplo de salida de asignación leer. Ejemplo (A) cobertura incluso debido a la amplificación de un solo largometraje provirus de HIV-1. Después de nuevo montaje, todas las lecturas se asignan al contig reunido para producir una secuencia consenso. La plataforma de software permite a las lecturas asignadas a inspeccionar para cobertura suficiente e incluso. Ejemplo (B) la amplificación de dos provirus VIH-1 de diferentes longitudes (mezcla). Para determinar mezclas, Lee es asignado a una secuencia de referencia de larga duración (~ 9 kb) desde el mismo participante y leer cartografía inspeccionado. La presencia de cobertura desigual indica una mezcla. Esta figura es reproducida con permiso de Qiagen14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> Figura 5: Visualización de ejemplo de secuencias proviral VIH-1 aisladas de CD4+ T subconjuntos de un individuo en el arte a largo plazo de la célula. Individual HIV-1 proviral secuencias están representadas por líneas horizontales. Esta figura ha sido modificada desde Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La secuencia proviral individual completa (FLIPS) proporciona un método eficiente y de alto rendimiento para la amplificación y secuenciación de sola, cerca de larga duración (intactos y defectuosos) de provirus de HIV-1 y permite la determinación de su potencial capacidad de replicación. FLIPS supera limitaciones de anteriores ensayos diseñados para secuenciar la reserva latente de VIH-1.

Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del VIH, como determinar la composición genética de los provirus del VIH y los diferentes tipos de células. Identificar especialmente aquellos que están genéticamente intactos y potencialmente competentes para la replicación. Las principales ventajas de esta técnica es que nos permite amplificar casi los provirus del VIH de longitud completa de células infectadas por el VIH únicas y luego secuenciarlos por secuenciación de próxima generación.Para comenzar, prepare todos los búferes como se describe en el protocolo de texto. Obtener un pellet celular y añadir cien microlitros de tampón de lysis por millón de células. Mezclar en pipeteando arriba y abajo.Lyse las células incubando en un ciclor térmico a 55 grados centígrados durante una hora y luego agregue 85 grados centígrados durante 15 minutos. Para comenzar a amplificar los provirus de ADN VIH-1 individuales, mezcle los reactivos para la primera PCR redonda, tal como se indica en la tabla uno del protocolo de texto. Agregue 38 microlitros a 85 pozos en una placa PCR de 96 pozos y etiquete esta placa como PCR 1.Después de esto, mueva la placa PCR 1 a un área clara designada para la adición de ADN genómico. El uso de clorhidrato de tris diluye en serie el ADN genómico de una relación de uno a tres a una relación de uno a 81 asegurándose de preparar 45 microlitros de cada dilución. Añadir dos microlitros de ADN genómico diluido a cada pozo de muestra y dos microlitros de clorhidrato de tris a cada pozo de control negativo.Selle toda la placa excepto el pozo de control positivo. A continuación, vaya a un área designada para la adición del control positivo. Añadir dos microlitros del control positivo al pozo correspondiente y luego sellar la placa por completo.Utilice un spinner de placa PCR para girar brevemente la placa PRC 1 y tire hacia abajo de cualquier contenido residual de los lados de los pozos. Ejecute la placa PCR 1 en el ciclor térmico como se describe en el protocolo de texto. A continuación, mezcle los reactivos para la segunda ronda de PCR como se indica en la tabla uno.Añadir 28 microlitros de esta mezcla PCR 2 a 85 pozos de una nueva placa PCR de 96 pozos. Etiquete esta placa como PCR 2. Usando un spinner de placa, gire brevemente la placa PCR 1 para tirar hacia abajo cualquier contenido residual de los lados de los pozos.Añadir 80 microlitros de clorhidrato de tris a cada pozo de esta placa. Después de esto, utilice una pipeta de canal mutli para transferir dos microlitros de cada pozo de la placa PCR 1 a los pozos correspondientes en la placa PCR 2. Selle la placa PCR 2 con una envoltura adhesiva transparente.Gire brevemente la placa PCR 2 en el hilandero de la placa. Mientras tanto, selle la placa PCR 1 con una película de sellado térmico para un almacenamiento a largo plazo a menos 20 grados centígrados. Ejecute la placa PCR 2 en un ciclor térmico como se describe en el protocolo de texto.A continuación, gire brevemente la placa PCR 2 para tirar hacia abajo cualquier contenido residual de los lados de los pozos. Con una pipeta multicanal, añada 60 microlitros de clorhidrato de tris a cada pozo. A continuación, ejecute 15 microlitros de cada pozo en dos geles de agarosa prefabricados de 48 pozos al por ciento que contienen bromuro de etidio.Identifique los pozos que contienen el producto amplificado y sus tamaños aproximados y guarde la imagen del gel. Después de esto, determinar la dilución en la que no más del 30 por ciento de los pozos son positivos para el producto amplificado. En primer lugar, utilice un spinner de placa para girar brevemente la placa PCR 2 y tire hacia abajo cualquier contenido residual de los lados de los pozos.Transfiera 40 microlitros de los pozos que contienen el producto amplificado a los pozos correspondientes de una nueva placa midi de 96 pozos. A continuación, establezca un kit de purificación basado en la alimentación magnética asegurándose de llevar las perlas magnéticas a temperatura ambiente y preparar una solución fresca de 80 por ciento de etanol. Una vez que las perlas alcanzan el vórtice de temperatura ambiente para asegurarse de que se resuspenden a fondo.Usando una pipeta multicanal, agregue 40 microlitros de cuentas a los 40 microlitros de producto amplificado en cada pozo de la placa midi. Mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.Luego, transfiera la placa a un soporte magnético y déjela reposar durante dos minutos. Después de esto, retire y deseche el sobrenadante. Con la placa todavía en el soporte, lave las perlas añadiendo doscientas microlitros de la solución de etanol al 80 por ciento a cada pozo.Incubar a temperatura ambiente durante 30 segundos y luego retirar y desechar el sobrenadante. Repita este proceso de lavado una vez desde la adición del etanol hasta el descarte del sobrenadante. El uso de una pipeta multicanal elimina cualquier exceso de etanol.Deje que las cuentas se sequen al aire durante 15 minutos. Después de esto, retire la placa del soporte. Agregue 30 microlitros de tampón de elución a cada pocótelo y mezcle en pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces.Incubar a temperatura ambiente durante dos minutos. Vuelva a colocar la placa sobre el soporte magnético y déjela reposar durante dos minutos. Usando una pipeta multicanal, transfiera 25 microlitros del sobrenadante a los pozos correspondientes de una nueva placa PCR de 96 pozos.A continuación, utilice un fotómetro de espectro para determinar y registrar la concentración aproximada de cada producto de ADN amplificado. Establezca un kit de cuantificación de ADN de doble cadena y diluya el tampón a una vez en agua estéril libre de ADN. Agregue 99 microlitros del tampón a un número adecuado de pozos vacíos en una placa de cultivo de tejido inferior plano.A continuación, agregue cien microlitros de tampón a tres pozos en blanco. Para cada producto amplificado a medir añadir un microlitro de ADN purificado en triplicado a cada tampón que contiene el pozo. Diluir el ADN de doble cadena lambda 10 veces de dos nanogramos por microlitro a apuntar nanogramos cero cero por microlitro para preparar los estándares.Agregue cien microlitros de cada estándar de ADN de doble cadena a tres pozos. Diluir el tinte de florescencia de uno a doscientos con tampón. Agregue rápidamente cien microlitros a cada pozo que contenga una muestra, en blanco o estándar y mezcle en pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Después de esto, cubra la placa con papel de aluminio para evitar el contacto con la luz. Usando un lector de microplacas, registre la emisión de florescencia. Utilice las mediciones registradas para determinar la concentración de ADN de doble cadena en cada muestra.A continuación, diluir cada producto purificado con agua a una concentración de punto cero dos nanogramos por microlitro. Después de la PCR anidada, los productos amplificados se ejecutan en un gel de agarosa del uno por ciento. La calidad inicial del PCR se puede determinar inspeccionando los controles.Como los controles negativos que contienen productos amplificados indican contaminación y los controles positivos sin producto amplificado indican amplificación insuficiente. Sólo los pozos se ejecutan en la dilución del punto final que contienen provirus amplificados únicos se consideran para la secuenciación. Mientras que los pozos que contienen múltiples provirus amplificados de diferentes longitudes se pueden visualizar en esta etapa, no deben ser seleccionados para la secuenciación.Para el montaje de novo, la calidad de los contigs ensamblados se puede evaluar para obtener suficiente profundidad y uniformeidad de cobertura. Las poblaciones mixtas también pueden ser identificadas en esta etapa por la presencia de una cobertura desigual. La representación visual de las secuencias aisladas de un participante revela que el 97 por ciento de sus secuencias son defectuosas.Con secuencias intactas encontradas en el efector y memoria de transición CD4 células T positivas. Al intentar este procedimiento es importante recordar que sólo los productos amplificados obtenidos en la dilución limitante, es donde no más del 30 por ciento de los pozos son positivos, contienen un solo provirus. Después de este procedimiento, los productos amplificados se pueden secuenciar para determinar la composición genética de los provirus del VIH.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del VIH exploraran la distribución de provirus del VIH genéticamente intactos y diferentes tipos de células en los pacientes en la terapia para determinar dónde se esconden los provirus competentes genéticamente intactos y potencialmente replicados. No olvide que trabajar con células infectadas por el VIH puede ser peligroso y que las precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado y trabajar con un laboratorio certificado, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.

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Investigación

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Genética

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