Estudio incorporación de ribonucleótido: Filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido
26 de julio de 2018
Ribonucleótidos están entre los nucleótidos no canónico más abundantes incorporados en el genoma durante la replicación del ADN nuclear eucariótica. Si no quitado, ribonucleótidos pueden causar mutagénesis y daño de la DNA. Presentamos dos enfoques experimentales que se utilizan para evaluar la abundancia de incorporación ribonucleótido en ADN y sus efectos mutagénicos.
Este método puede ayudar a responder preguntas como cuántos ribonucleótidos se incorporan en el ADN de hebra naciente, principal y rezagado en el genoma. Aunque este método puede proporcionar información cuantitativa y cualitativa sobre la densidad de ribonucleótidos en el genoma de la levadura, también se puede aplicar a otros sistemas, como los genomas de los mamíferos. La electroforesis en gel alcalino proporciona una visión semicuantitativa de la incorporación de ribonucleótidos en todo el genoma y la transferencia sur específica de la cadena permite una mayor sensibilidad y cuantificación en un locus genómico específico.
Para comenzar este procedimiento, agregue seis microlitros de hidróxido de potasio molar a cada muestra de ADN genómico de levadura recién preparado e incube a 55 grados centígrados durante dos horas. Después de dos horas, incube las muestras en hielo durante cinco minutos. A continuación, añada a cada muestra cuatro microlitros de tampón de carga de ADN alcalino 6-6.
Funda un gel alcalino compuesto por un uno por ciento de agarosa, 50 milimolares de hidróxido de sodio y un milimolar EDTA pH ocho con un peine que permite cargar 24 microlitros de muestra de ADN por carril. Gire brevemente los tubos de las muestras. Cargue los 24 microlitros completos de cada muestra en el gel alcalino de agarosa.
Incluya un marcador de tamaño de ADN apropiado. Electroforese a 30 voltios durante 30 minutos. Luego baje el voltaje a 10 voltios y electroforese durante 18 a 20 horas.
Al día siguiente, neutraliza el gel. Sumerja el gel en el tampón de neutralización uno e incube a temperatura ambiente con una agitación suave durante 45 minutos. Reemplace la mezcla de tampón de neutralización con tampón nuevo.
E incubar durante otros 45 minutos. Para teñir el ADN, remoje el gel neutralizado en 200 mililitros de agua que contenga una dilución de uno a 10000 de tinte de oro sybr a temperatura ambiente con una agitación suave durante dos horas. Visualiza el ADN usando un transiluminador UV.
El ADN del gel alcalino se transferirá a una membrana de nailon cargada positivamente por acción capilar. Primero remoje el gel alcalino a temperatura ambiente durante 15 minutos en tampón de transferencia alcalino. A continuación, humedezca brevemente la membrana de nailon con agua y sumérjala en un tampón de transferencia alcalina durante cinco minutos.
Configure la plataforma de transferencia invirtiendo tres vasos de vidrio de 100 mililitros en una fuente para hornear de vidrio que sea un poco más grande que el tamaño del gel de agarosa. Coloque un plato de vidrio encima de los vasos de precipitados de vidrio. Coloque dos trozos grandes de papel de cromatografía MMCHR sobre la placa de vidrio.
Vierta el tampón de transferencia alcalina sobre el papel de cromatografía y llene el plato de vidrio hasta la mitad. Alise las burbujas con una pipeta de vidrio de cinco mililitros. Coloca el gel de agarosa encima.
De nuevo, alisando las burbujas. Rodea todos los bordes del gel con parafilm. Vierta una pequeña cantidad de tampón de transferencia alcalina sobre el gel.
Coloque la membrana de nailon previamente empapada encima del gel y alise las burbujas. Pon dos trozos de papel de cromatografía cortados a la medida del gel de agarosa. Colócalos encima de la membrana y alisa las burbujas.
Coloque una pila grande de toallas de papel encima del sándwich de transferencia y coloque con cuidado un plato de vidrio encima de las toallas de papel. Agregue un objeto pesado en la parte superior y deje que la transferencia continúe a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, desmonte con cuidado la pila de transferencias.
Remoje la membrana a temperatura ambiente en el tampón de neutralización dos durante 15 minutos. Reticulación del ADN a la membrana de nailon cargada mediante un reticulante UV. Utilice la configuración de enlace cruzado automático.
Antes de comenzar el procedimiento de hibridación, prepare la sonda radiomarcada como se describe en el protocolo de texto. Enrolle la membrana humedecida en un tubo de hibridación y agregue 25 mililitros de tampón de hibridación recién preparado. Incubar a 65 grados centígrados con rotación en un horno de hibridación durante una o dos horas.
Vierta con cuidado la solución y agregue 25 mililitros de tampón de hibridación más la sonda. Incubar a 65 grados centígrados durante 16 a 18 horas con rotación. A continuación, vierta la solución en un contenedor de residuos radiactivos.
Agregue la solución de lavado fosfato STS uno al tubo de hibridación y gire a temperatura ambiente durante cinco minutos. De esta manera, realice cinco lavados de cinco minutos cada uno con solución de lavado fosfato STS uno. Después del quinto lavado con solución de lavado STS de fosfato, se lava la membrana dos veces con solución de lavado STS de fosfato dos veces durante 15 minutos cada vez a 65 grados centígrados con rotación.
Use pinzas para quitar la membrana del tubo de hibridación y coloque la membrana en un protector de funda de plástico abierto. Cubra y exponga a una placa de imagen. Si es necesario, extraiga y vuelva a probar la mancha con una sonda diferente.
Para pelar, cubra la membrana con 25 mililitros de una solución de formamida 2XSSPE al 50 por ciento e incube a 65 grados centígrados durante dos horas. Vierta la solución en un contenedor de desechos radiactivos. Agregue la solución de lavado fosfato STS dos al tubo de hibridación y gire a 65 grados centígrados durante 15 minutos.
Verifique la membrana con un contador Geiger para confirmar la ausencia de señal antes de realizar la prehibridación e hibridación como se demostró anteriormente. Estas imágenes en gel tienen ADN genómico de levadura tratado con o sin hidróxido de potasio y muestran que las células que carecen de RNH2 retienen más ribonucleótidos en el genoma. La variante M644L de la polimerasa dos reduce la capacidad de incorporar ribonucleótidos, mientras que el mutante M644G incorpora más ribonucleótidos que la polimerasa de tipo salvaje.
Un gel alcalino de agarosa se puede probar más a fondo mediante el análisis de Southern blot específico de la hebra. En este ejemplo, las sondas recocen a la incipiente hebra de ADN principal dentro del gen reportero URA3 que se ha insertado cerca de ARS306 en dos orientaciones opuestas. Los resultados representativos de la transferencia del sur utilizando las sondas específicas de hebra principal naciente muestran un patrón de fragmentación del ADN causado por la escisión alcalina en los ribonucleótidos y el ADN de la hebra principal naciente en una cepa de tipo salvaje y en cepas que expresan las variantes de polimerasas alfa, delta y épsilon que son promiscuas para la incorporación de ribonucleótidos.
Este gráfico muestra la cuantificación de la señal radiactiva por fracción del total en cada carril desde el southern blot. Al intentar el procedimiento, es importante recordar que siempre se debe utilizar ADN recién aislado de células de cara cerrada. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la reparación del ADN cuantificaran la densidad y la hebra en la que los ribonucleótidos han sido incorporados por las ADN polimerasas replicativas.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación final hidrolacada o HydEn-seq, para responder a preguntas adicionales como la ubicación de los ribonucleótidos en el genoma. No olvide que trabajar con materiales radiactivos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones para evitar la contaminación del banco de trabajo y el equipo mientras se realiza este procedimiento.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este estudio presenta enfoques experimentales para evaluar la incorporación de ribonucleótidos en el ADN durante la replicación del ADN nuclear eucariota. Destaca los posibles efectos mutagénicos de los ribonucleótidos si no se eliminan adecuadamente.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Replicación del ADN
- Estabilidad genómica
- Mutagénesis
Antecedentes
- Los ribonucleótidos son nucleótidos no canónicos presentes en el ADN.
- Pueden provocar daño en el ADN si no se eliminan.
- Comprender su incorporación es fundamental para la integridad genómica.
- Se necesitan métodos para cuantificar la incorporación de ribonucleótidos.
Objetivo del estudio
- Cuantificar la incorporación de ribonucleótidos en el ADN.
- Evaluar los efectos mutagénicos de los ribonucleótidos.
- Desarrollar métodos aplicables a diversos sistemas genómicos.
Métodos Utilizados
- Electroforesis en gel alcalino para análisis semicuantitativo.
- Transferencia Southern específica de cadena para cuantificación sensible.
- Uso de tratamiento con hidróxido de potasio para muestras de ADN.
- Incubación a temperaturas controladas para obtener resultados óptimos.
Resultados principales
- Datos cuantitativos sobre la incorporación de ribonucleótidos en el ADN de levadura.
- Comparación de la incorporación en las hebras conductora y rezagada.
- Información sobre el potencial mutagénico de los ribonucleótidos.
- Aplicabilidad de los métodos a genomas de mamíferos.
Conclusiones
- Los ribonucleótidos representan un riesgo para la estabilidad genómica.
- Los métodos desarrollados son efectivos para cuantificar la incorporación.
- Los hallazgos tienen implicaciones para comprender los mecanismos de daño del ADN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La incorporación de ribonucleótidos en el ADN genómico representa una fuente de inestabilidad que puede dificultar la validación de objetivos y la identificación de fármacos en el descubrimiento de medicamentos. La cuantificación de esta incorporación permite reducir riesgos mecanicistas al aclarar las fuentes de mutagénesis espontánea que podrían oscurecer las relaciones fenotipo-genotipo en modelos preclínicos. Esta capacidad refuerza la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al distinguir señales terapéuticas reales de artefactos derivados del daño al ADN.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Investiga si los fenotipos observados se deben a la modulación del objetivo previsto o al daño en el ADN inducido por ribonucleótidos.
- Valor operativo: Proporciona una cuantificación específica de la cadena para reducir los riesgos asociados a las hipótesis sobre la función génica en sistemas de cribado basados en levaduras.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Permite la preparación de cepas isogénicas de levadura con niveles definidos de ribonucleótidos para obtener fondos consistentes en los ensayos.
- Valor operativo: Estandariza el control de calidad del ADN genómico para reducir la variabilidad en los ensayos de fluctuación y en la validación de genes reporteros.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mide las tasas de mutagénesis inducida por ribonucleótidos para evaluar la estabilidad genética de sistemas relevantes para enfermedades durante cultivos prolongados.
- Valor operativo: Facilita el monitoreo longitudinal de la integridad genómica en modelos preclínicos utilizados para la optimización de fármacos líderes.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que la validación del blanco requiere fondos genéticos limpios, particularmente al utilizar modelos de levadura para la interrogación de vías o cribado fenotípico.
- Biología del Descubrimiento: Aclara si la incorporación de ribonucleótidos contribuye a la mutagénesis de fondo en los ensayos de fluctuación utilizados para la validación de objetivos.
- Selección: Garantiza la consistencia de los reactivos mediante la calificación de muestras de ADN empleadas en la validación por blot sur del sur de construcciones genéticas.
- Análisis: Genera datos cuantitativos específicos de cadena que permiten la comparación de variantes de polimerasa o de fondos genéticos en campañas de identificación de candidatos iniciales.
- Investigación Traducional: Rastrea métricas de estabilidad genómica que informan el avance ajustado al riesgo desde las etapas de descubrimiento hasta la optimización.
- Reutilización Empresarial: Establece un punto de control de calidad reutilizable para la integridad del ADN genómico en múltiples plataformas de descubrimiento basadas en levaduras.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al cuantificar una fuente conocida de mutagénesis espontánea en cribados genéticos.
- Valor operativo: Introduce una normalización en la preparación de muestras de ADN que mejora la reproducibilidad entre ensayos de fluctuación y transferencias Southern.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en las decisiones de avance o interrupción al controlar los factores de confusión por daño del ADN en los datos de validación del blanco.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al identificar modelos con niveles elevados de ribonucleótidos que podrían requerir estrategias de mitigación.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en el manejo de ácidos nucleicos, técnicas con sondas radiactivas e hibridación mediante Southern blot.
- Equipos de electroforesis en gel alcalino, cruzador UV y fosfoimagenador para la detección de señales.
- Protocolos estandarizados para el tratamiento con hidróxido de potasio, neutralización y transferencia a membrana, para garantizar la consistencia entre laboratorios.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la optimización del diseño de la sonda para diferentes loci genómicos y el ajuste de los tiempos de hidrólisis según la calidad variable de las muestras de ADN.
- Las limitaciones prácticas incluyen el carácter semi-cuantitativo de los geles alcalinos sin Southern blot, así como los riesgos asociados con los materiales radiactivos, que requieren manejo especial de desechos.
