Azul de toluidina tinción de secciones embebido en resina para la evaluación de la morfología del nervio periférico

Este método podría ayudar a responder preguntas clave en los campos de la lesión y regeneración de nervios periféricos, como ¿cuál es la morfometría de un nervio periférico?, ¿cuántos axones están presentes?, ¿cuál es el estado de mielinización y hay tejido fibrótico presente? La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización en alta resolución de las características nerviosas. Comience colocando una rata anestesiada en posición prona sobre una alfombra de disección.

Colocar un cono nasal para mantener la anestesia con 1-2% de isoflurano. Para asegurar la profundidad adecuada de la anestesia, pruebe a los animales para detectar la retirada del pedal y los reflejos palpebrales de las patas traseras. Una vez que se logre una profundidad adecuada de anestesia, afeite el vello de las extremidades traseras y esterilice las áreas afeitadas con etanol al 70%.

Palpa el fémur para identificar la ubicación adecuada para la incisión. El fémur se encuentra justo proximal al segmento más accesible del nervio ciático. Después de hacer una incisión de dos a tres centímetros en la piel a lo largo de la extremidad posterior, desde la rodilla hasta el trocánter mayor, ubique el plano entre el músculo bíceps femoral y el músculo glúteo mayor.

Luego, use tijeras de microdisección para separar la fascia subyacente y exponer de dos a tres centímetros del nervio ciático subyacente. Use un retractor para ampliar el espacio entre los dos músculos. Con pinzas finas y tijeras de iris, separe cuidadosamente el nervio del tejido conectivo circundante, teniendo mucho cuidado de no comprimir ni cortar el nervio.

A continuación, cubra el nervio expuesto con el fijador de Trump y déjelo reposar durante 10 minutos. Si es necesario, coloque una gasa debajo de la pata trasera para mejorar el ángulo y poder agregar más fijador a la cavidad. Retire el fijador después de 10 minutos y repita este paso dos veces más.

Bajo el microscopio de disección, corte el nervio ciático de ambos lados con unas tijeras de disección finas, asegurándose de no estirar ni pellizcar el nervio. Coloque inmediatamente las secciones nerviosas en tubos de 15 mL que contengan el fijador de Trump y fíjelas a cuatro grados centígrados durante una semana, cambiando el fijador cada 48 horas. Después de la fijación, retire con cuidado la grasa y los tejidos conectivos restantes del nervio y use un bisturí afilado para cortar el nervio en segmentos de aproximadamente cinco milímetros de longitud.

Los segmentos nerviosos se pueden separar en diferentes tubos marcados. Sumerja los segmentos nerviosos en tetróxido de osmio al 2% recién preparado durante dos horas. Con un kit de incrustación de epoxi, prepare la mezcla de incrustación final.

Mezcle el medio de inclusión epoxi con la solución DDSA y mezcle el medio de inclusión epoxi con la solución NMA. Mezcle ambas soluciones durante al menos 20 minutos con un agitador magnético. Inmediatamente antes de su uso, combine el acelerador DPM con la solución B y, a continuación, combínela con la solución A de modo que la proporción final del acelerador esté entre un punto cinco y el 2% del volumen total.

Transfiera los segmentos nerviosos a tubos de cinco mililitros y después de lavar con PBS, inicie el proceso de deshidratación reemplazando el PBS con concentraciones crecientes de acetona y agua destilada durante 10 minutos cada uno y luego en acetona al 100% tres veces durante 10 minutos cada una. Un paso crítico es la deshidratación de los tejidos. El agua y la resina no interactuarán, por lo que el agua que quede en el tejido no será infiltrada por la resina, dejando agujeros en la sección desprovistos de cualidades histológicas.

Para la infiltración de resina, primero coloque los segmentos nerviosos en una mezcla uno a uno de mezcla de inclusión y acetona al 100% durante 30 minutos. Después de 30 minutos, transfiera los segmentos a una mezcla de dos a uno de mezcla de inclusión y 100% acetona durante 30 minutos. Coloque los segmentos nerviosos en moldes de inclusión de caucho de silicona y agregue suavemente la resina encima de los nervios, asegurándose de cubrir todo el segmento nervioso y evitando las burbujas de aire.

Deja que la resina polimerice a 60 grados centígrados durante la noche. Coloque un bloque de resina con nervio incrustado en el soporte del ultramicrótomo con el lado trapezoidal hacia arriba. Mientras observa a través del ultramicrótomo, use una cuchilla de un solo filo para recortar el exceso de resina que rodea el tejido nervioso.

No penetre en la superficie longitudinal del segmento nervioso, que es reconocible por su tinción oscura por tetróxido de osmio. Con un cuchillo de vidrio liso en el ultramicrótomo, haga múltiples secciones transversales para exponer una superficie de sección transversal uniforme del nervio. Una vez hecho esto, cambie a un cuchillo de vidrio con el bote lleno de agua destilada a temperatura ambiente y ajuste el ultramicrótomo a una o dos micras para cortar secciones delgadas.

Use un lazo de metal para transferir secciones delgadas flotantes del bote de cuchillos de vidrio a una gota de agua desionizada en un portaobjetos de vidrio. Otro paso crítico es durante la transferencia de la sección delgada de la cuchilla de vidrio a la corredera. Estas secciones delgadas son muy frágiles y pueden romperse o doblarse.

Después de seccionar, seque las secciones de los portaobjetos pasando un portaobjetos sobre una llama varias veces, asegurándose de no sobrecalentar las secciones. Los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente durante varios días si no se tiñen inmediatamente con azul de toluidina. Para teñir las secciones nerviosas, use una pipeta de plástico o un micropipete para agregar una gota de solución de azul de toluidina en la parte superior de las secciones nerviosas.

Después de 20 a 30 segundos, enjuague todo el exceso de solución azul de toluidina sumergiendo suavemente los portaobjetos en un frasco de agua desionizada, repitiendo tres o cuatro veces hasta que las secciones estén claras. Seque los portaobjetos durante al menos 15 minutos a 60 grados centígrados o toda la noche a temperatura ambiente. Después del secado, agregue un medio de montaje regular y cubra las secciones con un cubreobjetos.

Finalmente, examine las secciones montadas bajo un microscopio óptico. Se recomienda una lente de inmersión en aceite 100X para obtener imágenes detalladas y calcular las relaciones g. Las secciones del nervio ciático incrustadas en medio de resina y teñidas con azul de toluidina mostraron imágenes claras con una resolución óptima al aumentar el aumento de 10X a 20X, 40X y 60X.

Este método preserva la estructura nerviosa y permite obtener imágenes de alta resolución y gran aumento que facilitan la medición de varios parámetros, como la relación g, que es la relación entre el diámetro del axón, indicado por la flecha etiquetada como B, y el diámetro total de la fibra, etiquetada como A. Una variedad de factores pueden conducir a secciones de nervios periféricos menos que óptimas, incluida la presencia de grietas en la sección debido a un manejo inadecuado del nervio. También pueden producirse agujeros en la sección debido a una deshidratación insuficiente. Otro posible error en el procedimiento es el plegado de las secciones, que se puede remediar mediante el uso de bucles de inoculación para la transferencia de secciones al portaobjetos de vidrio.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la cuantificación de axones, para responder a preguntas adicionales como: ¿cuál es el grado de regeneración en un nervio regenerativo? Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener secciones de nervios periféricos de una a dos micras para evaluar la morfometría del nervio.