Name: Azul de toluidina tinción de secciones embebido en resina para la evaluación de la morfología del nervio periférico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a evaluar la morfología del nervio periférico mediante tinción con azul de toluidina en secciones de resina. Este protocolo permite visualizar axones, mielina y tejido fibroso con alta resolución en nervio ciático de rata.

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Los autores desean a thankthe instalaciones de microscopía de Jenkins en la Universidad de Wyoming por su ayuda y los miembros del laboratorio de bosquimano, Kelly Roballo, verdadera de Hayden, Wupu Osimanjiang y Subash Dhunghana, para la asistencia en el cuidado de los animales. Esta publicación ha sido posible por una concesión de desarrollo institucional (IDeA) desde el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud, bajo la subvención # 2P20GM103432.

Ratas Sprague Dawley adultas fueron utilizadas en este proyecto y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado de los animales institucional Universidad de Wyoming.
1. cirugía y fijación del nervio Vivo
Nota: Información del vendedor para todos los materiales y equipos utilizados en el presente Protocolo se enumeran en la Tabla de materiales.
Nota: En vivo fijación del nervio se utiliza para preservar el tejido y reducir la degradación estructural que puede ocurrir entre el momento de la muerte y colección de los nervios. Fijación del tejido in vivo es una práctica estándar para preparación de tejido del sistema nervioso histología, donde la perfusión es a menudo un precursor a esto. La colocación y el tamaño de los nervios periféricos permitidos para la fijación in situ. No se recomienda recolección y fijación del tejido después de la eutanasia debido a la posibilidad de degradación de tejido.
<ol><li>Preparar la rata para la anestesia general colocando en una cámara de inducción con isoflurano 2-3%, luego colocar la rata anestesia en la posición prona en la parte superior de una estera de disección y mantener 1-2% de isoflurano vía cono anestésica. Para garantizar la adecuada profundidad de la anestesia, animales para la retirada de pedal en los pies traseros de prueba y Compruebe la ausencia de los reflejos palpebrales en los ojos tocando el canto medial del ojo. Nota: Inyección Intraperitoneal de la ketamina es una alternativa comúnmente usada para isoflurano inhalado.</li>
	<li>Para exponer el nervio ciático, afeita el pelo de la hind limb(s) y limpie las áreas afeitadas con etanol al 70%. Con un bisturí o tijeras, haga una incisión de 2-3 cm en la piel a lo largo de las extremidades desde la rodilla hasta el trocánter mayor, donde la palpación del fémur con el bisturí estéril para asegurar la correcta ubicación de la incisión. El fémur se encuentra justo proximal al segmento más accesible del nervio ciático. A pesar de que esta es una cirugía no supervivencia, mantienen técnicas estériles.</li>
	<li>Después de hacer la incisión en la piel, localizar el plano entre el músculo bíceps femoral y el glúteo y con unas tijeras de microdisección separar la fascia subyacente y exponer 2-3 cm del nervio ciático subrayado. Para exponer una clara sección del nervio ciático, usar un retractor para ensanchar la brecha entre los dos músculos (figura 1A). Con finas pinzas y tijeras de iris, cuidadosamente separar el nervio que rodea el tejido conectivo, teniendo mucho cuidado de no comprimir o cortar el nervio.</li>
	<li>Añadir fijador de Trump suficiente (formaldehído al 4%, glutaraldehído al 1% en PBS 1 x (tamponada fosfato salino) 1,16 g de NaH2PO4· H2O / 100 mL) en la cavidad que contiene el nervio expuesto para cubrir el nervio y dejar reposar durante 10 minutos. Si necesario, lugar de gasa en las traseras de la pierna para mejorar el ángulo para que el fijador más puede añadirse en la cavidad. Retirar el fijador después de 10 min y repita este paso dos veces más.</li>
	<li>Utilizando un microscopio de disección, cortar los nervios de ambos lados con unas tijeras de disección fina, procurando no estirar o pellizcar el nervio ciático y poner inmediatamente las secciones del nervio en tubos de 15 mL que contiene fijador de Trump a 4 ° C durante una semana, cambiando el fijador cada 48 h.</li>
	<li>No descuide los animales durante cualquier parte del procedimiento quirúrgico. Después del retiro del nervio, eutanasia animales por dislocación cervical bajo anestesia.</li>
</ol>2. el tetróxido de osmio tratamiento e incrustación de resina
<ol><li>Post fijación, con cuidado quite cualquier resto grasa y los tejidos conectivos del nervio y use un bisturí afilado para cortar el nervio en segmentos de aproximadamente 5 mm de largo (nervio segmentos pueden ser separados y etiquetados en diferentes tubos). Preparar fresco el tetróxido de osmio 2% diluido en solución fijadora de Trump y guardar en un tubo de vidrio. Sumerja los segmentos nerviosos en tetróxido de osmio 2% durante 2 h, que puede ser en tubos de plástico para este corto periodo de tiempo. Nota: Algunos tubos plásticos reaccionan con tetróxido de osmio, que causan un oscurecimiento de la solución, por lo que no se recomienda el almacenamiento prolongado de tetróxido de osmio en tubos de plástico.</li>
	<li>Con una resina de incrustación kit mediano, preparar la fórmula final de empotrar:<ol>
<li>Mezclar el epoxi incrustar medio con solución DDSA (anhídrido dodecenylsuccinic; mezcla A) y mezclar el epoxi incrustar medio con solución NMA (anhídrido methylnadic; mezcla B). Que ambas mezclas A y B por lo menos 20 minutos la mezcla por agitación con un agitador magnético.</li>
		<li>Inmediatamente antes del uso, mezcla de A y B de la mezcla y agregar el acelerador DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) de la proporción de 1.5 a 2.0% del volumen total de la mezcla. Tenga en cuenta que se debe medir la solución DPM 30 precisamente para evitar que el bloque de color oscuro y quebradizo. Los productos químicos de la resina son tóxicos; tener especial cuidado para evitar contacto con la piel o inhalación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizando tubos de 1,5 mL, lavar segmentos nerviosos con PBS e iniciar el proceso de deshidratación mediante la colocación de los segmentos del nervio en acetona/agua destilada diferentes pasajes del agua: 30%, 60%, 90%, las concentraciones de 10 minutos cada uno, entonces en acetona al 100% durante 10 minutos 3 veces.  Tenga en cuenta que el etanol puede ser utilizado en lugar de acetona.</li>
	<li>Para infiltración de resina, poner 1 parte de acetona 100% por 30 min, luego en una mezcla de 2 partes de la mezcla final de empotrar y 1 parte de acetona 100% por 30 min y los segmentos del nervio en una mezcla de 1 parte de la mezcla final de empotrar , y finalmente lugar el nervio segmentos en la final incorporar mezcla durante 30 minutos.</li>
	<li>Poner los segmentos nerviosos en caucho de silicona moldes de inclusión (han utilizado la longitud 106 mm x 71 mm de ancho x 7 mm de profundidad; bloquear tamaño 11 mm de longitud x 6 mm de ancho x 3 mm de profundidad). Añadir suavemente la resina encima de los nervios, asegurándose de cubrir los segmentos de todo nervio y evitar burbujas de aire. Deje el molde que contiene segmentos nerviosos con la resina para polimerizar a 60 ° C durante la noche.</li>
</ol>3. seccionar por ultramicrótomo
<ol><li>Preparar vidrio cuchillos uso un cuchillo de vidrio (figura 1B) y hacer cuchillos de cristal con barcos (figura 1), que se utilizan para recoger secciones del nervio flotando en el agua destilada.</li>
	<li>Coloque los bloques de nervio de resina incrustada en el soporte de ultramicrotomía con el trapecio hacia arriba. Con el alcance de la ultramicrotomía, recortar cualquier exceso de resina que rodea el tejido nervioso y hacer el bloque de enfrente con forma de trapecio y como cerca de la superficie longitudinal del nervio posible utilizando un solo filo del disco, como una hoja de afeitar. No penetran en la superficie longitudinal del segmento del nervio, que es reconocible por su coloración oscura por el tetróxido de osmio. Nota: Corte del exceso de resina reduce el área de resina para ser seccionados y mejorar el rendimiento de la hoja y corte en los pasos posteriores.</li>
	<li>Con el ultramicrótomo, realizar múltiples cortes transversales suficientes para exponer una superficie de sección transversal uniforme de tejido fino del nervio, usando un cuchillo de vidrio llano. Una vez hecho esto, cambie a un cuchillo de vidrio cuyo barco se llena con agua destilada a temperatura ambiente y ajustar el ultramicrótomo para 1-2 μm para cortar secciones delgadas.</li>
	<li>Transferencia de secciones delgadas flotantes desde el barco de cuchillo de vidrio a una gota de agua desionizada en portaobjetos de vidrio con asa de metal (figura 1). Seque el portaobjetos que contiene secciones pasando varias veces sobre una llama durante unos segundos, asegurándose de que no se sobrecaliente las secciones. Manchas secas las secciones inmediatamente con toluidina azul o almacenar a temperatura ambiente durante varios días antes de la tinción. Nota: Las secciones pueden también secarse utilizando un plato caliente a 60 ° C durante 15 minutos. Un lento proceso de secado hace que las secciones suave.</li>
</ol>4. toluidina azul de tinción
<ol><li>Preparar solución de azul de toluidina 1% disolviendo 2 g de borato de sodio en 100 mL de agua desionizada, añada 1 g de azul de toluidina y revuelva hasta que se disuelva. Filtrar la solución con papel filtro (tamaño de poro: 11 μm) y mantener la solución en una botella opaca a temperatura ambiente hasta por dos semanas.</li>
	<li>Utilizando una pipeta de plástico o una micro pipeta, añada una gota de solución de azul de toluidina en la parte superior de las secciones del nervio y dejar durante 20-30 s.</li>
	<li>Enjuague toda solución de azul de toluidina exceso sumergiendo suavemente los portaobjetos en agua desionizada jarra y repita 3 - 4 veces hasta que las secciones son claras. Seque el portaobjetos al menos 15 min a 60 ° C o durante la noche a temperatura ambiente y luego cubrir las secciones con un cubreobjetos usando medio de montaje regular. Examinar las diapositivas montadas inmediatamente o almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Examinar bajo un microscopio de luz. Un objetivo de inmersión 100 X aceite se recomienda para imágenes detalladas para calcular ratios de g.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que tienen no hay conflictos de intereses.

Exámenes de las estructuras morfológicas de la lesión periférica del nervio y regeneración son frecuentes temas de estudio13. En este protocolo, describimos los pasos para obtener imágenes de alta calidad para cuantificaciones de datos histológicos utilizando tejido de nervio ciático de rata incrustados en bloques de resina y teñidas con azul de toluidina. Esta técnica proporciona una imagen de la morfología del nervio en el que la regeneración del nervio puede ser cuantificada midiendo el número ...

Los nervios periféricos se extienden por todo el cuerpo, inervan los tejidos diana con axones motores o sensoriales1. Defectos de los nervios periféricos causaron por trastornos y traumas representan un problema de salud pública importante y tiene grandes repercusiones económicas2,3. A pesar de los avances en la evaluación de los resultados de las lesiones de nervio periférico y la comprensión de la regeneración del nervio, los métodos tradicionales tales como nervio histología y técnicas de tinción son herramientas esenciales evaluar cualitativa y cuantitativamente la salud del nervio como una medida de resultado terminal en modelos animales o tejido humano suprimido. Esto a menudo es acompañado de medidas electrofisiológicas de la función de nervio periférico, donde morfometría puede revelar por qué regeneración nerviosa funcional hizo o no ocurrió.
Azul de toluidina tinción de secciones semi-delgadas periférica del nervio de resina incrustada es un método especializado de fibras de nervio myelinated, proporcionando la alta calidad de imagen y detalladas imágenes claras del nervio estructuras4,5,6 . Azul de toluidina es una tinción metacromática acidófilas, descubierta por William Henry Perkin en7de 1856 y ha sido utilizado en varias aplicaciones médicas8. Secciones de nervio periférico teñido de azul de toluidina de segmentos nerviosos embebido en resina permite la clara visualización de las estructuras nerviosas. Visualización de la estructura de la vaina de mielina puede ser mejorado por el uso de tetróxido de osmio posteriores a la fijación4,9. Tetróxido de osmio es un oxidante y los lípidos fijador agente tóxico que interactúa con los enlaces dobles en lípidos, resultando claramente definidas las envolturas de myelin ricos en lípidos10. Sin embargo, tetraóxido de osmio es tóxico, caro, requiere una incubación más larga de segmentos nerviosos y no se utiliza siempre.
Se han desarrollado métodos alternativos de procesamiento y tinción para visualización de la morfología del nervio periférico; Parafina, secciones criogénico y seccionamiento de nervio embebido en resina epoxi seguida de tinción con azul de toluidina o solución fenilenodiamina se ha utilizado para cuantificar los cambios morfológicos de la regeneración del nervio periférico 11,12 . Cada uno de estos métodos tienen sus ventajas y rendimiento de datos esenciales sobre el número de axones, mielina grosor, diámetro de axón y diámetro del axon myelinated fibra diámetro (cociente de g) 11,13,14,15 .
La principal distinción de la incrustación de resina en este protocolo es que facilita la obtención de secciones transversales de espesor de 1-2 μm debido a la dureza de la resina mientras que mantiene las cualidades histológicas del nervio. Estas secciones finas, en comparación con el 4-5 μm espesor secciones de parafina inclusión, proporcionan secciones periféricas del nervio con mayor resolución, lo que permite una cuantificación más precisa de la mielinización del axón, como la relación de g, que no puede ser obtenidos de las secciones más gruesas16. Mientras que la sección criogénica puede utilizarse para obtener secciones de 1-2 μm, ha sido nuestra experiencia que es más difícil obtener secciones sin numerosas fisuras grandes. Dichas secciones agrietadas pueden causar conteo inexacto del número de axones y aspectos del myelination.
Además de azul de toluidina17la coloración, una tinción método18 y tinción tricrómica de Masson4 de plata también puede utilizarse para demostrar axones nerviosos. Sin embargo, utilizando resina, incrustación de secciones del nervio mediano de rata teñido con hematoxilina y eosina o Masson trichrome mostró débil las envolturas de myelin y estructuras desconocidas, considerando que la tinción de azul de toluidina demostró imagen clara de la mielina y puede fácilmente ser cuantificados4. A pesar de algunas limitaciones, los nervios de toluidina azul de resina incrustada la coloración periférica es una técnica valiosa que puede utilizarse cuando se necesitan imágenes de alta resolución de la morfología del nervio.
La principal desventaja para la incrustación de resina es que consume mucho tiempo y no permite el immunostaining del tejido del mismo debido a la dificultad de recuperación de antígeno en comparación con la parafina y las secciones congeladas incrustado técnicas. Por lo tanto, no es generalmente posible utilizar el mismo tejido para la inmunotinción que se procesa mediante incrustación de resina para la tinción de azul de toluidina. Aunque no utilizado aquí, si se desea immunohistochemistry en resina secciones embebidas, el uso de metacrilato de glicol incorporar resinas permite immunohistochemistry ser realizadas en las secciones de tejido, pero es relativamente caro19. Esto puede mitigarse un poco cortando el nervio periférico en segmentos, algunos para incrustación de resina y otros para la inmunotinción directamente después de la fijación.
El proceso de tinción de toluidina azul de resina incrustados los nervios periféricos, como con el análisis histopatológico más, puede dividirse en cinco etapas, incluyendo fijación, deshidratación, inclusión, seccionamiento y tinción20. Aquí pretendemos proporcionar un protocolo y guía práctica para el uso de las secciones de nervio ciático de rata incrustado manchadas de resina con imágenes de alta calidad para la adquisición de azul de toluidina.

<table><tbody><tr><td>Tampón de fosfato de Dulbecco solución salina</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Solución de glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico monohidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Azul de toluidina O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de sodio Decahidrato</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Kit de medio de inclusión epoxi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Para ajustar el pH fijador de Trump</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tetróxido de osmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Microportaobjetos VWR, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio para microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Fundido de incrustación</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Fabricante de cuchillos de vidrio</td><td>Productos RMC</td><td>Ultramicrótomo GKM-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RMC Productos</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cónico</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL Tubos de microcentrífuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL Vial de vidrio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Para recortar bloques de resina</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Electrónica Microscopía Ciencias</td><td>70944</td><td>Para recoger secciones finas de resina</td></tr><tr><td>Tiras de cuchilla de vidrio ultra 6,4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>Horno de 100 vatios</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>6350115</tr><tr><td>Whatman Papel</td><td>de filtro Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de plástico de 3 mL</td> Kit microquirúrgico <td>Z331740</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Instrumentos</td><td></td><td></td>de <td>precisión mundial</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> de fluorescencia Olympus <td>Cámara CCD dual en color y monocromática, DP80</td></tr></tbody></table>

azul de toluidina tinción de secciones embebido en resina para la evaluación de la morfología del nervio periférico

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Los nervios periféricos se extienden por todo el cuerpo, inervan los tejidos diana con axones motores o sensoriales. Debido a la amplia distribución, los nervios periféricos con frecuencia se dañan debido a trauma o enfermedad. Métodos y estrategias se han desarrollado para evaluar lesiones de nervios periféricos en modelos animales, la función y regeneración, análisis de la morfometría de los nervios periféricos se ha convertido en una medida esencial resultado terminal. La coloración del nervio Cruz azul de la toluidina secciones de secciones de resina incrustada del nervio es un método reproducible para la evaluación cualitativa y cuantitativa de los nervios periféricos, lo que permite la visualización del número de axones de morfología y grado de myelination. Esta técnica, como con muchos otros métodos histológicos, puede ser difícil de aprender y dominar mediante protocolos estándar escritos. La intención de esta publicación es por lo tanto acentúan protocolos escritos para la coloración de los nervios periféricos con videografía del método, con los nervios ciático de ratas azul de toluidina. En este protocolo se describe en vivo fijación del nervio periférico y colección del tejido y la fijación con tetróxido de osmio 2%, incrustación de nervios en la resina de epoxy y ultramicrótomo secciones de nervios a 1-2 μm de espesor. Secciones del nervio luego transfirieron a un portaobjetos de vidrio y teñidas con azul de toluidina, después de lo cual ellos son cuantitativa y cualitativamente evaluados. Se muestran ejemplos de los problemas más comunes, así como medidas para mitigar estos problemas.

Resina incrustada secciones teñidas con toluidina azul permiten cuantificaciones precisas datos histológicos de nervios periféricos. Un resumen del procedimiento se muestra en la (figura 2). Secciones de nervios ciáticos encajado en medio resina y teñidas con azul de toluidina demostrada clara imágenes con una resolución óptima (figuras 3). Daño del nervio puede causar muchos cambios en nervio estructuras morfológicas, por ejemplo, cambios en...

Aquí presentamos un protocolo para visualizar estructuras finas de los nervios periféricos de obtención y tinción de secciones de 1-2 μm con toluidina azul

Azul de toluidina tinción de secciones embebido en resina para la evaluación de la morfología del nervio periférico

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Este método podría ayudar a responder preguntas clave en los campos de la lesión y regeneración de nervios periféricos, como ¿cuál es la morfometría de un nervio periférico?, ¿cuántos axones están presentes?, ¿cuál es el estado de mielinización y hay tejido fibrótico presente? La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización en alta resolución de las características nerviosas. Comience colocando una rata anestesiada en posición prona sobre una alfombra de disección.Colocar un cono nasal para mantener la anestesia con 1-2% de isoflurano. Para asegurar la profundidad adecuada de la anestesia, pruebe a los animales para detectar la retirada del pedal y los reflejos palpebrales de las patas traseras. Una vez que se logre una profundidad adecuada de anestesia, afeite el vello de las extremidades traseras y esterilice las áreas afeitadas con etanol al 70%.Palpa el fémur para identificar la ubicación adecuada para la incisión. El fémur se encuentra justo proximal al segmento más accesible del nervio ciático. Después de hacer una incisión de dos a tres centímetros en la piel a lo largo de la extremidad posterior, desde la rodilla hasta el trocánter mayor, ubique el plano entre el músculo bíceps femoral y el músculo glúteo mayor.Luego, use tijeras de microdisección para separar la fascia subyacente y exponer de dos a tres centímetros del nervio ciático subyacente. Use un retractor para ampliar el espacio entre los dos músculos. Con pinzas finas y tijeras de iris, separe cuidadosamente el nervio del tejido conectivo circundante, teniendo mucho cuidado de no comprimir ni cortar el nervio.A continuación, cubra el nervio expuesto con el fijador de Trump y déjelo reposar durante 10 minutos. Si es necesario, coloque una gasa debajo de la pata trasera para mejorar el ángulo y poder agregar más fijador a la cavidad. Retire el fijador después de 10 minutos y repita este paso dos veces más.Bajo el microscopio de disección, corte el nervio ciático de ambos lados con unas tijeras de disección finas, asegurándose de no estirar ni pellizcar el nervio. Coloque inmediatamente las secciones nerviosas en tubos de 15 mL que contengan el fijador de Trump y fíjelas a cuatro grados centígrados durante una semana, cambiando el fijador cada 48 horas. Después de la fijación, retire con cuidado la grasa y los tejidos conectivos restantes del nervio y use un bisturí afilado para cortar el nervio en segmentos de aproximadamente cinco milímetros de longitud.Los segmentos nerviosos se pueden separar en diferentes tubos marcados. Sumerja los segmentos nerviosos en tetróxido de osmio al 2% recién preparado durante dos horas. Con un kit de incrustación de epoxi, prepare la mezcla de incrustación final.Mezcle el medio de inclusión epoxi con la solución DDSA y mezcle el medio de inclusión epoxi con la solución NMA. Mezcle ambas soluciones durante al menos 20 minutos con un agitador magnético. Inmediatamente antes de su uso, combine el acelerador DPM con la solución B y, a continuación, combínela con la solución A de modo que la proporción final del acelerador esté entre un punto cinco y el 2% del volumen total.Transfiera los segmentos nerviosos a tubos de cinco mililitros y después de lavar con PBS, inicie el proceso de deshidratación reemplazando el PBS con concentraciones crecientes de acetona y agua destilada durante 10 minutos cada uno y luego en acetona al 100% tres veces durante 10 minutos cada una. Un paso crítico es la deshidratación de los tejidos. El agua y la resina no interactuarán, por lo que el agua que quede en el tejido no será infiltrada por la resina, dejando agujeros en la sección desprovistos de cualidades histológicas.Para la infiltración de resina, primero coloque los segmentos nerviosos en una mezcla uno a uno de mezcla de inclusión y acetona al 100% durante 30 minutos. Después de 30 minutos, transfiera los segmentos a una mezcla de dos a uno de mezcla de inclusión y 100% acetona durante 30 minutos. Coloque los segmentos nerviosos en moldes de inclusión de caucho de silicona y agregue suavemente la resina encima de los nervios, asegurándose de cubrir todo el segmento nervioso y evitando las burbujas de aire.Deja que la resina polimerice a 60 grados centígrados durante la noche. Coloque un bloque de resina con nervio incrustado en el soporte del ultramicrótomo con el lado trapezoidal hacia arriba. Mientras observa a través del ultramicrótomo, use una cuchilla de un solo filo para recortar el exceso de resina que rodea el tejido nervioso.No penetre en la superficie longitudinal del segmento nervioso, que es reconocible por su tinción oscura por tetróxido de osmio. Con un cuchillo de vidrio liso en el ultramicrótomo, haga múltiples secciones transversales para exponer una superficie de sección transversal uniforme del nervio. Una vez hecho esto, cambie a un cuchillo de vidrio con el bote lleno de agua destilada a temperatura ambiente y ajuste el ultramicrótomo a una o dos micras para cortar secciones delgadas.Use un lazo de metal para transferir secciones delgadas flotantes del bote de cuchillos de vidrio a una gota de agua desionizada en un portaobjetos de vidrio. Otro paso crítico es durante la transferencia de la sección delgada de la cuchilla de vidrio a la corredera. Estas secciones delgadas son muy frágiles y pueden romperse o doblarse.Después de seccionar, seque las secciones de los portaobjetos pasando un portaobjetos sobre una llama varias veces, asegurándose de no sobrecalentar las secciones. Los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente durante varios días si no se tiñen inmediatamente con azul de toluidina. Para teñir las secciones nerviosas, use una pipeta de plástico o un micropipete para agregar una gota de solución de azul de toluidina en la parte superior de las secciones nerviosas.Después de 20 a 30 segundos, enjuague todo el exceso de solución azul de toluidina sumergiendo suavemente los portaobjetos en un frasco de agua desionizada, repitiendo tres o cuatro veces hasta que las secciones estén claras. Seque los portaobjetos durante al menos 15 minutos a 60 grados centígrados o toda la noche a temperatura ambiente. Después del secado, agregue un medio de montaje regular y cubra las secciones con un cubreobjetos.Finalmente, examine las secciones montadas bajo un microscopio óptico. Se recomienda una lente de inmersión en aceite 100X para obtener imágenes detalladas y calcular las relaciones g. Las secciones del nervio ciático incrustadas en medio de resina y teñidas con azul de toluidina mostraron imágenes claras con una resolución óptima al aumentar el aumento de 10X a 20X, 40X y 60X.Este método preserva la estructura nerviosa y permite obtener imágenes de alta resolución y gran aumento que facilitan la medición de varios parámetros, como la relación g, que es la relación entre el diámetro del axón, indicado por la flecha etiquetada como B, y el diámetro total de la fibra, etiquetada como A. Una variedad de factores pueden conducir a secciones de nervios periféricos menos que óptimas, incluida la presencia de grietas en la sección debido a un manejo inadecuado del nervio. También pueden producirse agujeros en la sección debido a una deshidratación insuficiente. Otro posible error en el procedimiento es el plegado de las secciones, que se puede remediar mediante el uso de bucles de inoculación para la transferencia de secciones al portaobjetos de vidrio.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la cuantificación de axones, para responder a preguntas adicionales como: ¿cuál es el grado de regeneración en un nervio regenerativo? Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener secciones de nervios periféricos de una a dos micras para evaluar la morfometría del nervio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Una combinación de diferentes técnicas para maximizar la recogida de datos a partir de tejido de ratón se presenta.

La combinación de colorantes lipofílicos, In situ</emHibridación>, inmunohistoquímica y la histología

Identificación de inmuno periféricos subtipos de fibras nerviosas sensoriales (y la detección de la expresión de proteínas en ella) son fundamentales para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la sensación periférica. A continuación se describen los métodos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral, como los huesos y la piel del miembro, por inmunotinción específica de las fibras nerviosas sensoriales periféricas.

Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

Este video demuestra la técnica de tinción de secciones de nervios periféricos de rata tratadas con tetróxido de osmio e incrustadas en resina utilizando azul de toluidina. Las secciones de nervios teñidas ayudan a visualizar las estructuras finas de los nervios periféricos.

Tinción con azul de toluidina de secciones de nervios periféricos: una técnica para teñir fibras nerviosas mielinizadas para la visualización de la estructura de los nervios periféricos

Con el fin de estudiar los cambios en las fibras nerviosas nociceptivas intraepidérmicos (IENFs) en neuropatías dolorosas (PN), hemos desarrollado protocolos que podrían examinar directamente los cambios morfológicos observados en tres dimensiones en IENFs nociceptivas. El análisis tridimensional de IENFs tiene el potencial para evaluar los cambios morfológicos de IENF en PN.

Imagen tridimensional de nociceptivos Fibras Nerviosas intraepidérmicas en biopsias de piel humana

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Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento de las neuronas olfatorias primarias. Esta propiedad específica se puede utilizar para el trasplante celular. Se presenta aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de OECs en un modelo de lesión del nervio laríngeo.

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

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Las enfermedades desmielinizantes se pueden modelar en animales mediante la aplicación focal de lisolecitina en el SNC. Una sola inyección de lisolecitina en la médula espinal del ratón produce una lesión que se repara espontáneamente con el tiempo. El objetivo es estudiar los factores implicados en la desmielinización y la remielinización, y probar agentes para mejorar la reparación.

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Aquí describimos una preparación novedosa para obtener imágenes de terminales sensoriales lanceoladas vivas de terminaciones en empalizada que inervan los folículos pilosos de la piel del oído de ratón durante la tinción y decoloración con colorantes de estiril piridinio.

Seguimiento óptico del nervio terminal de estar etiquetado en folículo piloso lanceoladas Los finales de la<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Piel de la oreja de ratón

La combinación de microscopía electrónica de transmisión y transducción de señales en el útero es un poderoso enfoque para estudiar los cambios morfológicos en la ultraestructura fina del sistema nervioso durante el desarrollo. Este método combinado permite penetraciones profundas en cambios en los detalles estructurales subyacentes de neuroplasticidad con respecto a su representación topográfica.

Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

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Aprende a evaluar la morfología del nervio periférico mediante tinción con azul de toluidina en secciones de resina. Este protocolo permite visualizar axones, mielina y tejido fibroso con alta resolución en nervio ciático de rata.

Azul de toluidina tinción de secciones embebido en resina para la evaluación de la morfología del nervio periférico

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