Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón
5 de septiembre de 2018
Aquí describimos un procedimiento para tejido claro etiquetado fluorescente y a gran escala imagen de tejido de cerebro de ratón que, por lo tanto, permite la visualización de la organización tridimensional de tipos celulares en el neocortex.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como el análisis de la estructura y la función del neocórtex. La principal ventaja de esta técnica es que puede revelar la estructura tridimensional a gran escala en el cerebro. Aunque este método puede proporcionar información sobre el neocórtex, también se puede aplicar a otros sistemas nerviosos, como la médula espinal.
Para inyectar el marcador en la protuberancia de los ratones adultos, primero extraiga un microlitro de la subunidad B de la toxina del cólera marcada con fluorescencia en una jeringa Hamilton de calibre 26. Coloque una bomba inyectora en la jeringa, luego coloque la jeringa y la bomba en el portaherramientas de un manipulador en un instrumento estereotáxico. Incline el manipulador 12 grados con respecto al eje vertical.
A continuación, coloque el ratón sobre el instrumento estereotáxico. Con una cuchilla de afeitar, retira su vello para evitar infecciones. A continuación, corta 10 milímetros del cuero cabelludo para que se vean el bregma y la lambda.
Administrar 0,1 mililitros de lidocaína al 1% con una pipeta. Establezca el ángulo de la cabeza ajustando la posición vertical de la boquilla en el instrumento estereotáxico para que el bregma y la lambda tengan el mismo nivel Z. A continuación, ajuste la posición del manipulador deslizándolo sobre el instrumento estereotáxico de modo que la punta de la jeringa quede cerca del bregma.
Registre la posición del manipulador. Retraiga la jeringa moviendo el portaherramientas del manipulador. A continuación, mueva el manipulador 5,4 milímetros hacia atrás y 0,4 milímetros lateralmente.
Avance la jeringa de modo que la punta quede cerca del punto de entrada en el cráneo, luego retraiga la jeringa y marque el punto de entrada. En la posición marcada, perfore un orificio con un diámetro de aproximadamente un milímetro. Inserte la punta de la jeringa a través del orificio de modo que la profundidad de la punta sea 6,9 milímetros mayor que la medida en el bregma.
A continuación, inyecte un microlitro de trazadores con la bomba a 0,2 microlitros por minuto. Después de la inyección, retire la jeringa del cerebro. Si es necesario, cubra el cerebro expuesto con pequeños fragmentos de hemostático microfibrilar y adhesivo instantáneo.
Limpie el cerebro expuesto con solución salina para prevenir infecciones y suturar el cuero cabelludo. A continuación, retire el ratón del instrumento estereotáxico. Deje que el ratón se recupere de la anestesia en una incubadora a 30 grados centígrados durante aproximadamente una hora.
No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Regrese el ratón a la compañía de otros animales después de que se haya recuperado por completo. Para recolectar el tejido cerebral, corte el cuero cabelludo con unas tijeras para exponer el cráneo.
A continuación, corta la línea media del cráneo expuesto con unas tijeras. Luego, extirpa el cráneo con fórceps. Si es necesario marcar la posición del bregma y la lambda, primero retire un lado del cráneo.
A continuación, inserte finas agujas de tungsteno en el cerebro en las posiciones del bregma y la lambda, y luego extraiga el cráneo restante. Posteriormente, coloque la muestra de cerebro en la plataforma de vibratome. Corte las secciones de hasta 500 micrómetros de grosor en PBS a temperatura ambiente.
En este procedimiento, transfiera las rodajas a un tubo de plástico de cinco mililitros que contenga cuatro mililitros de solución de Scale S0. Luego incubarlos durante 12 horas con una suave agitación a 37 grados centígrados. Después de 12 horas, retire la solución del tubo con una pipeta y agregue cuatro mililitros de solución Scale A2.
Incubar las rodajas durante 36 horas agitando suavemente a 37 grados centígrados. Después de 36 horas, retire la solución del tubo y agregue cuatro mililitros de solución Scale B4. Incubar las rodajas durante 24 horas agitando suavemente a 37 grados centígrados.
Después de 24 horas, retire la solución del tubo y agregue cuatro mililitros de solución Scale A2. Incubar las rodajas durante 12 horas agitando suavemente a 37 grados centígrados. Después de 12 horas, retire la solución del tubo y agregue cuatro mililitros de PBS.
Incubar las rodajas durante seis horas agitando suavemente a temperatura ambiente. Posteriormente, retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de dos mililitros. Incubarlos con un anticuerpo primario en un mililitro de solución AB Scale durante 48 a 72 horas a 37 grados centígrados con una agitación suave.
Luego, retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de cinco mililitros. Incubarlos en cuatro mililitros de solución AB Scale durante dos horas, dos veces a temperatura ambiente con una suave agitación. Luego, retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de dos mililitros.
Incubar con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia en un mililitro de solución AB Scale durante 48 horas a 37 grados centígrados con una agitación suave. Retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de cinco mililitros que contenga cuatro mililitros de la solución de anticuerpo Scale e incube las rodajas durante seis horas agitándolas suavemente a temperatura ambiente. Retire la solución y agregue cuatro mililitros de la solución AB Scale e incube las rodajas durante dos horas dos veces con una suave agitación a temperatura ambiente.
A continuación, retira la solución y añade cuatro mililitros de PFA al 4% e incuba las rodajas durante una hora agitando suavemente a temperatura ambiente. A continuación, retira la solución y añade cuatro mililitros de PBS e incuba las rodajas durante una hora agitando suavemente a temperatura ambiente. Retire la solución y agregue cuatro mililitros de la solución Scale S4 e incube las rodajas durante 12 horas agitando suavemente a 37 grados centígrados.
Posteriormente, coloque el espaciador en un portaobjetos de vidrio y coloque las rodajas en el espaciador y sumerja las rodajas en la solución Scale S4. Selle el espaciador con un cubreobjetos. Ponga un poco de agua en el cubreobjetos y obtenga imágenes de las rodajas utilizando microscopía confocal o de dos fotones con un objetivo de inmersión en agua a larga distancia de trabajo.
En este estudio, las neuronas de proyección cortical se marcaron en verde mediante la expresión de tdTomato en ratones transgénicos Tlx3-cre AI9 y las neuronas de proyección subcerebral en magenta se visualizaron inyectando el trazador retrógrado CTB488 en la protuberancia a las siete semanas de edad. Esta es la vista superior para mostrar las posiciones aproximadas de las áreas corticales. Aquí están las vistas oblicuas de la fluorescencia CTB488 que muestra las neuronas de proyección subcerebral y la fluorescencia de tdTomato que muestra las neuronas de proyección cortical y esta es la imagen fusionada.
Los cuerpos celulares de los dos tipos de células eran visibles en una amplia gama de áreas cerebrales y las secciones ópticas mostraban microcolumnas periódicas. Esta imagen muestra los cuerpos celulares y las dendritas apicales de las neuronas de proyección subcerebral que expresan eGFP en la sección óptica de un ratón Crym-eGFP y esta imagen muestra las células que expresan parvalbúmina marcadas en verde y las neuronas de proyección subcerebral marcadas en magenta inyectando CTB488 en la protuberancia de un ratón C57 Black 6 mediante el método de escala de anticuerpos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el procesamiento de imágenes en 3D, para responder a preguntas adicionales como la caracterización cuantitativa de la organización cerebral.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología cortical exploraran una nueva organización modular en el cerebro del ratón.
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Descripción general
Este estudio describe un protocolo detallado para la clarificación de tejidos, la marcación fluorescente y la obtención de imágenes a gran escala de tejido cerebral de ratón. La metodología permite a los investigadores visualizar la organización tridimensional de los tipos celulares en la neocorteza, proporcionando información valiosa sobre su estructura y función.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Imagen de tejidos
- Etiquetado fluorescente
Antecedentes
- La estructura y función de la neocorteza son fundamentales en neurociencia.
- Comprender la organización celular puede ayudar a abordar preguntas clave de investigación.
- Esta técnica puede extenderse a otras regiones del sistema nervioso, como la médula espinal.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una metodología para la visualización mejorada de estructuras cerebrales.
- Investigar la organización de los tipos celulares dentro de la neocorteza.
- Proporcionar un marco aplicable a estudios más amplios del sistema nervioso.
Métodos Utilizados
- Imagenología a gran escala mediante microscopía confocal o de dos fotones.
- El modelo utilizado incluye ratones adultos y regiones cerebrales específicas como la protuberancia.
- El protocolo detalla los pasos procedimentales para la inyección del trazador y la preparación del tejido.
- La incubación en soluciones como Scale S0, A2, B4 y el uso de anticuerpos fluorescentes fueron pasos fundamentales.
Resultados Principales
- El método revela estructuras tridimensionales a gran escala en tejido cerebral de ratón.
- Se logró la marcación específica de neuronas corticales de proyección y otros tipos celulares.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método robusto para visualizar la organización neuronal.
- Los hallazgos contribuyen de manera significativa a la comprensión de la estructura neocortical y su función.
- La metodología puede adaptarse para diversas aplicaciones en la investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la arquitectura celular tridimensional de tejidos complejos como la neocorteza permite la validación de objetivos al revelar la organización espacialmente resuelta de subtipos neuronales. Esta comprensión mecanicista posibilita reducir los riesgos de las hipótesis terapéuticas mediante la visualización directa del acoplamiento al objetivo y de la organización a nivel de red en sistemas relevantes para la enfermedad. El método proporciona confianza predictiva en modelos preclínicos al vincular la organización anatómica con lecturas funcionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la cartografía de la organización microcolumnar específica por tipo celular en la neocorteza.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la visualización directa de subtipos neuronales y sus relaciones espaciales.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en el blanco al resolver módulos funcionales periódicos relevantes para los efectos de fármacos a nivel de red.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la estandarización de ensayos posteriores mediante la preservación de la arquitectura tisular tridimensional.
- Valor operativo: Permite flujos de trabajo de imagen reproducibles mediante protocolos estandarizados de aclarado y marcado tisular.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en diferentes regiones cerebrales y tejidos complejos mediante escaneo con etapa motorizada y objetivos de larga distancia de trabajo.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las perspectivas obtenidas en la etapa de descubrimiento con la validación preclínica mediante la modelización de sistemas relevantes para la enfermedad.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la visualización del acoplamiento al blanco en redes neuronales distribuidas.
- Alineación de Biomarcadores: Permite correlacionar fenotipos estructurales con resultados funcionales para el desarrollo de biomarcadores traslacionales.
Integración de la Secuencia de Trabajo y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la prueba de hipótesis del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, al proporcionar datos anatómicos cuantitativos con resolución espacial.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al resolver la organización específica por tipo celular en tejido intacto.
- Selección: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante la preparación reproducible de tejidos y lecturas cuantitativas de fluorescencia.
- Análisis: Permite el análisis comparativo mediante imágenes tridimensionales y conteo celular a través de diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al preservar la arquitectura del tejido relevante para la enfermedad en estudios longitudinales.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma de imágenes reutilizable aplicable a múltiples regiones cerebrales y tejidos complejos más allá de la neocorteza.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la visualización directa de la organización neuronal y la periodicidad microcolumnar.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y reproducibilidad mediante protocolos definidos de clarificación, marcado e imágenes de tejidos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al reducir la ambigüedad mecanicista en sistemas tisulares complejos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo al vincular fenotipos anatómicos con resultados funcionales en modelos de enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neurociencia, preparación de tejidos y microscopía de fluorescencia.
- Depende del acceso a microscopios confocales o de dos fotones con objetivos de larga distancia de trabajo y platinas motorizadas.
- Necesita una estandarización entre equipos para los protocolos de aclarado de tejidos, marcado con anticuerpos e imagenología.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diversos sistemas modelo, como la médula espinal o tejidos humanos simulados.
- Está limitado por el tamaño del tejido y la profundidad de penetración óptica, lo cual puede restringir la obtención de imágenes de muestras completas del cerebro sin seccionar.
