Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

Este método puede responder a preguntas clave en el campo de regulación transcripcional, como el papel de las interacciones de cromatina. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una captura relativamente imparcial de las interacciones para un lugar de interés. Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones potenciadoras del promotor, también se puede aplicar para identificar otros tipos de interacciones de cromatina.

Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán problemas porque toma varios días para el protocolo, y el diseño de imprimación requiere prueba y error y orientación de imprimación atípica. Para preservar las interacciones de cromatina en las células de elección, vincúlelas mediante la adición de 9,5 mililitros de formaldehído de grado de microscopía electrónica al 1%en PBS por cada 10 millones de células. Incubar las células mientras se balancea durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Transfiera los tubos de reacción al hielo para apagar la reacción de unión cruzada y añadir un hielo frío de una glicina molar a una concentración final de 0.125 molares y mezclar por inversión suave. Después de centrifugar y lavar las células de acuerdo con el protocolo de texto, vuelva a suspender el pellet en 125 microlitros de cinco EDTA milimotoras con 0.5%SDS y un X inhibidores de la proteasa. Incubar la suspensión celular sobre hielo durante 10 minutos.

Para asegurarse de que la lese celular está completa, mezcle seis microlitros de las células con seis microlitros de color azul tripano en un portaobjetos y cúbralo con un resbalón de cubierta. Ver bajo un microscopio para ver el interior de las células de color azul, y las células no alicentes blancas. Para la primera digestión de restricción añadir 30 microlitros de 10 X tampón de enzima de restricción, y 27 microlitros de 20%Triton X-100 a la suspensión celular y ajustar el volumen total a 300 microlitros con agua.

Retire una alícuota de 15 microlitios y guárdela a cuatro grados centígrados como control no digerido. A la mezcla de reacción restante añadir 200 unidades de enzima de restricción una. Incubar durante la noche a la temperatura adecuada para la enzima en un bloque de calentamiento de agitación con agitación de 900 RPM.

Al día siguiente, añadir 200 unidades adicionales de la enzima y continuar esta incubación durante la noche. Retire una alícuota de 15 microlitrolidores y guárdelo a cuatro grados centígrados como control digerido. Para determinar la eficiencia de la digestión, añada 82,5 microlitros de 10 mililitros Tris-HCl, pH 7.5, a cada control no digerido y digerido.

Añadir 2,5 microlitros de proteinasa K e incubar durante una hora a 65 grados Celsius para revertir la unión cruzada de formaldehído. Para aislar el ADN digerido, agregue 100 microlitros de cloroformo de fenol al tubo. Mezclar por varias inversiones rápidas para eliminar la contaminación residual de proteínas.

Centrifugar a 16,100 G a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la centrifugación, transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo. Agregue acetato de sodio, glucógeno y 100% etanol al tubo y mezcle suavemente por inversión.

Incubar a menos 80 grados centígrados durante una hora para precipitar el ADN. Centrifugar el tubo a 16, 100 G a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Retire el sobrenadante y luego agregue 500 microlitros de 70%etanol para lavar el pellet de ADN.

Centrifugar a 16,100 G a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de retirar el aire sobrenadante, seque el pellet a temperatura ambiente durante dos minutos para eliminar el etanol residual. Re suspenda el pellet seco en 50 microlitros nucleasas el agua libre y proceda a determinar la eficiencia de la digestión por QPCR como se describe en el protocolo de texto.

Para prepararse para la ligadura, caliente y active la enzima de restricción incubando el tubo durante 20 minutos a 65 grados centígrados. A continuación, transfiera el contenido del tubo a un tubo cónico de 50 mililitros, y agregue agua libre de nucleasa, 10 Tampón de ligasa X y ligasa de ADN T4. Mezclar suavemente arremolinando, e incubar durante la noche a 16 grados Centígrados y proceder como se describe en el protocolo de texto.

Para la unión cruzada inversa añadir 15 microlitros de proteinasa K e incubar durante la noche a 65 grados Celsius. Al día siguiente agregue 30 microlitros de la RNase A, e incubar a 45 minutos a 37 grados centígrados. Para continuar con el aislamiento de cromatina, añadir siete mililitros de cloroformo de fenol y mezclar por varias inversiones rápidas.

Centrifugar el tubo a 3.300 G a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la centrifugación, transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo de 50 mililitros, y agregue agua libre de nucleasa, tres molares de acetato de sodio, glucógeno y 100% etanol. Mezclar el contenido e incubar a 80 grados Celsius negativos durante una hora.

Después de la incubación, centrifugar el tubo a 3.900 G a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Retire el sobrenadante y luego lave el pellet con 10 mililitros de hielo frío 70%etanol. Centrifugar a 3.300 G a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.

Retire el sobrenadante y seque brevemente el pellet a temperatura ambiente. Disolver el pellet en 150 microlitros de 10 mililitros de pH Tris-HCl 7,5 a 37 grados centígrados. Almacenar a 20 grados Celsius negativos o continuar con la segunda restricción de digestión, ligadura y purificación de ADN como se describe en el protocolo de texto.

Después de la purificación del ADN, realice QPCR utilizando imprimaciones DE PCR inversas y tintes cibernéticos y ROX para determinar el número de ciclos de amplificación para la amplificación inversa de PCR de secuencias de interacción desconocidas como se describe en el texto. Para preparar el ADN para la secuenciación, recorte las secuencias de cebo con la tercera digestión de restricción digiriendo un microgramo de producto purificado de PCR inverso, así como monitor de enzimas de restricción. Ejecute la enzima de restricción digerida, o monitor RE, en un gel de agarosa de una concentración adecuada para los fragmentos esperados.

Una vez que la eficiencia de la digestión ha sido determinada por la electroforesis de gel, continúe con la purificación inversa del producto PCR y la preparación de la biblioteca de secuenciación, como se describe en el protocolo de texto. La tercera restricción de la digestión es importante en este protocolo para la secuenciación de próxima generación de la captura de confirmación de cromosomas circulares. Esta digestión recorta las secuencias de cebo que pueden facilitar la identificación de atracciones de cromatina.

La electroforesis de gel de agarosa del monitor RE digerido indicaba una digestión suficiente del producto de PCR inverso digerido en paralelo. Después de terminar, cuatro lecturas de secuenciación C fueron recortadas y asignadas al genoma de referencia humana hg38, utilizando el paquete de software BWA. La mayoría de las lecturas se alinean en los sitios de restricción HindiIII o CviQ1I sitios adyacentes a los sitios HindiIII como se esperaba.

Al intentar este procedimiento es importante asegurarse de que las células estén a dos de la manera suficiente y que la cromatina esté suficientemente digerida. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmuno precipitación de cromatina o CHIP, con el fin de responder a preguntas adicionales como la identificación de factores de transcripción implicados en las interacciones de cromatina. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la cromatina exploraran las redes reguladoras físicas.