El uso de esplenocitos de ratón para evaluar la influencia de patrón Molecular asociado a patógenos en la expresión de genes reloj

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología y la cronobiología, como la forma en que los componentes microbianos alteran el reloj molecular. Las principales ventajas de esta técnica son que es fácil de realizar, se evalúan los efectos de diferentes componentes microbianos en el reloj molecular y es altamente reproducible. Para comenzar el protocolo, prepare el medio de cultivo agregando suero fetal bovino a RPMI 1640 hasta una concentración final del 10%Prepare 10 mililitros de medio de desafío para cada uno de los PAMPS que se probarán en tubos de 50 mililitros agregando el medio de cultivo PAMP enumerado.

Rocíe una trompa de ratón previamente preparada con etanol al 70% y límpiela con una toalla de papel. Coloque el mouse boca arriba, ligeramente inclinado hacia su lado derecho. A continuación, corta el pelaje con unas tijeras de disección a lo largo del lado izquierdo del ratón, aproximadamente a mitad de camino entre las patas delanteras y traseras.

Con fórceps, agarre el peritoneo y haga una incisión con cuidado sin dañar el bazo. Retire el bazo con pinzas y colóquelo en un tubo estéril de 50 mililitros que contenga aproximadamente 10 mililitros de medio de cultivo en hielo. Luego transfiera el bazo con dos mililitros de medio de cultivo a una placa de Petri pequeña y estéril.

Homogeneice el bazo moliéndolo entre la parte esmerilada de dos portaobjetos esmerilados estériles. Una vez homogeneizados completamente, pipetear los dos mililitros de medio de cultivo que contienen los esplenocitos a través de un colador de células de nylon de 40 micras en un tubo de 50 mililitros. Agregue ocho mililitros de medio de cultivo en frío a cada uno de los tubos de 50 mililitros que contienen los esplenocitos, para un volumen total de 10 mililitros por tubo.

Determine el número de células por mililitro usando un hemocitómetro. Agregue aproximadamente una vez 10 a la sexta celda por pocillo a placas de cultivo de seis pocillos. Después de agregar las células, agregue tres mililitros de medio de cultivo o tres mililitros de medio de desafío a las células.

A continuación, incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres horas. Raspe las células del fondo del pocillo con una punta de pipeta de 1.000 microlitros conectada a una micropipeta P1000. Con la misma punta de pipeta, transfiera el medio que contiene las células a un tubo de 15 mililitros.

Granule las células a 167 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y lave el pellet celular con cinco mililitros de PBS. Después de peletizar las células por segunda vez a 167 veces g durante cinco minutos, retire el sobrenadante y agregue 600 microlitros de tampón de lisis al pellet de la celda.

Aísle el ARN de los esplenocitos utilizando el kit de extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y realice la digestión opcional del ADN en columna. Sintetice el ADNc para cada una de las muestras utilizando el kit de transcripción inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice 10 microlitros de ARN para cada una de las muestras en un volumen total de reacción de 20 microlitros.

Extraiga el ARNm de unas pocas muestras de control en un tubo de 0,5 mililitros para preparar el ADNc que se utilizará para la curva estándar al realizar una PCR cuantitativa. Agregue 10 microlitros de mezcla maestra de transcriptasa inversa 2X. Al finalizar la transcripción inversa, agregue 10 microlitros de agua al tubo de reacción, que sirve como concentración inicial en la serie de dilución para la curva estándar.

Realice una serie de diluciones de diez veces agregando 45 microlitros de agua en cuatro tubos de 0,5 mililitros designados 10 a menos uno, 10 a menos dos, 10 a menos tres y 10 a menos cuatro. Agregue cinco microlitros de la concentración inicial uno en el segundo tubo, 10 en el menos uno, usando un micropipeteador P20. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces, luego transfiera cinco microlitros del tubo de 10 al tubo menos uno al tubo designado 10 al tubo menos dos y mezcle.

Transfiera cinco microlitros con una micropipeta P20 del tubo de 10 a menos dos al tubo designado de 10 a menos tres y mezcle. Finalmente, transfiera cinco microlitros usando un micropipeteador P20 del tubo 10 al tubo menos tres al tubo designado 10 al menos cuatro y mezcle. Prepare la reacción de modo que contenga 0,5 microlitros del ensayo de sonda de cebador, cinco microlitros de mezcla maestra de expresión génica, dos microlitros de agua y 2,5 microlitros de ADNc.

Pipetee las muestras de ARN en una placa qPCR de 96 pocillos. Incube ensayos de sonda de cebador para varios genes de reloj molecular e incluya un ensayo para un control endógeno, y cárguelo en una máquina de qPCR para determinar la cuantificación relativa de los niveles de ARNm. Dentro de la configuración experimental, seleccione cuantificación, curva estándar relativa y química TaqMan.

A continuación, cambie el volumen de reacción a 10 microlitros. Introduzca la información relevante en el diseño de la placa. La qPCR se realizó en ARN aislado para evaluar los niveles relativos de expresión de los genes reloj molecular, clock, Per2, Dbp y Rev-erb alfa.

Después del desafío con PAMP, los niveles de expresión del reloj no fueron significativamente diferentes en comparación con las células de control. Los niveles de expresión de Per2 se elevaron significativamente en las células desafiadas con LPS y ODN1826 en comparación con los controles no desafiados. LPS fue el único PAMP que alteró la expresión alfa de Rev-erb, ya que los niveles de ARNm fueron significativamente más bajos que en los controles no desafiados.

Se observaron niveles de ARNm significativamente más bajos para Dbp después del desafío con cada uno de los PAMP en comparación con los controles. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar moléculas distintas de las PAMPs para evaluar su influencia en el reloj molecular de los esplenocitos.