Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia sobre cómo la comunicación intercelular entre múltiples tipos de células neuronales humanas contribuye a la formación y función de circuitos sinápticos. Esta técnica genera rápida y sistemáticamente esferas de cocultivo tridimensionales de astrocitos y neuronas funcionalmente maduros a partir de células madre pluripotentes humanas. Estos se pueden utilizar para investigaciones experimentales rigurosas.

La reproducibilidad y escalabilidad de este protocolo es una alternativa definida a las tecnologías emergentes de organoides. Estos son prometedores para el desarrollo de nuevos fármacos y la terapia de injerto celular para promover la neuroregeneración después de una lesión o enfermedad. Comience colocando grupos de HPSC en dos mililitros de medio HPSC que contenga el inhibidor de la rho-cinasa Y-27632 en cada pocillo de una placa de seis pocillos recubierta de ECM.

Mantenga las células madre hasta que tengan aproximadamente un 50% de confluentes, luego cambie el medio a un medio neural que contenga SB431542 y DMH1 para promover la inducción neuronal. Cuando las celdas estén aproximadamente confluentes en un 95%, divida cada pocillo de uno a seis en nuevos pocillos recubiertos de ECM. En el día 14 disociar las celdas con solución de desprendimiento, y transferir el contenido de cada pocillo a un matraz T25 no recubierto con medio que contenga Y-27632 para promover la formación de agregados.

Para generar progenitores de astrocitos y astrocitos en agregados 3D formados espontáneamente, cambie a un medio neural que contenga EGF y FGF2, y alimente cada tres o cuatro días hasta que se confirme la identidad de los astrocitos a los cuatro a seis meses. De forma predeterminada, este protocolo produce astrocitos corticales dorsales. Sin embargo, los subtipos de astrocitos se pueden especificar regionalmente mediante la adición de morfógenos patrón, si se desea.

Una vez a la semana, cuando aparezcan los centros oscuros, recoja las esferas por centrifugación, luego disocie suavemente los agregados de H-astro con la solución de desprendimiento. Solo replatee las esferas que no se adhieren espontáneamente para evitar el paso de células no SNC y no neuronales. Después de cuatro a seis meses de expansión, confirme la identidad celular en un medio de congelación y criopreservación según las instrucciones del fabricante, o úselo inmediatamente para la experimentación.

Para la generación de progenitores neuronales no transgénicos en neuronas, o neuronas H, siembre progenitores neuronales derivados de HPSC en placas de seis pocillos recubiertas de ECM con dos mililitros de medio neural e Y-27632 por pocillo. Si trabaja con iNeuronas inducibles por doxiciclina, agregue un medio neural que contenga doxiciclina cuando las células tengan aproximadamente un 35% de confluentes para inducir la diferenciación y activar la expresión génica. Después de dos días, alimente las líneas transgénicas y no transgénicas con dos mililitros de medio neural por pocillo por día.

Continúe hasta que las celdas estén listas para levantarse al 70% de confluencia. En el caso de los cocultivos, primero disocie suavemente los H-astros de los agregados 3D con solución de desprendimiento. A continuación, proceda a disociar las neuronas H, o iNeuronas, de una monocapa 2D.

Primero, retire el medio de la placa de seis pocillos y agregue 500 microlitros de solución de desprendimiento a cada pocillo que contenga cultivos monocapa. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, agregue suavemente de dos a tres mililitros de medio DMEM-F12 para eliminar las células adheridas.

Luego, recoja las células en medio en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 300 veces G durante un minuto. Aspire el sobrenadante, agregue un mililitro de medio fresco y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente con una micropipeta de 1.000 microlitros para lograr una suspensión de una sola celda. Cuente cada tipo de célula utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.

Agregue la proporción deseada de H-astros y H-neuronas disociadas, o iNeuronas, en un volumen total de dos mililitros a cada pocillo de una microplaca. Centrifugar la placa a 100 veces G durante tres minutos y devolverla a la incubadora durante dos días. Después de un día, se deberían haber formado microesferas densamente empaquetadas en la placa.

Utilice una micropipeta de 1.000 microlitros para extraer suavemente las esferas de los micropocillos. Aplique ligeramente fuerza en el fondo de los micropocillos con medio para eliminar cualquier esfera adherida adicional. Después de recoger todas las esferas en un tubo cónico de 15 mililitros, deje que se asienten.

Luego lave las esferas aspirando primero el medio viejo y luego agregando al menos dos mililitros de medio fresco. Agregue las esferas a un matraz giratorio que contenga de 50 a 60 mililitros de medio. Coloque el matraz en la incubadora sobre una placa de agitación magnética configurada a 60 RPM.

Se necesita un mínimo de tres semanas en cultivo para la formación de sinapsis. Comience recubriendo la superficie de cada matriz de electrodos múltiples, o MEA, con un mililitro de poliornitina para hacer que la superficie sea hidrófila, e incube a 37 grados Celsius durante un mínimo de cuatro horas. Después de la incubación, retire la poliornitina y lave la superficie de cada MEA con agua desionizada.

A continuación, añada un mililitro de matriz extracelular y vuelva a la incubadora durante un mínimo de cuatro horas. Cuando esté listo, retire la matriz extracelular, luego aplique las esferas en 1,5 mililitros de medio sobre la superficie de MEA, asegurándose de que las esferas estén colocadas encima de la guía de electrodos. Dejar que se adhiera durante dos días.

Para medir la actividad eléctrica de las esferas neuronales, coloque el MEA en una platina de cabeza con temperatura controlada. Utilice un filtro de paso alto de cinco hercios y un filtro de paso bajo de 200 hercios, y un umbral de pico de cinco veces la desviación estándar, para registrar la actividad eléctrica espontánea. Guarde los datos sin procesar, incluida la frecuencia y la amplitud de los picos para el análisis estadístico.

Los marcadores de proteínas restringidas de tipo de célula neuronal, como MAP2 para las neuronas y GFAP para los astrocitos, demuestran visualmente la disposición y la madurez uniformemente dispersas de los astrocitos en las neuronas dentro de esferas 3D. Se muestra una proyección máxima de la morfología y ramificación de los astrocitos en una esfera 3D representativa con H-astros escasamente marcados con GFP unido a la membrana. Los H-astros maduros expresan marcadores, incluido el GFAP.

A pesar de que las iNeurons expresan proteínas pre y postsinápticas, como se muestra en la imagen de la izquierda, la densidad sináptica aumenta significativamente por la presencia de H-astros y el cocultivo. Durante las grabaciones, las esferas sanas de iNeuronas colocadas en los MEA provocarán espontáneamente picos de voltaje superiores a 40 microvoltios con frecuencias de disparo constantes. Las esferas de cocultivo muestran una mayor conectividad de red con la presencia de H-astros, lo que resulta en un aumento de las ráfagas sincrónicas de picos de la red.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las imágenes de calcio, para medir la respuesta fisiológica de los astrocitos a la actividad sináptica. Además, se puede llevar a cabo el trasplante en modelos animales para investigar la conectividad con los circuitos sinápticos preexistentes. Siguiendo este enfoque de bioingeniería, se pueden incorporar biomateriales extracelulares y tipos de células adicionales como oligodendrocitos, microglios y células etiliales en proporciones específicas para modelar la compleja señalización que se produce en el cerebro.