Name: Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprende a generar microcircuitos sinápticos tridimensionales mediante cocultivos de astrocitos y neuronas maduros derivados de células madre pluripotentes humanas. Este método reproducible y escalable permite medir la actividad sináptica mediante análisis inmunológico y registros con matrices multielectrodo.

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Nos gustaría agradecer a Dr. Erik Ullian (UCSF) por entrada intelectual sobre el diseño de estos procedimientos, el Dr. Michael Ward (NIH) para asesoramiento técnico en la diferenciación iNeuron y Barlas de Saba para el análisis preliminar de la imagen.

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, se describe un método sistemático para la producción de esferas 3D de nervios cocultures. Las esferas están compuestos por astrocitos y neuronas, que se derivan independientemente de hPSCs. Aunque no es el objetivo de este protocolo, la generación de poblaciones puras de astrocitos del hPSCs28 es un paso crítico y puede ser técnicamente difícil si se realiza sin experiencia previa. Este primer paso en la generación de estos microcircuitos sinápticas debe realizarse con tiempo me...

Los astrocitos son un tipo de célula glial muy abundante dentro de sistema nervioso central (SNC) con una variedad de responsabilidades funcionales más allá de la ayuda estructural. A través de la secreción de factores solubles sinaptogénica y componentes de la matriz extracelular (ECM), astrocitos ayudan en el establecimiento y agrupación de sinapsis Maduritas durante desarrollo1. También juegan un papel crítico en el mantenimiento de la salud y plasticidad de las sinapsis a través de señalización extracelular2,3,4,5y contribuir a la estabilidad a largo plazo de homeostático ambientes mediante la regulación de potasio extracelular y glutamato, así como la secreción de sustratos de energía y ATP6,7,8. Finalmente, puede contribuir a la neurotransmisión por influir en las corrientes extrasinápticos9e indirectamente puede influir en la actividad a través de otros tipos celulares como la promoción de myelination10. Importante, debido a anomalía o disfunción de los astrocitos puede conducir a muchos síndromes del desarrollo neurológico y neuropatología adulto, es evidente la necesidad de incluir astrocitos junto a las neuronas en redes neuronales Ingeniería en orden para un mejor modelo del ambiente endógeno del cerebro. Una característica integral de astrocitos es su capacidad de interacciones dinámicas forma sinapsis neuronal1,11,12. En la ausencia de glia, las neuronas forman un número limitado de las sinapsis, que en general carecen de madurez funcional13.
Los astrocitos humanos Mostrar características morfológicas, transcripcionales y funcionales — tales como aumento en el tamaño y la complejidad de la ramificación, así como sobre los genes — que no son recapitulados en roedores12,14, 15. Como resultado, los estudios utilizando la célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-células neuronales derivadas han aceptado ampliamente como un medio de examinar enfermedades relacionadas con el CNS en vitro en el desarrollo de nuevas terapias, lesiones modelos y paradigmas de la cultura16 ,17. Además, hPSCs permiten el estudio de la formación de la sinapsis humana y función sin necesidad de tejido primario18,19.
Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes del cerebro humano. Hay una necesidad de una plataforma adecuada recapitular sus redes sinápticas con alta fidelidad y reproducibilidad. Recientemente, ha surgido interés en la producción de sistemas de cultivo 3D (ampliamente conocido como 'organoides,' 'esferoides', o 'mini cerebros')20 de modelo complejo tridimensional (3D) las estructuras a nivel celular y macro. Sistemas de cultivo 3D mantienen interacciones célula-célula y ECM que son normalmente ausente o limitada en cocultivo 2D típico paradigmas21,22. Existen una gran cantidad de técnicas para el cultivo de esferoides nervios 3D23,24,25; sin embargo, muchos requieren períodos de cultivo prolongado (meses a años) de desarrollo espontáneo y preservación de la capa, con el usuario exhibiendo muy poco control sobre la salida.
Aquí, nos ilustran un método sistemático para rápidamente y constantemente bioingeniero interacciones neuronales entre múltiples tipos de células (previamente diferenciadas neuronas y astrocitos) derivan de hPSCs por Unión de células en cocultures de la esfera (asteroides)26 que recapitulan las complejidades morfológicas específicas de humanos en 3D. Este sistema neuronal alta densidad genera subtipos neuronales dispersos uniformemente que tomar propiedades madura con el tiempo y pueden ser proyectados o analizados de un modo de alto rendimiento. Demostramos por primera vez que los astrocitos humanos inducen la actividad de explosión sináptica red en estos cocultures 3D. Además, este protocolo es fácilmente adaptable para generar esferas de diferentes tamaños, para utilizar células especificadas para diferentes identidades regionales de la CNS y estudiar las interacciones de varios otros tipos celulares como se desee.

<table><tbody><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubos cónicos</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>Solución de desprendimiento</td></tr><tr><td>Placa AggreWell Stemcell</td><td>Technologies</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Solución de enjuague antiadherente</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7010</td><td>Prevent cell Adhesión a placas de micropocillos</td></tr><tr><td>Anti/Anti</td><td>Thermofisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>Suplemento de medios</td></tr><tr><td>BrainPhys Medio neuronal</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5790</td><td>Alternativa neurofisiológica al medio basal</td></tr><tr><td>Cubreobjetos circulares de vidrio</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stemcell Tecnologías</td><td>7930</td><td>Medio de criopreservación con 10% de DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>10565-042</td><td>Con suplemento GlutaMAX</td></tr><tr><td>DMH-1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>73634</td><td>PELIGRO: Tóxico si se ingiere. Concentración de trabajo: 2 &mu; Suero M</td></tr><tr><td>Donkey</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332100</td><td>Concentración de trabajo: 5% en tampón de bloqueo primario, 1% en tampón de bloqueo secundario</td></tr><tr><td>Clorhidrato de doxiciclina (Dox)</td><td>Sigma</td><td>D3072-1ml</td><td>PELIGRO: Tóxico para mujeres embarazadas. Concentración de trabajo: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Concentración de trabajo: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Concentración de trabajo: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Solución de montaje Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Suero</td> <td>de cabraLaboratorios Biológicos Lampire</td><td>7332500</td><td>Concentración de trabajo: 5% en tampón de bloqueo primario, 1% en tampón de bloqueo secundario</td></tr><tr><td>Hemacitómetro o contador automático de células</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3149-50KU Concentración de</td><td>trabajo: 2 mg/mL</td></tr><tr><td>Placa magnética</td><td>DLAB</td><td>8030170200</td><td></td></tr><tr><td>Matriz</td> <td>de membrana MatrigelSolución de recubrimiento Corning</td><td>354230</td><td>ECM. Concentración de trabajo: 80 &mu; g/ml. Prepárese en hielo y asegúrese de que las pipetas, los tubos y los medios estén previamente enfriados.</td></tr><tr><td>Sistema MEA 2100 Sistemas</td><td>multicanal</td><td>MEA2100</td><td></td></tr><tr><td>solución de montaje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Solución de inclusión de tejidos para crioseccionamiento</td></tr><tr><td>Pap Pen (Aqua Hold)</td><td>Laboratorio de dispositivos científicos</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído ( PFA)</td><td>Acros Organics</td><td>169650025</td><td>PELIGRO: Tóxico si se inhala. Concentración de trabajo: 4% en PBS</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-ornitina (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG Concentración de</td><td>trabajo: 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio rectangulares</td><td>Fisherfinest Premium Superslip</td><td>12-545-88</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5872</td><td>Desmontaje y paso reactivo</td></tr><tr><td>Inhibidor de la Rho-Quinasa Y27632- (Y)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Concentración de trabajo: 10 uM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72234</td><td>Concentración de trabajo: 2 &mu; Matraces</td></tr><tr><td>giratorios</td> M <td>Fisher Scientific</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-3 Concentración de</td><td>trabajo: 20% o 30% en PBS</td></tr><tr><td>T25 Matraz de cultivo</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td>Tapones ventilados</td></tr><tr><td>T75 Matraz de cultivo Olympus</td><td>Plastics</td><td>25-209</td><td>Tapones ventilados</td></tr><tr><td>Terg-A-zyme</td><td>Sigma</td><td>Z273287-1EA</td><td>Detergente. Concentración de trabajo: 1%</td></tr><tr><td>Medio basal TeSR-E8</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>Medio de células madre pluripotentes humanas (hPSC)</td></tr><tr><td>Suplementos de TeSR-E8 Stemcell</td><td>Technologies</td><td>5940</td><td>Suplementos para medio de células madre pluripotentes humanas</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Detergente para la permeabilización celular. Concentración de trabajo: 0,25% en tampón bloqueante</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A-11029</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Thermofisher</td><td>A-11037</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-13862</td><td>Anticuerpo primario; astrocitos perisinápticos</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Chemicon</td><td>MAB360</td><td>Anticuerpo primario; astrocitos</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td>Anticuerpo primario; astrocitos</td></tr><tr><td>Glt1</td><td>Regalo del Dr. Jeffrey Rothstein</td><td>n/a</td><td>Anticuerpo primario; astrocitos</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Synaptic Systems</td><td>160 011</td><td>Anticuerpo primario; neuronas postsinápticas</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Sistemas sinápticos</td><td>188 004</td><td>Anticuerpo primario; neuronas</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab2723</td><td>Anticuerpo primario; neuronas postsinápticas</td></tr><tr><td>S100</td><td>Abcam</td><td>ab868</td><td>Anticuerpo primario; astrocitos</td></tr><tr><td>Sinapsina 1</td><td>Sistemas sinápticos</td><td>106 103</td><td>Anticuerpo primario; neuronas, presináptico</td></tr><tr><td>TuJ1/&beta; 3-tubulina (TUBB3)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Anticuerpo primario; neuronas</td></tr></tbody></table>

microcircuito sináptica modelado con 3d cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes para el estudio del cerebro humano. Una tecnología emergente para abordar este tema es el uso de tres dimensiones (3D) nervios cultivos de células, denominado 'organoides' o esferoides, para la preservación a largo plazo de las interacciones intercelulares como moléculas de adhesión extracelular. Sin embargo, estos sistemas de cultivo son mucho tiempo y no sistemáticamente generado. Aquí detallamos un método rápidamente y consistentemente producir cocultures 3D de neuronas y astrocitos de humanas pluripotentes células madre. Astrocitos en primer lugar, el distinguido y trasplante de precursores neuronales es disociados y contado. A continuación, las células se combinan en forma de esfera platos con un inhibidor de la Rho-quinasa y en proporciones específicas para producir esferas de tamaño reproducible. Después de varias semanas de la cultura como esferas flotantes, cocultures ('asteroides') finalmente se secciona para la inmunotinción o plateados sobre matrices micropozo-microcanal para medir la fuerza y la densidad sináptica. En general, se espera que este protocolo dará 3D esferas neurales que mostrar marcadores del tipo de célula madura restringido, forman sinapsis funcionales y exhiben red sináptica espontánea explosión actividad. Juntos, este sistema permite detección de drogas y las investigaciones sobre los mecanismos de la enfermedad en un modelo más conveniente en comparación con cultivos de monocapa.

Cuando se realiza correctamente, este protocolo produce poblaciones definidas de cocultures funcionales de astrocitos28,33,34 y neuronas35 generados a partir de hPSCs (figura 1A-1C), como detallado anteriormente26 y aquí descritos en los pasos 2.1, 2.2. Este procedimiento paso a paso, con la utilización...

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia sobre cómo la comunicación intercelular entre múltiples tipos de células neuronales humanas contribuye a la formación y función de circuitos sinápticos. Esta técnica genera rápida y sistemáticamente esferas de cocultivo tridimensionales de astrocitos y neuronas funcionalmente maduros a partir de células madre pluripotentes humanas. Estos se pueden utilizar para investigaciones experimentales rigurosas.La reproducibilidad y escalabilidad de este protocolo es una alternativa definida a las tecnologías emergentes de organoides. Estos son prometedores para el desarrollo de nuevos fármacos y la terapia de injerto celular para promover la neuroregeneración después de una lesión o enfermedad. Comience colocando grupos de HPSC en dos mililitros de medio HPSC que contenga el inhibidor de la rho-cinasa Y-27632 en cada pocillo de una placa de seis pocillos recubierta de ECM.Mantenga las células madre hasta que tengan aproximadamente un 50% de confluentes, luego cambie el medio a un medio neural que contenga SB431542 y DMH1 para promover la inducción neuronal. Cuando las celdas estén aproximadamente confluentes en un 95%, div

synaptic-microcircuit-modeling-with-3d-cocultures-astrocytes-neurons

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video demuestra el desarrollo de un cultivo neuronal 3D acoplado a una matriz plana de microelectrodos con neuronas del hipocampo. Las neuronas aisladas forman una red 2D en el área activa de la matriz de microelectrodos y se adhieren a las microperlas de vidrio en una placa de pocillos múltiples con un inserto de membrana. Al transferir estas microperlas recubiertas de neuronas al electrodo, se organizan en una red neuronal 3D interconectada.

Construcción de redes neuronales tridimensionales acopladas a matrices de microelectrodos

El video muestra un método para generar astrosferas a partir de progenitores a partir de células madre pluripotentes humanas. Implica el crecimiento y la proliferación de células madre con medios nutritivos que contienen factores de crecimiento e inhibidores de la quinasa. Estas células luego se agregan y se diferencian en astrocitos, formando astrosferas.

Generación y mantenimiento de astrosferas utilizando células madre pluripotentes humanas

Este video muestra un procedimiento para co-cultivar los astrocitos y las neuronas para formar esferas 3D. Estas esferas 3D proporcionan una plataforma distinta para examinar la formación de sinapsis y la integración de redes neuronales, sirviendo así como un modelo potencial para la investigación en neurociencia del desarrollo, enfermedades neurodegenerativas e intervenciones neurofarmacológicas.

Generación de esferas de cocultivo en 3D de astrocitos y neuronas para inducir la formación de sinapsis

Este video muestra el procedimiento de uso de la matriz de electrodos múltiples (MEA) para medir la fisiología sináptica en esferas de cocultivo 3D. Este método permite comprender la dinámica de la red neuronal y la actividad de ráfaga de la red sináptica dentro de las esferas 3D.

Utilización de matrices de electrodos múltiples para medir la fisiología sináptica en esferas de cocultivo en 3D

Este video demuestra el establecimiento de un cocultivo neurona-astrocito para registrar la actividad de la red neuronal. Al establecer el cocultivo de neuronas motoras y astrocitos en una placa de matriz de electrodos múltiples (MEA), la actividad eléctrica rítmica sincrónica de la red neuronal se registró extracelularmente utilizando el MEA.

Registro de la actividad electrofisiológica de la red neuronal en un cocultivo neurona-astrocito

Se describe un protocolo para generar un sistema de cocultivo compuesto por neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), neuronas corticales primarias y astrocitos. Este sistema de cocultivo permite detectar la formación de contactos sinápticos y circuitos entre nuevas neuronas derivadas de iPSC y neuronas corticales preexistentes que expresan canalrodopsina-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

En este trabajo, se presented. 3D un nuevo modelo experimental en el que los cultivos neuronales 3D se acoplan a matrices de microelectrodos planas (MEAs) se construyen redes sembrando neuronas en un andamio formado por microperlas de vidrio en las que las neuronas crecen y forman estructuras 3D interconectadas.

Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Modificamos e implementar un protocolo previamente publicado que describe la diferenciación rápida, reproducible y eficiente de los inducidos por el hombre células madre pluripotentes (hiPSCs) en neuronas corticales excitatorios 12. Específicamente, nuestra modificación permite el control de la densidad celular neuronal y su uso en matrices de micro-electrodos para medir las propiedades electrofisiológicas en el nivel de red.

Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

Describimos un método para diferenciar astrocitos y neuronas derivados pluripotentes inducidos por humanos de la médula espinal y su cocultivo para el registro electrofisiológico.

Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región

Aquí, presentamos un protocolo para producir cocultivos bioimpresos en 3D de neuronas y astrocitos derivados de iPSC. Este modelo de cocultivo, generado dentro de un andamio de hidrogel en formatos de 96 o 384 pocillos, demuestra una alta viabilidad post-impresión y crecimiento de neuritas en 7 días y muestra la expresión de marcadores de madurez para ambos tipos de células.

Bioimpresión tridimensional de cocultivos de neuronas-astrocitos derivados de iPSC humanos para aplicaciones de cribado

Aprende a generar microcircuitos sinápticos tridimensionales mediante cocultivos de astrocitos y neuronas maduros derivados de células madre pluripotentes humanas. Este método reproducible y escalable permite medir la actividad sináptica mediante análisis inmunológico y registros con matrices multielectrodo.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

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