Name: Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a capturar interacciones cromatínicas mediante el protocolo modificado 4C-seq, que reduce el sesgo de PCR y mejora la mapeabilidad de lecturas. Este método permite estudiar la regulación transcripcional de forma más precisa.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

4C resultados tienen el potencial para revelar las interacciones de la cromatina que pueden identificar elementos reguladores desconocidos o genes de la blanco que son importantes en un contexto biológico específico24,25,26. Sin embargo, obstáculos técnicos pueden limitar los datos obtenidos de estos experimentos. Sesgo PCR de amplificación excesiva de la plantilla en C 4 protocolos es probable. Este protocolo soluciona este pro...

La identificación de elementos reguladores de expresión génica se ha facilitado por el proyecto de la enciclopedia de elementos de ADN (ENCODE) que comprensivo había anotado actividad funcional para el 80% del genoma humano1,2. La identificación de los sitios en vivo Unión de factor de transcripción, hipersensibilidad al DNaseI, y epigenético histona modificaciones de metilación del ADN en tipos de células individuales allanó el camino para el análisis funcional del candidato regulatorio elementos para la expresión del gen objetivo. Armado con estos resultados, nos enfrentamos con el desafío de determinar la interconexión funcional entre elementos reguladores y genes. Específicamente, ¿cuál es la relación entre un gen dada y su enhancer(s)? El método de captura (3C) de conformación de la cromatina aborda directamente esta cuestión por la identificación físicas y probablemente funcionales, las interacciones entre una región de interés y candidato interactuando secuencias a través de eventos capturados en cromatina fija3 . Como nuestra comprensión de las interacciones de la cromatina ha aumentado, sin embargo, es claro que la investigación de los lugares geométricos del candidato preseleccionado es insuficiente para proporcionar una comprensión completa de las interacciones del gene enhancer. Por ejemplo, codificar utiliza el método de copia (C 5) conformación cromosómica de alto rendimiento captura para examinar una pequeña parte del genoma humano (1%, piloto de 44 loci) y reportó la compleja interconexión de los loci. Genes y potenciadores con interacciones identificadas un promedio de 2 – 4 socios interactúan diferentes, muchos de los cuales fueron cientos de kilobases lejos en el espacio lineal4. Además, Li et al. utilizado el análisis de interacción de cromatina por Paired-End etiqueta secuenciación (ChIA-PET) para analizar las interacciones promotor de todo el genoma y encontró que 65% de los sitios de Unión II de ARN polimerasa estuvieron implicado en las interacciones de la cromatina. Algunas de estas interacciones dio como resultado grandes, genes múltiples complejos que abarcan cientos de kilobases de distancia genómica y que contiene, en promedio, 8-9 genes cada5. Juntos, estos resultados destacan la necesidad de métodos imparciales de todo el genoma para interrogar a las interacciones de la cromatina. Algunos de estos métodos se revisan en Schmitt et al. 6.
Métodos más recientes para los estudios de captura de conformación de la cromatina junto con generación de secuenciación (Hi-C y C 4-seq) permiten el descubrimiento de secuencias desconocidas interactuando con una región de interés6. Específicamente, captura de conformación circular cromosoma con secuenciación de próxima generación (4C-seq) fue desarrollado para identificar loci interactuando con una secuencia de interés en una manera imparcial7 mediante la secuenciación de ADN de cromatina capturada proximal a la región de interés en el espacio 3D. Brevemente, la cromatina se fija para preservar sus interacciones proteína-ADN nativo, troceados con una enzima de la restricción y posteriormente ligarse en condiciones diluidas captura biológicamente relevantes "enredos" de loci interactuantes (figura 1). Los enlaces cruzados se invierten para quitar la proteína, quedando así el ADN disponible para escote adicional con una segunda enzima de restricción. Una ligadura final genera círculos más pequeños de loci interactuando. Cartillas para la secuencia de interés entonces se utilizan para generar una biblioteca amplificada de secuencias desconocidas de los fragmentos circular, seguidos por la secuencia de generación siguiente aguas abajo.
El protocolo presentado aquí, que se centra en la preparación de la muestra, hace dos alteraciones principales existentes 4C-seq métodos8,9,10,11,12. En primer lugar, utiliza un método basado en qPCR empíricamente determinar el número óptimo de amplificación ciclos para pasos de preparación de biblioteca C 4-seq y así mitiga el potencial sesgo de PCR de amplificación excesiva de las bibliotecas. En segundo lugar, utiliza un paso de recopilación de restricción adicionales en un esfuerzo para reducir la uniformidad de secuencias conocidas de "cebo" que impide precisa base llamada por el instrumento de la secuencia y, por lo tanto, maximiza la secuencia informativa, única en cada lectura. Otros protocolos de eluden esta cuestión poniendo en muchas bibliotecas de (12-15)8 4 C-seq con cebo diferentes secuencias o sitios de restricción, un volumen de experimentos que no sean alcanzables por otros laboratorios. Las modificaciones aquí presentadas permiten un pequeño número de experimentos, las muestras o repeticiones para ser indexadas y agrupados en un solo carril.

<table><tbody><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>CviQI</td><td>NEB</td><td>R0639S</td><td></td></tr><tr><td>cebadores de oligonucleótidos de ADN</td><td>IDT</td><td></td><td>A diseñar por el lector</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL MidSci</td><td></td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina</td> <td>tamponada con fosfatoThermo Fisher</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído, sin metanol</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>JT Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>de sobremesa</tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td>refrigerada</tr><tr><td>Etilendiaminotetraacético ácido (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Trypan</td><td>Blue Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>óptico</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr>Bloque <td></td><td></td><td></td><td>de calor agitador</td></tr><tr><td>2 M Tris-HCl</td><td>Calidad Biológico</td><td>351-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>20 mg/ mL de glucógeno</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-223</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Fisher</td><td>4453536</td> qPCR placas Thermo Fisher 4309849 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de tira de PCR</td><td>MidSci</td><td>AVSST-FL</td><td></td></tr><tr><td>1 M Cloruro de magnesio</td><td>Calidad Biológico</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreotol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick kit de purificación PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand Long Template PCR System</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Verde I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>ROX</td><td>BioRad</td><td>172-5858</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA End-It End-Repair Kit Lucigen</td><td></td><td>ER0720</td><td></td></tr><tr><td>LigaFast Sistema rápido de ligadura de ADN</td><td>Promega</td><td>M8221</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimerasa</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td></td></tr><tr><td>UltraSieve Agarosa IBI</td><td>Scientific IB70054</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación circular cromosoma (4c-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

La identificación de elementos reglamentarios para un gen determinado objetivo plantea un desafío técnico significativo debido a la variabilidad en los tamaños de efecto y colocación de elementos reguladores para un gene de la blanco. Algunos progresos con la predicción de Bioinformática de la existencia y función de las modificaciones epigenéticas proximal asociada a genes activados usando sitios de unión del factor de transcripción conservado. Estudios de captura de conformación de la cromatina han revolucionado nuestra capacidad de descubrir contactos físicos cromatina entre secuencias e incluso dentro de un genoma entero. Captura de la conformación de cromatina circular juntada con la secuenciación de próxima generación (4C-seq), en particular, está diseñada para descubrir todas las posibles interacciones de cromatina física para una secuencia dada de interés (mirador), como un gene de la blanco o un regulador potenciador. Las 4C-seq estrategias directamente de la secuencia en el punto de vista pero requieren numerosos y diversos puntos de vista para ser secuenciado simultáneamente para evitar los desafíos técnicos de uniforme basan llamando a (imagen) con plataformas de secuenciación de nueva generación. Este volumen de experimentos puede no ser práctico para muchos laboratorios. Aquí, Divulgamos un acercamiento modificado para el protocolo C 4-seq que incorpora una digestión de la enzima de restricción adicional y pasos de amplificación basada en qPCR que están diseñados para facilitar una mayor captura de lecturas de diversa secuencia y mitigar el potencial de Polimerización en cadena diagonal, respectivamente. Nuestro método modificado de 4C es favorable para el laboratorio de biología molecular estándar para evaluar la arquitectura de la cromatina.

Queratinocitos humanos primarios fueron aislados de prepucio neonatal descartada 2 – 3, agrupados y culta en KSFM complementado con 30 μg/mL pituitaria bovina extracto, 0,26 ng/mL recombinante humana factor de crecimiento epidérmico y 0,09 mM cloruro de calcio (CaCl2 ) a 37 ° C, 5% dióxido de carbono. Las células se dividieron en dos frascos, y un matraz fue distinguido por la adición de CaCl2 a una concentración final de 1,2 mM para 72 h. 107 las células ...

La identificación de interacciones físicas entre los genes y elementos reguladores es un reto, pero ha sido facilitada por los métodos de captura de conformación de cromosoma. Esta modificación al Protocolo de 4C-seq mitiga sesgo PCR minimizando la amplificación excesiva de plantillas de PCR y maximiza el mappability de Lee mediante la incorporación de un paso de síntesis de enzima de la restricción además.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Este método puede responder a preguntas clave en el campo de regulación transcripcional, como el papel de las interacciones de cromatina. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una captura relativamente imparcial de las interacciones para un lugar de interés. Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones potenciadoras del promotor, también se puede aplicar para identificar otros tipos de interacciones de cromatina.Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán problemas porque toma varios días para el protocolo, y el diseño de imprimación requiere prueba y error y orientación de imprimación atípica. Para preservar las interacciones de cromatina en las células de elección, vincúlelas mediante la adición de 9,5 mililitros de formaldehído de grado de microscopía electrónica al 1%en PBS por cada 10 millones de células. Incubar las células mientras se balancea durante 10 minutos a temperatura ambiente.Transfiera los tubos de reacción al hielo para apagar la reacción de unión cruzada y añadir un hielo frío de una glicina molar a una concentración final de 0.125 molares y mezclar por inversión suave. Después de centrifugar y lavar l

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este artículo presenta un método sensible llamado Circle-Seq para purificar el ADN circular extracromosómico (eccDNA). El método abarca la purificación en columna, la eliminación del ADN cromosómico lineal restante, la amplificación en círculo rodante y la secuenciación de alto rendimiento. Circle-Seq es aplicable al cribado a escala genómica del ECCDNA eucariota y al estudio de la inestabilidad del genoma y la variación del número de copias.

La purificación de todo el genoma de ADN circular Extracromosómica a partir de células eucariotas

Este protocolo ofrece a los investigadores una nueva herramienta para controlar la fidelidad de la transcripción en organismos modelo múltiples.

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Una biblioteca CRISPR/sgRNA ha sido aplicada a interrogar a genes de la proteína-codificación. Sin embargo, la factibilidad de una biblioteca sgRNA para descubrir la función de un límite CTCF en Regulación génica sigue siendo inexplorada. Aquí, describimos una biblioteca de sgRNA específicos HOX loci para aclarar la función de los límites CTCF en loci HOX .

HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

Los ARN circulares (arnar) son ARN no codificantes que pueden tener funciones en la regulación transcripcional y en las interacciones mediantantes entre proteínas. Tras la evaluación de los diferentes parámetros para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA, se compiló un protocolo utilizando la preparación total de la biblioteca de ARN varada con el pretratamiento RNase R y se presenta aquí.

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

Informamos de la aplicación de la captura cuantitativa de conformación cromosómica seguida de la secuenciación de alto rendimiento en cuerpos embrionarios generados a partir de células madre embrionarias. Esta técnica permite identificar y cuantificar los contactos entre potenciadores putativos y regiones promotoras de un gen dado durante la diferenciación de células madre embrionarias.

Identificación de contactos potenciadores-promotores en cuerpos embrionarios por captura cuantitativa de conformación cromosómica (4C)

Hi-C 3.0 es un protocolo Hi-C mejorado que combina reticulantes de formaldehído y glutarato de disuccinimidil con un cóctel de enzimas de restricción DpnII y DdeI para aumentar la relación señal-ruido y la resolución de la detección de interacción de cromatina.

Captura de la conformación cromosómica a través de escalas de longitud

Este protocolo describe el método Capture Hi-C utilizado para caracterizar la organización 3D de regiones genómicas específicas de tamaño megabasado en alta resolución, incluidos los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y las interacciones de cromatina de largo alcance entre los elementos reguladores y otros elementos de secuencia de ADN.

Descifrando la organización de la cromatina 3D de alta resolución a través de Capture Hi-C

Aquí, presentamos una adaptación de la técnica de captura de conformación cromosómica (3C) en detalle con énfasis en la participación y el aprendizaje de pregrado.

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

Un obstáculo importante para tecnologías como CRISPR son los eventos fuera del objetivo que pueden alterar genes vitales. La «circularización para la notificación in vitro de los efectos de la escisión mediante secuenciación» (CIRCLE-seq) es una técnica diseñada para identificar los sitios de escisión no intencionados. Este método mapea la actividad de CRISPR-Cas9 en todo el genoma con alta sensibilidad y sin sesgos.

CIRCLE-SEQ para la interrogación de la edición de genes fuera del objetivo

Aprende a capturar interacciones cromatínicas mediante el protocolo modificado 4C-seq, que reduce el sesgo de PCR y mejora la mapeabilidad de lecturas. Este método permite estudiar la regulación transcripcional de forma más precisa.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq) (Video) | JoVE Journal

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

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