Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biomédico. Como el uso del pez cebra para generar modelos genéticos de enfermedades. La principal ventaja de esta técnica es que permite la identificación precoz de genotipos mediante un método sencillo y de alto rendimiento.

Aunque este método puede permitir una investigación exhaustiva utilizando modelos de epilepsias genéticas de pez cebra, también se puede aplicar a otros modelos de enfermedades genéticas y a cualquier tipo de estudio de mutación. Generalmente, los individuos nuevos en este método pueden tener dificultades ya que la transección de la aleta larvaria debe realizarse con precisión dentro del espacio pigmentario de la cola. Antes de comenzar el corte de las aletas de las larvas de pez cebra, prepare la superficie de disección.

Pegue un trozo de cinta de autoclave a través de la superficie interior de la tapa de una placa de Petri de nueve centímetros y coloque la tapa debajo de un microscopio estereoscópico. Prepare una punta de pipeta P1000 para acomodar una larva de tres dpf con un estrés mínimo, cortando el extremo de la punta de la pipeta hasta un diámetro de dos milímetros. Coloque de tres a cinco días después de la fertilización, o dpf, las larvas de pez cebra en una placa de Petri y anestesiar en tricaína de 1,5 milimolar en medio embrionario 1x E3.

Con la micropipeta P1000 modificada, recoja y anestesie la larva de pez cebra y colóquela en la cinta de autoclave colocada en la tapa de la placa de Petri. Retire el exceso de solución de tricaína que rodea a la larva. El área debe estar lo más seca posible para seccionar y recoger con éxito la aleta, pero aún húmeda para garantizar la supervivencia.

Para evitar el sangrado y asegurar la supervivencia de la larva durante el corte de las aletas, la transección debe ocurrir dentro del espacio de pigmento. Distal al límite de la circulación sanguínea, como se indica en esta imagen. Trabajando bajo un microscopio estereoscópico, use un microbisturí para seccionar la aleta caudal.

Durante la incisión, aplique una presión constante pero suave hacia abajo para evitar dañar la notocorda. Visualice la aleta seccionada bajo el microscopio y coloque la pieza encima de la punta de la hoja del microbisturí. Coloque el microbisturí que contiene la aleta sobre la superficie de un pequeño trozo de papel de filtro.

Debido a la presencia de melanocitos en el tejido seccionado, la aleta aparece como una pequeña mancha negra. Para asegurar el éxito de la extracción del ADN, es importante que se observe en el papel de filtro un punto negro que marca la colocación de la aleta antes de continuar con el protocolo. Con unas tijeras y pinzas, transfiera el papel de filtro que contiene la aleta a un pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos que contiene 25 microlitros de una solución de hidróxido de sodio de 50 milimolares.

A continuación, prepare una placa de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos, numerando los pocillos según la etiqueta de la placa de PCR. Con la pipeta P1000 modificada, llena con 200 microlitros de medio para embriones e3 frescos, recoja cuidadosamente la larva de pez cebra con una presión suave. Dispense la larva en la placa de 96 pocillos con el mismo número de pocillo que la placa de PCR.

Asegúrese de que el papel de filtro que contiene la aleta esté bien sumergido en la solución. Para evitar la contaminación cruzada entre cada corte, limpie la hoja del microbisturí y las pinzas sumergiéndolas en una solución de etanol al 70%. Limpie la cuchilla con un pañuelo de papel limpio o una toallita.

Cuando se hayan cortado todas las larvas, almacene las larvas en la placa de 96 pocillos a 28 grados centígrados hasta que se hayan identificado sus genotipos. Comience este procedimiento sellando la placa de PCR de 96 pocillos que contiene las piezas de aleta y centrifugando las muestras a 1000 veces G durante un minuto. Para asegurarse de que todos los papeles de filtro estén sumergidos en la solución de hidróxido de sodio.

Para la lisis de tejidos, caliente las muestras en un termociclador a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Seguido de enfriamiento a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, agregue seis microlitros de 500 milimolares de tris-HCL pH8.0 a cada muestra.

Vórtice las muestras. Centrifugar brevemente la placa a 1500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Para extraer ADN genómico usando este método, corte la aleta como se demostró anteriormente, pero agregue el papel de filtro con la aleta recortada a un pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos que contiene 30 microlitros de resina quelante al 5%.

Después de que se hayan cortado todas las piezas de aletas, selle la placa de PCR de 96 pocillos y centrifugue brevemente las muestras para asegurarse de que todos los papeles de filtro estén sumergidos con la resina quelante. Caliente las muestras en un termociclador a 95 grados Celsius durante 15 minutos, seguido de un enfriamiento a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Centrifugar brevemente las muestras para pellet las perlas de resina y obtener el ADN de la suspensión.

Un ensayo de PCR múltiple permitirá discriminar entre mutantes homocigotos, heterocigotos y larvas de tipo salvaje. Configure la reacción de PCR como se detalla en el protocolo de texto. Realice las reacciones de PCR en un termociclador de 96 pocillos.

Prepare un gel de agarosa al 1% en tampón de borato de sodio, teñido con 1x gel rojo. Para facilitar el proceso, si es posible, utilice un sistema de gel que sea compatible con pipetas multicanal para permitir una mayor capacidad de rendimiento al reducir el tiempo de carga de las muestras. Ejecute el gel en 1 tampón de borato de sodio a 250 voltios durante 15 minutos.

Visualice el gel bajo luz ultravioleta para permitir la discriminación de los diferentes genotipos. Comience este ensayo preparando dos geles de poliacrilamida al 12% utilizando la placa espaciadora de 1,5 milímetros y los 15 peines de muestra como se describe en el protocolo de texto. Utilice un sistema de electroforesis vertical y 1x tampón TBE como tampón de ejecución.

Después de realizar la PCR como se describe en el protocolo de texto, caliente los productos de PCR a 94 grados centígrados durante cinco minutos, seguido de un enfriamiento a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Cargue 10 microlitros por muestra de PCR y ocho microlitros de marcador de peso molecular. Haga funcionar el gel a 150 voltios durante una hora, o hasta que el marcador de peso molecular casi alcance la línea del pie de la placa de vidrio.

Visualice el gel bajo luz ultravioleta para permitir la discriminación de los diferentes genotipos. Este protocolo se utilizó para el genotipado de la descendencia de un cruzamiento heterocigótico, en el que el ileal mutante tiene una inserción de 5 pares de bases en el primer exón de recubrimiento del gen aldh7a1. El resultado esperado de la amplificación por PCR de los ileales de tipo salvaje y mutantes es un amplicón de 434 BP.

Una banda de 293 BP surge de la amplificación del ileal mutante, y se obtiene una banda de 195 BP para el ileal de tipo salvaje. El análisis de las reacciones de PCR en un gel de borato de sodio con agarosa al 1% identificó genotipos de tipo salvaje en los carriles dos y seis, genotipos heterocigotos en los carriles tres, cuatro y cinco, y un genotipo mutante homocigótico en el carril uno. Varias mutaciones fueron genotipadas por un ensayo de fusión heterodúplex.

Los ileales mutantes plpbpot101 y plpbpot102 del gen plpbp dan lugar a un cambio de marco y a un codón de parada temprana. Después de la desnaturalización y el recocido, los fragmentos de PCR para animales heterocigotos contendrían ADN heterodúplex y homodúplex que se separan y visualizan fácilmente mediante electróforos en gel de poliacrilamida. Se identificaron genotipos mutantes heterocigotos compuestos en los carriles dos, cuatro y ocho, genotipos heterocigotos en los carriles tres, seis, siete, nueve y diez, y un genotipo de tipo salvaje en el carril cinco.

Una vez dominado, el corte de aletas de 96 larvas con esta técnica se puede realizar en menos de una hora, si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la agrupación de larvas de pez cebra del mismo genotipo para la extracción de tejidos, y ordenarlos para responder preguntas adicionales, como la investigación de biomarcadores y modelos de enfermedades. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo de los modelos de epilepsia metabólica para explorar la fisiología de la ruta de la enfermedad en el pez cebra.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo genotipar correctamente larvas de pez cebra de tres días de edad mediante la microdisección de una aleta caudal.