Name: Estudio incorporación de ribonucleótido: Filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a detectar ribonucleótidos en el genoma de levadura mediante electroforesis en gel alcalino y Southern blot específico de cadena. Este método cuantifica la incorporación mutagénica de ribonucleótidos en ADN replicativo.

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Agradecemos a los actuales y ex miembros del laboratorio de Kunkel por su trabajo y discusiones relacionadas con protocolo y reutilizar los datos presentados aquí. Este trabajo fue apoyado por proyecto Z01 ES065070 a T.A.K. de la división de investigación intramuros de los institutos nacionales de salud (NIH), nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS).

1. alcalina hidrólisis y filamento específico Southern Blot (figura 1)
<ol><li>Crecimiento y aislamiento de ADN genómico de la célula<ol>
<li>Aislar el ADN genómico de levadura usando una kit de purificación de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante de la levadura. Uso de las culturas que se encuentran en la fase exponencial de crecimiento entre (densidad óptica de 0.5) y 1. Resuspender el precipitado de ADN final en 35 mL de 1 x de tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM ácido de etilendiaminotetracético (EDTA)).</li>
		<li>Añadir 1 mL de 5 mg/mL Rnasa A para el ADN e incubar 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Precipitar el ADN con 0,1 volúmenes de acetato de sodio de 3 M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100% por 20 min en hielo.</li>
		<li>Centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Lavar el pellet dos veces con 500 mL de etanol al 70%. Quite el sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Secar el pellet en Banco y resuspender en 35 ml de 1 x de buffer TE.</li>
		<li>Cuantificar el ADN utilizando un Fluorímetro (Tabla de materiales) con el dsDNA kit BR ensayo.</li>
		<li>Precipitar el magnesio 5 del ADN de cada muestra utilizando 0,1 volúmenes de acetato de sodio de 3 M, volúmenes de pH 5.2 y 2,5 de 100% EtOH para un volumen total de 200 mL (si es necesario, adicional de 5 mg de ADN es necesaria si el gel neutro de control es necesario, agregue H2O). Incubar en hielo por 20 min.</li>
		<li>Centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Secar el pellet en Banco. Resuspender el DNA en 14 mL de H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Electroforesis alcalina de hidrólisis y gel<ol>
<li>Añadir 6 mL de 1 M de KOH e incubar a 55 ° C por 2 h.</li>
		<li>Incubar las muestras en hielo durante 5 minutos.</li>
		<li>Añadir 4 mL de 6 x de buffer de carga alcalina de ADN: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, 18% polysucrose (Tabla de materiales), 0.15% verde de bromocresol y 0.25% xileno cyanol FF.</li>
		<li>La fundición de un gel alcalino que se compone de 1% agarosa, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Utilice un peine que permite 24 mL de muestra de ADN para ser cargado por carril.</li>
		<li>Correr el gel a temperatura ambiente en 1 x buffer de electroforesis alcalina: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Incluyen un adecuado marcador de tamaño de DNA.</li>
		<li>Desactivación de los tubos brevemente y cargar la muestra entera 24 mL en el gel de agarosa alcalina. Electrophorese durante 30 min a 30 V, seguido por 18-20 h a 10 V.</li>
		<li>Neutralizar el gel para 2 incubaciones de 45 min a temperatura ambiente con agitación suave en el tampón de neutralización I: 1 M Tris-HCl, 1,5 M de NaCl.</li>
		<li>Mancha el ADN sumergiendo el gel neutralizado en 200 mL de agua que contiene una dilución 1/10.000 de tintura SYBR oro por 2 h a temperatura ambiente con agitación suave.</li>
		<li>Visualizar el ADN utilizando un transiluminador UV. Aumento de la sensibilidad de álcali provoca la aparición de pequeños fragmentos de ADN, lo que indica una mayor densidad de ribonucleótidos rupturas en el ADN5.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferencia de meridional<ol>
<li>Transferir el ADN desde el gel alcalino a la membrana de nylon cargada positivamente por acción capilar10. Un ejemplo de cómo se puede configurar este traslado está previsto en el manual Sambrook y Russell10.</li>
		<li>Remojo el gel alcalino durante 15 min a temperatura ambiente en Buffer alcalino transferencia: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.</li>
		<li>Mojar la membrana de nylon (cortar al tamaño del gel) brevemente con agua y luego reposar 5 min en alcalina tampón de transferencia.</li>
		<li>Establecer la plataforma de transferencia invirtiendo 3 vasos de vidrio (100 mL) en un vaso de hornear. Este plato debe ser ligeramente mayor que el tamaño del gel de agarosa. Fijar una placa de vidrio sobre la parte superior de ellos.</li>
		<li>Cuelgue la placa de vidrio de 2 pedazos grandes de 3 MM CHR cromatografía en papel (el tamaño de la anchura del gel más lados más largos que pueden cuelgue de los bordes en el tanque del almacenador intermediario).</li>
		<li>Vierta alcalina tampón de transferencia sobre el papel de cromatografía y mitad llenar el plato de vidrio. Suavizar las burbujas con una pipeta de vidrio de 5 mL.</li>
		<li>Colocar el gel de agarosa en la parte superior, otra vez suaviza las burbujas. Alrededor de los bordes del gel con parafilm. Vierta una pequeña cantidad de tampón alcalino de transferencia en el gel.</li>
		<li>Coloque la membrana de nylon previamente remojadas en la parte superior del gel. Suavizar las burbujas.</li>
		<li>2 pedazos húmedos de papel se cortan con el tamaño del gel de agarosa. Colocar encima de la membrana y alise cualquier burbuja.</li>
		<li>Coloque una pila grande de toallas de papel (corte a un tamaño ligeramente más grande que el gel de agarosa) en la parte superior el sándwich de transferencia. Con cuidado coloque una placa de vidrio sobre las toallas de papel. Agregar un objeto cargado a la parte superior (un libro con una masa de 400 g funciona bien).</li>
		<li>Que la transferencia de proceder durante la noche a temperatura ambiente.</li>
		<li>Cuidadosamente la pila de transferencia separar y remoje la membrana durante 15 min a temperatura ambiente en el II de tampón de neutralización: 0.5 M Tris-HCl, pH 7.2, 1 M NaCl.</li>
		<li>Reticulación de la DNA a la membrana de nylon cargada usando un crosslinker UV. Colocar la membrana en la vinculante y utilice la opción autocrosslink.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la sonda sur Nota: El procedimiento descrito aquí para detectar sitios sensibles al álcali en el naciente líder-versus filamento del revestimiento termoaislante del filamento de la DNA se basa en un protocolo publicado previamente11. Para nuestro experimento, sondeo se realiza en el gene del reportero URA3 que se ha insertado en una de dos orientaciones (OR1 o OR2) adyacentes al origen de replicación de ARS306 en el cromosoma III (Figura 3A). La presencia de sitios sensibles al álcali en el ADN genómico de levadura es un indicador de la incorporación de ribonucleótido, permitiendo el uso de ribonucleótidos como los biomarcadores de ADN polimerasa actividad12,13,14. Este enfoque, con un objetivo de secuencia de ADN adyacente al eficiente ARS306 origen de replicación, debe prestarse a otras localizaciones genómicas y genes de la blanco.<ol>
<li>Segmento de par 520-base de amplificación PCR del gen reportero URA3 utilizando el siguiente par de cartilla: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) y URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>Realizar la reacción de PCR con 10-20 ng de ADN genómico de levadura como plantilla, 4 μL de cada cebador (10 μM de valores), 10 μL de 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 8 μL de mezcla de dNTP (2,5 mM), 0.5 μL de Ex Taq ADN polimerasa (5 U/μL) y ajustar el volumen final a 100 μL con H2O.</li>
		<li>Ejecutar el siguiente programa PCR: 95 ° C por 5 min; 30 ciclos de 95 ° C por 1 min, 55 ° C por 1 min, 72 ° C por 2 min; 72 ° C durante 10 minutos y mantener a 4 ° C.</li>
		<li>Purificar el producto PCR utilizando un kit de potabilización de la polimerización en cadena y eluir el ADN con 50 mL de H2O. Esto puede usarse ahora como la plantilla en la reacción radiolabeling.</li>
		<li>Utilice los siguientes iniciadores para filamento específico radiolabeling: uso URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) para la visualización de ADN que recuece a sonda A. Esto corresponde al naciente líder hebra ADN se haya URA3 OR2 y tnascent quedando el filamento de la DNA cuando URA3 OR1. Utilice URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) para la visualización de DNA naciente que recuece a sonda B. Esto corresponde al naciente líder hebra ADN se haya URA3 OR1 y revestimiento naciente filamento de la DNA se haya URA3 OR2 (figura 3).<ol>
<li>Realizar la reacción radiolabeling con 10-20 ng amplificado URA3 fragmento como plantilla de ADN, 2 μL de cebador (stock de 10 μM), 5 μL de 10 x Ex Buffer Taq (Mg2 + plus), 4 μL de dNTPs 2,5 mM (menos dCTP), 5 μL (50 μCi) de a -32P-dCTP , 0.5 μL de ExTaq ADN polimerasa (5 U/μL) y ajustar el volumen final de 50 μL con H2O. ejecutar el siguiente programa para radiolabeling: 94 ° C por 5 min; 25 ciclos de 94 ° C por 1 min, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 1 min; 72 ° C por 5 min y mantener a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizar una columna de giro G-25 para quitar etiqueta radiactiva no incorporada. Antes de añadir la muestra radiactiva, centrifugar la columna durante 1 min a 720 x g e impresor buffer mediante pipeteo. Cargar el producto de la reacción radiactiva y centrifugar durante 2 min a 720 g x a fin de eluir la sonda marcada.</li>
		<li>Incubar a 95 ° C por 5 min desnaturalizar la sonda inmediatamente antes de la hibridación. Dejar enfriar brevemente en el hielo.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridación de Southern<ol>
<li>Rollo de la membrana mojada en un tubo de hibridación y añadir 25 mL de tampón de hibridación recién preparado: tampón de fosfato sódico de 0,5 M, pH 7.2, 7% sodio dodecil sulfato (SDS), el 1% de albúmina sérica bovina (BSA). Incubar a 65 ° C durante 1-2 h con la rotación en un horno de hibridación.</li>
		<li>Con cuidado retirar la solución y añadir 25 mL de tampón de hibridación y la sonda radiactivamente. Incubar a 65 ° C durante 16-18 h con la rotación.</li>
		<li>Retirar la solución en un contenedor de residuos radiactivo. Realizar 5 lavados de 5 minutos a temperatura ambiente con fosfato-SDS lavado solución I: 40 mM de tampón fosfato de sodio, pH 7.2, pH de 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 8.0.</li>
		<li>Realizar 2 lavados de 15 minutos a 65 ° C con fosfato-SDS lavado solución II: almacenador intermediario de fosfato de sodio 40 mM, pH 7.2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>Quitar la membrana del tubo de hibridación con unas pinzas y colocar en un protector de la manga de plástico abierto. Cubrir y exponer a una placa de imagen. Trate de un número de tiempos que van de 4 h a 4 d de exposición diferentes.</li>
		<li>Si es necesario, pele y vuelva a sonda el blot con una sonda diferente aproximadamente 3 - 4 veces. Para la tira, incubar la membrana por 2 h a 65 ° C en 25 mL de un 50% de formamida, 2 solución de x SSPE. Nota: 20 x SSPE solución: 3 NaCl M, 0,2 M NaH2PO4, 0.02 M de EDTA, pH 7,4.</li>
		<li>Retirar la solución en un contenedor de residuos radiactivo. Realizar 2 lavados de 15 minutos a 65 ° C en fosfato-SDS lavado solución II.</li>
		<li>Verificar la membrana con un contador Geiger y repetir el protocolo de extracción si la señal permanece.</li>
		<li>Realizar la hibridación y la hibridación como se describió anteriormente.</li>
	</ol></li>
</ol>2. medir la tasa de mutación y la especificidad de las cepas de S. cerevisiae
<ol><li>Preparar el cultivo celular<ol>
<li>Inocular una colonia sola (levadura saludables células toma 2-3 días a 30 ° C a la forma adecuada de tamaño las colonias) cultivada en agar YPD suplementado con adenina 100 mg/mL en 5 mL de caldo YPDA con adenina de 250 mg/mL (la suplementación de la adenina sólo es necesario si la cepa empleada es un auxotroph adenina). Crecer en un Incubador agitador o en un rotador a 30 ° C hasta que la cultura llegue a saturación (36-48 h para una cepa sin un defecto de crecimiento grave).</li>
		<li>Desactivación de las células a ~ 2000 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y lavar las células con 5 mL de agua estéril.</li>
		<li>Resuspender las células en 500 mL de agua estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dilución del cultivo celular y galjanoplastia<ol>
<li>Para los controles de no selección, diluir las células en una placa de 96 pocillos por un factor de 1.600.000 y la placa de 100 mL de cada cultivo en una placa completa de (COM).</li>
		<li>Para seleccionar mutantes ura3 , placa 100 mL de células sin diluir en un plato 5-FOA para una cepa de tipo salvaje (WT). Diluir las células en consecuencia si la tasa de mutación de la cepa de interés se espera que sea mayor que en una cepa WT.</li>
		<li>Para seleccionar para can1 mutantes, diluir las células 5 veces y placa 100 mL sobre una placa que contienen canavanina (CAN) para una cepa WT. El factor de dilución es de 0,5.</li>
		<li>Incubar las placas a 30 ° C hasta que se formen las colonias de levadura. Para las cepas sin un defecto de crecimiento, 2-3 días es usualmente suficientes para COM y puede placas y 3-5 días para las placas 5-FOA. Para comparar las tasas de mutación entre diferentes cepas, es mejor elegir el mismo día de crecimiento en contar las colonias. Almacenar las placas listas para ser contados en la cámara fría (~ 4 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cálculo de la tasa de mutación espontánea<ol>
<li>Contar las colonias visibles en cada plato y tomar notas de los números de la Colonia</li>
		<li>Calcular la tasa de mutación con la fórmula de Drake: μ = f ÷ ln (μNt). f es la frecuencia de mutación calculada por el número de mutantes dividido por el número de células en el cultivo final. NT es el número de células en el cultivo final y μ es la tasa de mutación. Esta ecuación puede resolverse por un método iterativo como el método de Newton-Raphson. Hay otros métodos de estimador, incluyendo la prueba Lea y Coulson, para calcular la tasa de mutación15.</li>
		<li>Calcular el intervalo de confianza suponiendo que registro normal distribución de las tasas de utation de aislamientos individuales. Más a menudo se utiliza el intervalo de confianza de 95%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis del espectro de la mutación<ol>
<li>Escoja una sola Colonia de cada 5-FOA o puede placa y refrescar en una placa YPDA.</li>
		<li>Realizar Colonia PCR para amplificar el gen URA3 o CAN1 y secuencia para la detección de mutaciones mediante los siguientes cebadores: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') y URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') para ambos amplificación por PCR y secuencia del gene 800 bp URA3 ; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') y CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') para la amplificación y CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') y (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') para la secuenciación del gen reportero 1800 bp CAN1 .</li>
		<li>Para realizar la PCR de Colonia, resuspender una colonia solo en 5 μL de H2O y use 1 μL como plantilla. Añadir 1 μL de cada uno de los iniciadores (5 μM de valores), 2 μL de tampón de x KAPA2G 5 (Mg2 + plus), 0.5 μL de dNTP (2,5 mM), 0.5 μL de KAPA2G Fast DNA polimerasa, 12 μL de H2O.</li>
		<li>Para la amplificación del gen URA3 , ejecutar el siguiente programa PCR: 95 ° C por 5 min; 5 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 15 s, 72 ° C por 30 s; 35 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 15 s, 72 ° C por 30 s; 72 ° C durante 2 minutos y mantener a 4 ° C. Para la amplificación del gen CAN1 , ejecutar el siguiente programa PCR: 95 ° C por 5 min; 5 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 15 s, 72 ° C por 45 s; 35 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 15 s, 72 ° C por 45 s; 72 ° C durante 2 minutos y mantener a 4 ° C.</li>
		<li>Alinear los resultados de la secuencia a la secuencia de referencia utilizando un programa como DNASTAR Seqman Pro o Sequencher identificar mutaciones.</li>
		<li>Compilar los datos de mutaciones mutación tipo (figura 4) o localización de la mutación (figura 5). Calcular las tasas de mutación específica por la frecuencia de una mutación (el número de eventos observados dividido por el número de mutantes secuenciado) multiplicaron por la tasa de mutación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+%7Balpha%7D+and+%7Bdelta%7D%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li>
<li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016(2012).</li>
<li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos a los protocolos de dos series de experimentos que se utilizan con frecuencia para analizar cuantitativamente los ribonucleótidos incorporados durante la replicación del ADN y los efectos mutagénicos de ribonucleótidos rupturas. Aunque estos enfoques involucran el eukaryote modelo S. cerevisiae, estas técnicas se pueden adaptar fácilmente a otros microbios y eucariotas superiores incluso.
Sondeo de ribonucleótidos rupturas en el ADN mediante electroforesis en agarosa...

Durante la replicación del ADN nuclear eucariótica, ribonucleótidos se incorporan en el genoma por todos tres principales replicases de ADN, ADN polimerasas (Pols) α, ε y δ1,2. Reparación de la supresión de Rnasa dependiente de H2 ribonucleótido (RER3) elimina la mayoría de estos ribonucleótidos incrustados.
Un ribonucleótido en el ADN es susceptible a la hidrólisis, como el grupo hidroxilo 2' de la molécula de azúcar puede atacar el enlace fosfodiéster adyacente, liberando un extremo con un 2' - 3' fosfato cíclico y el otro con un 5'-OH4. Condiciones alcalinas pueden acelerar significativamente esta reacción. Así, la hidrólisis de los ribonucleótidos encajados durante la incubación en una solución básica causa fragmentación de la DNA genomic, que puede ser visualizada por electroforesis de agarosa alcalina5. Este ADN puede ser transferido a una membrana y sondeado por análisis de Southern blot usando sondas específicas de filamento que permiten la identificación de sitios sensibles al álcali causada por ribonucleótidos incorporados en el naciente líder - o -filamento del revestimiento termoaislante ADN, respectivamente.
En las células de levadura que carece actividad Rnasa H2, eliminación de ribonucleótidos se puede iniciar cuando topoisomerasa I (Top1) mellas el ADN en el ribonucleótido encajado6,7. Sin embargo, cuando se segmenta el Top1 del lado 3' de la ribonucleótido, esto genera OH 5' y 2' - 3' fosfato cíclico ADN extremos que son refractarios a la religación. La falta de reparación o procesamiento aberrante de estas 'tapas sucias' puede conducir a inestabilidad genómica. Además, si la incisión se produce dentro de una secuencia de ADN repetida, el proceso de reparación puede llevar a mutaciones de la canceladura. Esto es particularmente problemático para repeticiones en tándem, donde corto las canceladuras (de entre dos y cinco pares de bases) se observa comúnmente en las células deficientes de H2 de Rnasa. Los efectos deletéreos de Top1-dependiente en la ausencia de levadura Rnasa H2 actividad se exacerban en un mutante ε de polimerasa de la DNA (M644G pol2) promiscuo para incorporación de ribonucleótido durante el naciente líder síntesis de strand.
Procesamiento de ribonucleótidos en el ADN conduce a mutaciones espontáneas y este mutagénesis puede detectarse utilizando genes del reportero apropiada y seleccionando el cambio fenotípico que lo acompaña. Una prueba de fluctuación o experimento de Luria y Delbrück es uno de los métodos más utilizados para medir las tasas de mutación espontánea utilizando seleccionable reporter genes8,9. En la levadura, los genes URA3 y CAN1 pueden utilizarse como reporteros en un ensayo de mutación adelante, que permite la detección de todos los tipos de mutación que resultan en la pérdida de función del gene. La tasa de mutación espontánea es estimada como la media de lo observado para múltiples culturas paralelas de colonias individuales sin mutaciones en el gene del reportero de destino. Una levadura Rnasa H2-deficiente tensión tales como rnh201Δ tiene una tasa de mutación espontánea en general moderadamente elevada en gran parte causado por una elevada incidencia de deleciones de bp 2-5 en tándem de secuencias repetidas. Así, para caracterizar completamente los efectos mutagénicos de ribonucleótidos en el genoma, las tasas de mutación específica tiene que determinarse. En este caso, los genes del reportero URA3 o CAN1 pueden ser amplificados y secuenciados para determinar los tipos y localizaciones de las mutaciones, y pueden calcularse tasas de mutación específica. Compilación de mutaciones identificadas en varios mutantes URA3 o CAN1 independiente puede utilizarse entonces para generar un espectro de mutación.

<table><tbody><tr>Medios <td></td><td></td><td>YPD</td><td>20 g de dextrosa, 20 g de peptona, 10 g de extracto de levadura, en H2O desionizado hasta 1 L, añadir 20 g de agar Bacto para medios sólidos, autoclave.</td></tr><tr><td>Placas COM 1,3 g de</td><td></td><td></td><td>mezcla de gotas SC, 1,7 g de levadura base nitrogenada sin aminoácidos o (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrosa, 20 g de Bacto agar H2O desionizado hasta 1 L. Ajustar el pH a 5,8. Autoclave y 30 &ndash; 35 ml por plato.</td></tr><tr><td>Placas CAN 1,3 g de</td><td></td><td></td><td>polvo de caída SC-Ura, 1,7 g de levadura a base de nitrógeno sin aminoácidos ni (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrosa, 20 g de agar Bacto, 25 mg de uracilo y H2O hasta 1 L. Autoclave durante 15 minutos a 121 °C; C y enfríe a 56 °C. Agregue 6 mL de solución de sulfato de canavanina al 1% esterilizada por filtro.</td></tr><tr><td>Placas 5-FOA</td> 1,3 g de <td></td><td></td><td>polvo de gota SC-Ura, 1,7 g de levadura base de nitrógeno sin aminoácidos ni (NH4)2SO4, 5 g de (NH4)2SO4, 20 g de dextrosa, 20 g de agar Bacto, 25 mg de uracilo y H2O hasta 800 mL. Autoclave durante 15 minutos a 121 &deg; C y enfríe hasta 60 °C. Agregue 200 mL de solución de 5-FOA al 0,5% esterilizada por filtro.</td></tr><tr><td>L-Canavanine sulfato</td><td>US Biological</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>US Biological</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 mL tubo</td><td></td><td></td> de cultivo <td>de vidrio Cualquier marca</td></tr><tr><td>Rotador de cultivo en 30 & grados; C incubadora</td><td></td><td></td> Se <td>puede utilizar la incubadora Shaker en su lugar</td></tr><tr><td>Placas inferiores redondas de 96 pocillos</td><td></td><td></td><td>Estéril, de cualquier marca</td></tr><tr><td>Perlas de vidrio de 3 mm</td><td>Autoclave Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>antes de usar</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td></td><td></td> de 12 canales <td>Cualquier marca</td></tr><tr><td>Ex Taq ADN Polimerasa</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure ADN de levadura Kit de purificación</td><td>Epicenter</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorímetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td> Nuevo <td>modelo disponible</td></tr><tr><td>dsDNA BR Kit de ensayo</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td></td><td></td>DSF10400</tr><tr><td>Bromocresol verde</td><td>Eastman</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol FF</td><td>International Technologies Inc.</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador</td><td></td><td></td><td></td>UV</tr><tr><td>Amersham Membrana de nylon Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR Papel de cromotografía</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 columna de centrifugación</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tampón de fosfato de sodio (pH 7,2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>Contador</td><td></td><td></td><td></td> Geiger</tr></tbody></table>

estudio incorporación de ribonucleótido: filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

La presencia de ribonucleótidos en el ADN nuclear ha demostrado ser una fuente de inestabilidad genómica. El grado de incorporación de ribonucleótido puede evaluarse por hidrólisis alcalina y electrophoresis del gel del RNA es muy susceptible a hidrólisis en condiciones alcalinas. Esto, en combinación con el análisis de Southern blot puede utilizarse para determinar la ubicación y el filamento en la que se han incorporado los ribonucleótidos. Sin embargo, este procedimiento es solamente semicuantitativa y puede no ser lo suficientemente sensible para detectar pequeños cambios en el contenido de ribonucleótido, aunque específicos de filamento Southern blot sondeo mejora la sensibilidad. Como una medida de una de las más sorprendentes consecuencias biológicas de ribonucleótidos en el ADN, mutagénesis espontánea pueden ser analizada utilizando un ensayo de mutación adelante. Mediante genes reporteros apropiados, mutaciones raras que resulta en la pérdida de función pueden ser seleccionada y en general y las tasas de mutación específica pueden medirse mediante la combinación de datos de experimentos de fluctuación con secuencia de la DNA del gene del reportero. El ensayo de fluctuación es aplicable para examinar una gran variedad de procesos mutagénicos en fondo genético específico o condiciones de crecimiento.

Tratamiento de la DNA genomic con álcalis seguido de electroforesis alcalina permite la detección semicuantitativa de la fragmentación del DNA debido a la abundancia de ribonucleótidos estable incorporados. La figura 2 muestra las imágenes de gel de la DNA de genomic tratada con o sin KOH5de levadura. La variante M644L de Pol2, la subunidad catalítica de la Polε, ha reducido la capacidad de incorporación de ribonucleótidos mientras que...

Ribonucleótidos están entre los nucleótidos no canónico más abundantes incorporados en el genoma durante la replicación del ADN nuclear eucariótica. Si no quitado, ribonucleótidos pueden causar mutagénesis y daño de la DNA. Presentamos dos enfoques experimentales que se utilizan para evaluar la abundancia de incorporación ribonucleótido en ADN y sus efectos mutagénicos.

Estudio incorporación de ribonucleótido: Filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Este método puede ayudar a responder preguntas como cuántos ribonucleótidos se incorporan en el ADN de hebra naciente, principal y rezagado en el genoma. Aunque este método puede proporcionar información cuantitativa y cualitativa sobre la densidad de ribonucleótidos en el genoma de la levadura, también se puede aplicar a otros sistemas, como los genomas de los mamíferos. La electroforesis en gel alcalino proporciona una visión semicuantitativa de la incorporación de ribonucleótidos en todo el genoma y la transferencia sur específica de la cadena permite una mayor sensibilidad y cuantificación en un locus genómico específico.Para comenzar este procedimiento, agregue seis microlitros de hidróxido de potasio molar a cada muestra de ADN genómico de levadura recién preparado e incube a 55 grados centígrados durante dos horas. Después de dos horas, incube las muestras en hielo durante cinco minutos. A continuación, añada a cada muestra cuatro microlitros de tampón de carga de ADN alcalino 6-6.Funda un gel alcalino compuesto por un uno por ciento de agarosa, 50 milimolares de hidróxido de sodio y un milimolar EDTA pH ocho con un peine que permite cargar 24 microlitros de muestra de ADN por carril. Gire brevemente los tubos de las muestras. Cargue los 24 microlitros completos de cada muestra en el gel alcalino de agarosa.Incluya un marcador de tamaño de ADN apropiado. Electroforese a 30 voltios durante 30 minutos. Luego baje el voltaje a 10 voltios y electroforese durante 18 a 20 horas.Al día siguiente, neutraliza el gel. Sumerja el gel en el tampón de neutralización uno e incube a temperatura ambiente con una agitación suave durante 45 minutos. Reemplace la mezcla de tampón de neutralización con tampón nuevo.E incubar durante otros 45 minutos. Para teñir el ADN, remoje el gel neutralizado en 200 mililitros de agua que contenga una dilución de uno a 10000 de tinte de oro sybr a temperatura ambiente con una agitación suave durante dos horas. Visualiza el ADN usando un transiluminador UV.El ADN del gel alcalino se transferirá a una membrana de nailon cargada positivamente por acción capilar. Primero remoje el gel alcalino a temperatura ambiente durante 15 minutos en tampón de transferencia alcalino. A continuación, humedezca brevemente la membrana de nailon con agua y sumérjala en un tampón de transferencia alcalina durante cinco minutos.Configure la plataforma de transferencia invirtiendo tres vasos de vidrio de 100 mililitros en una fuente para hornear de vidrio que sea un poco más grande que el tamaño del gel de agarosa. Coloque un plato de vidrio encima de los vasos de precipitados de vidrio. Coloque dos trozos grandes de papel de cromatografía MMCHR sobre la placa de vidrio.Vierta el tampón de transferencia alcalina sobre el papel de cromatografía y llene el plato de vidrio hasta la mitad. Alise las burbujas con una pipeta de vidrio de cinco mililitros. Coloca el gel de agarosa encima.De nuevo, alisando las burbujas. Rodea todos los bordes del gel con parafilm. Vierta una pequeña cantidad de tampón de transferencia alcalina sobre el gel.Coloque la membrana de nailon previamente empapada encima del gel y alise las burbujas. Pon dos trozos de papel de cromatografía cortados a la medida del gel de agarosa. Colócalos encima de la membrana y alisa las burbujas.Coloque una pila grande de toallas de papel encima del sándwich de transferencia y coloque con cuidado un plato de vidrio encima de las toallas de papel. Agregue un objeto pesado en la parte superior y deje que la transferencia continúe a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, desmonte con cuidado la pila de transferencias.Remoje la membrana a temperatura ambiente en el tampón de neutralización dos durante 15 minutos. Reticulación del ADN a la membrana de nailon cargada mediante un reticulante UV. Utilice la configuración de enlace cruzado automático.Antes de comenzar el procedimiento de hibridación, prepare la sonda radiomarcada como se describe en el protocolo de texto. Enrolle la membrana humedecida en un tubo de hibridación y agregue 25 mililitros de tampón de hibridación recién preparado. Incubar a 65 grados centígrados con rotación en un horno de hibridación durante una o dos horas.Vierta con cuidado la solución y agregue 25 mililitros de tampón de hibridación más la sonda. Incubar a 65 grados centígrados durante 16 a 18 horas con rotación. A continuación, vierta la solución en un contenedor de residuos radiactivos.Agregue la solución de lavado fosfato STS uno al tubo de hibridación y gire a temperatura ambiente durante cinco minutos. De esta manera, realice cinco lavados de cinco minutos cada uno con solución de lavado fosfato STS uno. Después del quinto lavado con solución de lavado STS de fosfato, se lava la membrana dos veces con solución de lavado STS de fosfato dos veces durante 15 minutos cada vez a 65 grados centígrados con rotación.Use pinzas para quitar la membrana del tubo de hibridación y coloque la membrana en un protector de funda de plástico abierto. Cubra y exponga a una placa de imagen. Si es necesario, extraiga y vuelva a probar la mancha con una sonda diferente.Para pelar, cubra la membrana con 25 mililitros de una solución de formamida 2XSSPE al 50 por ciento e incube a 65 grados centígrados durante dos horas. Vierta la solución en un contenedor de desechos radiactivos. Agregue la solución de lavado fosfato STS dos al tubo de hibridación y gire a 65 grados centígrados durante 15 minutos.Verifique la membrana con un contador Geiger para confirmar la ausencia de señal antes de realizar la prehibridación e hibridación como se demostró anteriormente. Estas imágenes en gel tienen ADN genómico de levadura tratado con o sin hidróxido de potasio y muestran que las células que carecen de RNH2 retienen más ribonucleótidos en el genoma. La variante M644L de la polimerasa dos reduce la capacidad de incorporar ribonucleótidos, mientras que el mutante M644G incorpora más ribonucleótidos que la polimerasa de tipo salvaje.Un gel alcalino de agarosa se puede probar más a fondo mediante el análisis de Southern blot específico de la hebra. En este ejemplo, las sondas recocen a la incipiente hebra de ADN principal dentro del gen reportero URA3 que se ha insertado cerca de ARS306 en dos orientaciones opuestas. Los resultados representativos de la transferencia del sur utilizando las sondas específicas de hebra principal naciente muestran un patrón de fragmentación del ADN causado por la escisión alcalina en los ribonucleótidos y el ADN de la hebra principal naciente en una cepa de tipo salvaje y en cepas que expresan las variantes de polimerasas alfa, delta y épsilon que son promiscuas para la incorporación de ribonucleótidos.Este gráfico muestra la cuantificación de la señal radiactiva por fracción del total en cada carril desde el southern blot. Al intentar el procedimiento, es importante recordar que siempre se debe utilizar ADN recién aislado de células de cara cerrada. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la reparación del ADN cuantificaran la densidad y la hebra en la que los ribonucleótidos han sido incorporados por las ADN polimerasas replicativas.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación final hidrolacada o HydEn-seq, para responder a preguntas adicionales como la ubicación de los ribonucleótidos en el genoma. No olvide que trabajar con materiales radiactivos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones para evitar la contaminación del banco de trabajo y el equipo mientras se realiza este procedimiento.

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Biología

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Aprenda a detectar ribonucleótidos en el genoma de levadura mediante electroforesis en gel alcalino y Southern blot específico de cadena. Este método cuantifica la incorporación mutagénica de ribonucleótidos en ADN replicativo.

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Estudio incorporación de ribonucleótido: Filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido

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