Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón
September 5th, 2018
Aquí describimos un procedimiento para tejido claro etiquetado fluorescente y a gran escala imagen de tejido de cerebro de ratón que, por lo tanto, permite la visualización de la organización tridimensional de tipos celulares en el neocortex.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como el análisis de la estructura y la función del neocórtex. La principal ventaja de esta técnica es que puede revelar la estructura tridimensional a gran escala en el cerebro. Aunque este método puede proporcionar información sobre el neocórtex, también se puede aplicar a otros sistemas nerviosos, como la médula espinal.
Para inyectar el marcador en la protuberancia de los ratones adultos, primero extraiga un microlitro de la subunidad B de la toxina del cólera marcada con fluorescencia en una jeringa Hamilton de calibre 26. Coloque una bomba inyectora en la jeringa, luego coloque la jeringa y la bomba en el portaherramientas de un manipulador en un instrumento estereotáxico. Incline el manipulador 12 grados con respecto al eje vertical.
A continuación, coloque el ratón sobre el instrumento estereotáxico. Con una cuchilla de afeitar, retira su vello para evitar infecciones. A continuación, corta 10 milímetros del cuero cabelludo para que se vean el bregma y la lambda.
Administrar 0,1 mililitros de lidocaína al 1% con una pipeta. Establezca el ángulo de la cabeza ajustando la posición vertical de la boquilla en el instrumento estereotáxico para que el bregma y la lambda tengan el mismo nivel Z. A continuación, ajuste la posición del manipulador deslizándolo sobre el instrumento estereotáxico de modo que la punta de la jeringa quede cerca del bregma.
Registre la posición del manipulador. Retraiga la jeringa moviendo el portaherramientas del manipulador. A continuación, mueva el manipulador 5,4 milímetros hacia atrás y 0,4 milímetros lateralmente.
Avance la jeringa de modo que la punta quede cerca del punto de entrada en el cráneo, luego retraiga la jeringa y marque el punto de entrada. En la posición marcada, perfore un orificio con un diámetro de aproximadamente un milímetro. Inserte la punta de la jeringa a través del orificio de modo que la profundidad de la punta sea 6,9 milímetros mayor que la medida en el bregma.
A continuación, inyecte un microlitro de trazadores con la bomba a 0,2 microlitros por minuto. Después de la inyección, retire la jeringa del cerebro. Si es necesario, cubra el cerebro expuesto con pequeños fragmentos de hemostático microfibrilar y adhesivo instantáneo.
Limpie el cerebro expuesto con solución salina para prevenir infecciones y suturar el cuero cabelludo. A continuación, retire el ratón del instrumento estereotáxico. Deje que el ratón se recupere de la anestesia en una incubadora a 30 grados centígrados durante aproximadamente una hora.
No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Regrese el ratón a la compañía de otros animales después de que se haya recuperado por completo. Para recolectar el tejido cerebral, corte el cuero cabelludo con unas tijeras para exponer el cráneo.
A continuación, corta la línea media del cráneo expuesto con unas tijeras. Luego, extirpa el cráneo con fórceps. Si es necesario marcar la posición del bregma y la lambda, primero retire un lado del cráneo.
A continuación, inserte finas agujas de tungsteno en el cerebro en las posiciones del bregma y la lambda, y luego extraiga el cráneo restante. Posteriormente, coloque la muestra de cerebro en la plataforma de vibratome. Corte las secciones de hasta 500 micrómetros de grosor en PBS a temperatura ambiente.
En este procedimiento, transfiera las rodajas a un tubo de plástico de cinco mililitros que contenga cuatro mililitros de solución de Scale S0. Luego incubarlos durante 12 horas con una suave agitación a 37 grados centígrados. Después de 12 horas, retire la solución del tubo con una pipeta y agregue cuatro mililitros de solución Scale A2.
Incubar las rodajas durante 36 horas agitando suavemente a 37 grados centígrados. Después de 36 horas, retire la solución del tubo y agregue cuatro mililitros de solución Scale B4. Incubar las rodajas durante 24 horas agitando suavemente a 37 grados centígrados.
Después de 24 horas, retire la solución del tubo y agregue cuatro mililitros de solución Scale A2. Incubar las rodajas durante 12 horas agitando suavemente a 37 grados centígrados. Después de 12 horas, retire la solución del tubo y agregue cuatro mililitros de PBS.
Incubar las rodajas durante seis horas agitando suavemente a temperatura ambiente. Posteriormente, retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de dos mililitros. Incubarlos con un anticuerpo primario en un mililitro de solución AB Scale durante 48 a 72 horas a 37 grados centígrados con una agitación suave.
Luego, retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de cinco mililitros. Incubarlos en cuatro mililitros de solución AB Scale durante dos horas, dos veces a temperatura ambiente con una suave agitación. Luego, retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de dos mililitros.
Incubar con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia en un mililitro de solución AB Scale durante 48 horas a 37 grados centígrados con una agitación suave. Retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de cinco mililitros que contenga cuatro mililitros de la solución de anticuerpo Scale e incube las rodajas durante seis horas agitándolas suavemente a temperatura ambiente. Retire la solución y agregue cuatro mililitros de la solución AB Scale e incube las rodajas durante dos horas dos veces con una suave agitación a temperatura ambiente.
A continuación, retira la solución y añade cuatro mililitros de PFA al 4% e incuba las rodajas durante una hora agitando suavemente a temperatura ambiente. A continuación, retira la solución y añade cuatro mililitros de PBS e incuba las rodajas durante una hora agitando suavemente a temperatura ambiente. Retire la solución y agregue cuatro mililitros de la solución Scale S4 e incube las rodajas durante 12 horas agitando suavemente a 37 grados centígrados.
Posteriormente, coloque el espaciador en un portaobjetos de vidrio y coloque las rodajas en el espaciador y sumerja las rodajas en la solución Scale S4. Selle el espaciador con un cubreobjetos. Ponga un poco de agua en el cubreobjetos y obtenga imágenes de las rodajas utilizando microscopía confocal o de dos fotones con un objetivo de inmersión en agua a larga distancia de trabajo.
En este estudio, las neuronas de proyección cortical se marcaron en verde mediante la expresión de tdTomato en ratones transgénicos Tlx3-cre AI9 y las neuronas de proyección subcerebral en magenta se visualizaron inyectando el trazador retrógrado CTB488 en la protuberancia a las siete semanas de edad. Esta es la vista superior para mostrar las posiciones aproximadas de las áreas corticales. Aquí están las vistas oblicuas de la fluorescencia CTB488 que muestra las neuronas de proyección subcerebral y la fluorescencia de tdTomato que muestra las neuronas de proyección cortical y esta es la imagen fusionada.
Los cuerpos celulares de los dos tipos de células eran visibles en una amplia gama de áreas cerebrales y las secciones ópticas mostraban microcolumnas periódicas. Esta imagen muestra los cuerpos celulares y las dendritas apicales de las neuronas de proyección subcerebral que expresan eGFP en la sección óptica de un ratón Crym-eGFP y esta imagen muestra las células que expresan parvalbúmina marcadas en verde y las neuronas de proyección subcerebral marcadas en magenta inyectando CTB488 en la protuberancia de un ratón C57 Black 6 mediante el método de escala de anticuerpos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el procesamiento de imágenes en 3D, para responder a preguntas adicionales como la caracterización cuantitativa de la organización cerebral.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología cortical exploraran una nueva organización modular en el cerebro del ratón.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visión general
Este estudio describe un protocolo detallado para la limpieza de tejido, el etiquetado fluorescente y la imagen a gran escala del tejido cerebral de ratón. La metodología permite a los investigadores visualizar la organización tridimensional de los tipos de células en el neocórtex, ofreciendo valiosas perspectivas sobre su estructura y función.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Imagen de tejidos
- Etiquetado fluorescente
Fundamentos
- La estructura y función del neocórtex son fundamentales en la neurociencia.
- Entender la organización celular puede ayudar a abordar preguntas clave de la investigación.
- Esta técnica puede extenderse a otras regiones del sistema nervioso, como la médula espinal.
Propósito del estudio
- Desarrollar una metodología para una visualización mejorada de las estructuras cerebrales.
- Investigar la organización de los tipos de células dentro del neocórtex.
- Proporcionar un marco aplicable a estudios más amplios del sistema nervioso.
Métodos utilizados
- Imagen a gran escala utilizando microscopía confocal o de dos fotones.
- El modelo utilizado incluye ratones adultos y regiones cerebrales específicas como el puente.
- El protocolo detalla los pasos procedimentales para la inyección del trazador y la preparación del tejido.
- La incubación en soluciones como Scale S0, A2, B4, y el uso de anticuerpos fluorescentes fueron pasos críticos.
Resultados principales
- El método revela estructuras tridimensionales a gran escala en el tejido cerebral de ratón.
- Se logró el etiquetado específico de los neuronas de proyección cortical y otros tipos de células.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método robusto para visualizar la organización neuronal.
- Los hallazgos contribuyen significativamente a la comprensión de la estructura neocortical y su función.
- La metodología puede adaptarse para diversas aplicaciones en la investigación neurocientífica.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Understanding the three-dimensional cellular architecture of complex tissues like the neocortex supports target validation by revealing spatially resolved organization of neuronal subtypes. This mechanistic insight enables de-risking of therapeutic hypotheses through direct visualization of target engagement and network-level organization in disease-relevant systems. The method provides predictive confidence in preclinical models by linking anatomical organization to functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping cell-type-specific microcolumn organization in the neocortex.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of neuronal subtypes and their spatial relationships.
- Predictive Value: Enhances target confidence by resolving periodic functional modules relevant to network-level drug effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving three-dimensional tissue architecture.
- Operational Value: Enables reproducible imaging workflows through standardized tissue clearing and labeling protocols.
- Scalability: Facilitates platform reuse across brain regions and complex tissues via motorized stage scanning and long-working-distance objectives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage organization insights to preclinical validation through disease-relevant system modeling.
- Mechanistic De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by visualizing target engagement across distributed neural networks.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural phenotypes with functional outputs for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing spatially resolved, quantitative anatomical data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-type-specific organization in intact tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible tissue preparation and quantitative fluorescence readouts.
- Analytics: Enables comparative analysis via three-dimensional imaging and cell counting across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving disease-relevant tissue architecture for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable to multiple brain regions and complex tissues beyond the neocortex.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct visualization of neuronal organization and microcolumn periodicity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined tissue clearing, labeling, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking anatomical phenotypes to functional outcomes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, tissue preparation, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to confocal or two-photon microscopes with large working distance objectives and motorized stages.
- Necessitates cross-team standardization for tissue clearing, antibody labeling, and imaging protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse model systems such as spinal cord or human tissue surrogates.
- Limited by tissue size and optical penetration depth, which may restrict imaging of whole-brain samples without sectioning.
