Name: Monitoreo no destructivos del desarrollo Degradable andamio base ingeniería de tejido vascular mediante tomografía de coherencia óptica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a monitorear el remodelado vascular y la degradación de andamios poliméricos biodegradables mediante tomografía de coherencia óptica. Esta técnica permite la caracterización estructural no destructiva de vasos sanguíneos bioingenierizados.

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Nos gustaría reconocer la ciencia y la tecnología de planificación de proyecto de la provincia China de Guangdong (2016B070701007) para apoyar este trabajo.

1. degradable PGA andamio base tejido-dirigida cultura de los vasos
<ol><li>Fabricación de andamios de PGA<ol>
<li>Coser la malla de la PGA (19 mm de diámetro y 1 mm de espesor) alrededor de la tubería del silicón esterilizada por óxido de etileno (17 cm de longitud, diámetro de 5,0 mm y 0,3 mm de espesor) con sutura 5-0.</li>
		<li>Coser de politetrafluoroetileno (ePTFE, 1cm de longitud) con una sutura de 4-0 en cada extremo de la malla de la PGA y comprometidos por 2 mm.</li>
		<li>Inmersión de andamios de la PGA con la mano en 1 mol/L NaOH durante 1 min para ajustar la estructura espacial de la malla y poner en remojo con agua de cultivo de tejidos grado tres veces de 2 minutos cada uno. Suavemente pat seco el andamio con un papel cada vez. Luego secar los andamios en una campana con un soplador para 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montaje del biorreactor y la ensambladura de Y para proyección de imagen de OCT<ol>
<li>Remoje el biorreactor cilíndrico de vidrio self-developed (10 cm de diámetro y 11,7 cm de altura con cuatro labios interior y cuatro brazos laterales fuera del reactor como se muestra en la figura 1), andamios de PGA, tubo de silicona (diámetro exterior de 5 m m, grueso de 0.3 mm), biocompatibles tubos, conectores, barra de agitación y equipos para el montaje de un tanque de etanol de 95% para 2 h.</li>
		<li>Tire el andamio de la PGA a través de los brazos laterales del biorreactor conectado a un lado con un conector como a otro lado con el Unión Y solía entregar guía de OCT. Montar otro andamio de PGA en el biorreactor de la misma manera. Por favor refiérase a la figura 1.</li>
		<li>Ajuste de ePTFE para labios de biorreactor apretando con suturas de 4-0.</li>
		<li>Ponga el biorreactor en el depósito de etanol para 1 h y secar durante la noche en la campana con el ventilador en.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Siembra de HUASMCs y acondicionado de biorreactor estática<ol>
<li>Aislante HUASMCs de arterias umbilicales humanas mediante técnicas estándar de explante.</li>
		<li>Ampliar y mantener las células en el medio de crecimiento de células de músculo liso se compone de medio DMEM, 20% de suero fetal bovino, 2,36 mg/mL HEPES, 100 U/mL de penicilina G, prolina μg/mL 50, 20 μg/mL alanina, glicina μg/mL 50, 1.5 μg/mL de CuSO4, ácido ascórbico de 50 μg/mL , 10 ng/mL del factor de crecimiento básico del fibroblasto y factor de crecimiento derivado de plaquetas de 10 ng/mL.</li>
		<li>HUASMCs de semilla en una concentración de 5 x 106 células/mL en el medio de cultivo anterior en los andamios de la PGA.</li>
		<li>Poner un stir bar (1,5 cm de longitud) en el biorreactor. Inserte un tubo de alimentación (5 mm de diámetro, 15 cm de longitud) y tres segmentos de tubo corto (5 mm de diámetro, 7 cm de longitud) para el intercambio de gases a través de la tapa del tapón de silicona.</li>
		<li>Instale filtros de 0,22 μm PTFE a cada cambio tubo y el casquillo de la una heparina para el tubo de alimentación. Ajustar la barra de agitación con una velocidad de agitación de 13 rondas por minuto. Montar el biorreactor de vidrio, tapa del tapón de silicona y andamio de PGA en el sistema de cultivo.</li>
		<li>Permite HUASMCs a adherirse para 45 min inclinándose el biorreactor cada 15 min con el soporte, a la izquierda y derecha. Los puertos de reactor y las juntas se sellan con la película de parafina.</li>
		<li>Conecte el Luo-sois la bomba, bolsa de PBS, el conductor con tubos biocompatibles como el sistema de perfusión. Abrir la unidad para llenar los tubos con PBS.</li>
		<li>Lugar el biorreactor general en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C. Llene el compartimiento de la cultura con 450 mL de medio de cultivo HUASMCs.</li>
		<li>Presione el botón stop y apague el dispositivo de la impulsión. Crecen los sembrados andamios bajo cultura estática durante una semana.</li>
		<li>Cambiar el medio de cultivo cada 3-4 días aspirando la mitad del medio a través del tubo de alimentación y volver a llenar el reactor con una cantidad equivalente de medio fresco de cultivo antiguo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación del sistema de perfusión para la proyección de imagen de OCT<ol>
<li>Bombean líquidos en la bolsa de PBS para circular a través de tubos biocompatibles y de vuelta a la bolsa.</li>
		<li>Abrir la potencia del controlador y regular el valor de la bomba con una frecuencia de 60 latidos por minuto y de la salida la presión sistólica de 120 mmHg. Ajustar los parámetros mecánicos según las necesidades del cultivo vascular ingeniería de tejidos.</li>
		<li>Haga clic en el botón ejecutar para trabajar el sistema de perfusión. Proporcionar el estímulo pulsátil fijo anterior a los vasos durante 3 semanas presurizando iterativamente biocompatible tubos10,12 después de 1 semana de la cultura estática.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. realizar la proyección de imagen óptica con OCT
<ol><li>Utilice una fuente de luz para asegurar la resolución axial de 10-20μm y la profundidad de imagen de 1-2 mm para identificar la estructura del TEBV basado en el dominio de la frecuencia OCT intravascular imaging system9.</li>
	<li>Encienda el interruptor de encendido y abra el software de captura de imagen.</li>
	<li>Conectar el catéter de proyección de imagen óptica de fibra con el controlador de motor de tracción y óptico (DOC) con función de retiro automático del catéter.</li>
	<li>Establecer parámetros de tasa de adquisición de imagen de 10 fotogramas por segundo con una velocidad de retroceso automático de 10 mm/s.</li>
	<li>Conexión de catéter Y cruce casquillo de la heparina con una aguja de 18G.</li>
	<li>Coloque el catéter en el tubo de silicona e identificar la tirantez de la sutura de la malla de la PGA antes de cargar el andamio de la PGA en el biorreactor.</li>
	<li>Coloque la punta del catéter sobre la región de interés. Ajuste el dispositivo de retirada y Compruebe la calidad de imagen8.</li>
	<li>Adquisición de imágenes en 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 días en la cultura de cada TEBV individual y guardar secuencialmente con tiempo real de observación de la microestructura de la TEBV, incluyendo la morfología superficial, estructura interna y composición.</li>
	<li>Repita la medición por 3 veces obtener una medición fiable de ingeniería buques cada vez. Capturar una serie de imágenes a lo largo de la prueba utilizando el software de captura de imagen.</li>
</ol>3. Análisis de la proyección de imagen
<ol><li>Utilizar software de análisis de imagen para medir el espesor de la pared TEBV. Seleccione la imagen a ser analizada. Haga clic en la herramienta de seguimiento para identificar la parte interior del TEBV por el software automáticamente y manualmente esbozar el lado externo. Un diagrama de espesor aparecerá en la pantalla.</li>
	<li>Repita la medición por 5 veces obtener una medición fiable de las construcciones. El análisis de OCT fue realizado por dos investigadores independientes cegados a la información obtenida.</li>
</ol>4. la cosecha de TEBV y el procesamiento de tejido
<ol><li>Abierta la tapa del tapón de silicona colocado sobre el biorreactor cuando se acaba la cultura y desechar el medio de cultivo. Afloje el ePTFE de labios de biorreactor y corte los tubos de silicona desde el lado exterior de ePTFE con tijeras. Cosecha TEBVs de biorreactor y cortar en secciones para el examen de microscopia electrónica de barrido.</li>
	<li>Tomar el resto de TEBVs y cortar en secciones gruesas de 4 μm. Saque el tubo de silicona soporte y fijar las secciones con paraformaldehído al 4%. Realizar la rutina histológica tinción de Masson trichrome y Sirius rojo para examinar la morfología del colágeno y PGA10,13,14.</li>
	<li>Para evaluar el contenido de la PGA y el componente de colágeno, observar muestras histologic con Sirius rojo coloración por un microscopio polarizado. Restos de PGA son claramente delimitadas a través de birrefringencia y puede ser cuantificado el área remanente basado en el área de sección transversal10.</li>
</ol>

<ol><li>Chan-Park, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+control+of+vascular+smooth+muscle+cell+morphology+and+phenotype+for+functional+tissue-engineered+small-diameter+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).</li>
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<li>Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+challenges+in+biomaterials+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering.</a> Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).</li>
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<li>Niklason, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+tools+for+engineering+collagenous+tissues+integrating+bioreactors%2C+intravital+imaging%2C+and+biomechanical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).</li>
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<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=The+design+conception+and+realization+of+pulsatile+ventricular+assist+devices-from+Spiral-Vortex+pump+to+Luo-Ye+pump+&btnG=">The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=Application+of+optical+coherence+tomography+in+tissue+engineered+blood+vessel+culture+based+on+Luo-Ye+pump&btnG=">Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).</li>
<li>Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+the+age+of+fibrotic+lesions+using+polarized+light+microscopy+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis.</a> American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).</li>
<li>Martinho, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+optical+attenuation+coefficient+and+mechanical+tension+of+irradiated+human+cartilage+measured+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography.</a> Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).</li>
<li>Poirierquinot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+1.5-Tesla+magnetic+resonance+imaging+for+tissue-engineered+constructs%3A+a+noninvasive+tool+to+assess+three-dimensional+scaffold+architecture+and+cell+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+burst+pressure%3A+initial+evaluation+of+the+natural+history+of+the+biaxial+mechanical+properties+of+tissue-engineered+vascular+grafts+in+the+venous+circulation+using+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model.</a> Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).</li>
<li>Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+vessel+development+and+insight+towards+neovascular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Generar ingeniería vasos con estructural y propiedades mecánicas similares a los de nativos de los vasos sanguíneos pueden conducir a reducir el tiempo de uso clínico y es la última meta de la ingeniería vascular. Técnicas de imagen ópticas permiten la visualización de los componentes específicos vasculares ingeniería tisular, que no puede controlar construcciones individuales a través de injertos de la cultura y la exposición a un ambiente de cultura sin comprometer la esterilidad7. En este artíc...

Ingeniería de tejido de los vasos sanguíneos (TEBVs) es el material más prometedor como un ideal del injerto vascular1. Para el desarrollo de injertos para ser clínicamente útil con propiedades estructurales y funcionales similares como vasos nativos, múltiples técnicas han sido diseñadas para mantener la función vascular2,3. Aunque ha habido barcos diseñados con tasas de permeabilidad aceptable durante la implantación y en el estudio clínico de fase III4, cultura a largo plazo y alto costo también muestran la necesidad de supervisar el desarrollo de TEBVs. Comprensión de los procesos de crecimiento, remodelación y adaptación de extracelular matrix(ECM) en TEBVs en el entorno de quimio-mecánica de biomimética puede proporcionar información crucial para el desarrollo de la ingeniería de tejido vascular.
La estrategia ideal para seguir el desarrollo de la ingeniería vasos de pequeño diámetro5 debe ser no destructiva, estéril, longitudinal, tridimensional y cuantitativa. Esta modalidad de proyección de imagen, incluso cambios antes y después del trasplante vascular podrían evaluarse TEBVs bajo condiciones de cultivo diferentes. Se necesitan estrategias para describir características de los recipientes de vida diseñado. Técnicas de imagen ópticas permiten la visualización y cuantificación de deposición de tejidos y biomateriales. Otras ventajas son la posibilidad de activar el tejido profundo y sin etiqueta de imagen con alta resolución6,7. Sin embargo, las moléculas específicas de la imagen y equipo óptico menos accesible para la supervisión en tiempo real es un obstáculo práctico importante, que ha limitado la amplia aplicación de la microscopía óptica no lineal. Tomografía de coherencia óptica (OCT) es un método óptico con modalidad de proyección de imagen intravascular como una herramienta clínica utilizada para guiar la terapia intervencionista cardiaca8. En la literatura el método de OCT fue divulgado como una forma de evaluar el espesor de pared de TEBVs9,10, juntada con modalidades de proyección de imagen positivas para la investigación de ingeniería de tejido vascular. Considerando que la dinámica de los diseñado vascular no se observó crecimiento y remodelación.
En este manuscrito, detallamos la preparación de biodegradables TEBVs poliméricos basados en el andamio para la cultura de cuatro semanas. Células de músculo liso vascular de arterias umbilicales humanas (HUASMCs) se amplió y sembradas en un andamios de ácido (PGA) poroso poliglicólico degradables en el biorreactor. Polímeros biodegradables papel en un sustrato temporal para ingeniería de tejidos y tienen una cierta degradación tasa de11. Para asegurar a un partido apropiado entre andamio degradación y formación de tejido de neo, andamios ECM y PGA son factores cruciales para la remodelación vascular eficaz. El sistema de perfusión simula el microambiente biomecánico de vasos nativos y mantiene una deformación constante bajo el estímulo de presión.
El objetivo del protocolo presentado es describir una estrategia relativamente sencilla y no destructiva para la proyección de imagen de TEBVs y monitoreo a largo plazo de la cultura. Este protocolo puede ser utilizado para la visualización de cambios morfológicos y mediciones del espesor de los vasos diseñados bajo condiciones de cultivo diferentes. Además, el análisis de la degradación de los materiales polímero-basados en lo andamios de la ingeniería del tejido se pueden realizar para la identificación. Mediante la combinación de métodos de exploración electrónica microscopic(SEM) y polarizada microscopio utilizado en este protocolo, correlación y cuantificación de la distribución de la matriz extracelular y la degradación de la PGA se pueden hacer, que puede facilitar la evaluación del andamio degradación combinada con proyección de imagen de OCT.

<table><tbody><tr><td>Malla PGA</td> Tubo de silicona <td>Synthecon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conector</td><td>Cole Parmer</td> Sistema OCT intravascular Cole Parmer <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> St. Jude Medical, Inc ILUMIEN&trade;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> OPTIS&comercio; SISTEMA</td><td></td></tr><tr><td>microscopio electrónico de barrido</td><td>Philips</td><td>FEI Microscopio polarizado Philips XL-30</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Suturas Olympus</td><td>Olympus BX51</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Johnson & Bomba</td> pulsátil Johnson <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Guangdong Cardiovascular Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightLab Software</td><td>de imágenes St. Jude Medical, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo no destructivos del desarrollo degradable andamio base ingeniería de tejido vascular mediante tomografía de coherencia óptica

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Ingeniería injertos vasculares con propiedades estructurales y mecánicas similares a los vasos sanguíneos naturales se espera que la creciente demanda de bypass arterial. Caracterización de la dinámica de crecimiento y proceso de remodelación de polímero degradable basada en andamio tejido-dirigida vasos sanguíneos (TEBVs) con el estímulo pulsátil es crucial para la ingeniería de tejido vascular. Técnicas de imagen ópticas se destacan como herramientas poderosas para el control de la vascularización del tejido diseñado que permite proyección de imagen de alta resolución en tiempo real cultura. Este trabajo demuestra un no destructivo y rápido en tiempo real imágenes estrategia para controlar el crecimiento y remodelación de TEBVs en la cultura a largo plazo mediante el uso de tomografía de coherencia óptica (OCT). Se evalúa la morfología geométrica, incluyendo proceso de remodelación vascular, grueso de pared y comparación de espesor TEBV en momentos diferentes de la cultura y la presencia del estímulo pulsátil. Por último, OCT proporciona posibilidades prácticas para la observación en tiempo real de la degradación del polímero en los tejidos reconstrucción bajo estimulación pulsátil o no y en cada segmento vascular, por en comparación con la evaluación de la degradación de polímero utilizando exploración electrónica microscopic(SEM) y microscopio polarizado.

El sistema tridimensional de la cultura consistió en una cámara de cultivo en el biorreactor y el sistema de perfusión con un ciclo cerrado de fluido10,13 (figura 1). El catéter de proyección de imagen de OCT fue insertado en el extremo distal de la Unión Y y hacia atrás en el tubo de silicona para la proyección de imagen. Proyección de imagen de OCT fue utilizado primero para delinear la caracterizac...

Un protocolo paso a paso para ensayos no destructivos y período largo supervisar el proceso de remodelado vascular y la degradación de andamio en cultura en tiempo real de biodegradables poliméricos basados en andamio tejido-dirigida vasos sanguíneos con el estímulo pulsátil usando la tomografía de coherencia óptica se describe aquí.

Monitoreo no destructivos del desarrollo Degradable andamio base ingeniería de tejido vascular mediante tomografía de coherencia óptica

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos vasculares, como el monitoreo de la dinámica del crecimiento vascular del ingeniero y la remodelación durante el cultivo a largo plazo. La principal ventaja de utilizar la tomografía de coherencia óptica, o PTU, es que es una estrategia de imagen fácilmente disponible, en tiempo real y no destructiva para caracterizar las características estructurales y el proceso de remodelación de los recipientes de ingeniería. Demostrando el procedimiento también estarán Shangmin Liu, y Wentao Ma, técnicos de mi laboratorio.Para comenzar este procedimiento, fabrique el andamio PGA como se describe en el protocolo de texto Dip PGA andamifolds in a mol-per-litro de hidróxido de sodio durante un minuto, para ajustar la estructura espacial de la malla. Luego, remoje los andamios en agua de grado de cultivo de tejido tres veces durante dos minutos cada una. Cada vez, seque suavemente el andamio con un papel tisú.Luego, seque los andamios en una capucha con un soplador durante una hora. Para ensamblar el biorreactor y la unión Y para la toma de imágenes OCT, primero, remoje el biorreactor cilíndrico de vidrio autodesarrollado, los andamios PGA, el tubo de silicona, los tubos biocompro compatibles, los conectores, la barra de agitación y el equipo para su montaje en un tanque de etanol del 95 por ciento durante dos horas. Tire del andamio PGA a través de los brazos laterales del biorreactor conectado a un lado con un conector, así como a otro lado con la unión y utilizada para entregar el cable guía OCT.Montar otro andamio PGA en el biorreactor de la misma manera. Ajuste el politetrafluoroetileno en los labios del biorreactor apretando con 4-0 suturas. Vuelva a colocar el biorreactor en el tanque de etanol durante una hora antes de secarlo durante la noche en una capucha con el soplador puesto.Ahora, aislar las células musculares lisas de la arteria umbilical humana de las arterias umbilicales humanas por técnicas de explantación estándar En la causa de salvar las células en andamios PGA, evitar cualquier goteo de suspensión celular en la parte inferior del biorreactor. Además, cubra el biorreactor con la tapa del tapón de silicona tan pronto como sea posible después del asiento de la célula para evitar la contaminación. Expandir y mantener las células en medio de crecimiento muscular liso.Semilla de la arteria umbilical humana suaviza las células musculares a una concentración de 5 millones de células por mililitro en el medio de cultivo anterior en los andamios PGA. Después de colocar una barra de sir en el biorreactor, cúbrala la tapa del tapón de silicona que tiene un tubo de alimentación y tres segmentos de tubo cortos insertados para el intercambio de gas. Conecte los filtros de PTFE de 0,22 micras a cada tubo de cambio de aire y conecte una tapa de heparina al tubo de alimentación.Ajuste la barra de agitación con una velocidad de agitación de 13 rondas por minuto. A continuación, monte el biorreactor de vidrio, la tapa del tapón de silicona y el andamio PGA en el sistema de cultivo. Deje que las células se adhieran durante 45 minutos inclinando el biorreactor cada 15 minutos con un soporte a la izquierda y a la derecha.Ahora, conecte la bomba LOO-OH-YEE, la bolsa salina tamponada con fosfato y el conductor con los tubos biocompatibles para crear el sistema de profusión. Abra el controlador para llenar los tubos con PBS. Coloque el biorreactor general en una incubadora humidificada con un 5 por ciento de CO2 a 37 grados centígrados.Llene la cámara de cultivo con 450 mililitros del medio de cultivo. Cultivar los andamios de semillas bajo cultivo estático durante una semana, cambiando el medio de cultivo cada tres a cuatro días aspirando la mitad del medio antiguo a través del tubo de alimentación y rellenando el reactor con una cantidad equivalente de medio de cultivo fresco. Para preparar el sistema de profusión para la toma de imágenes OCT, bombee fluidos en la bolsa PBS para que circulen a través de los tubos biocompatibles y vuelvan a la bolsa.Abra la potencia del conductor y regule el ajuste de la bomba con una frecuencia de 60 latidos por minuto y una presión sistólica de salida de 120 milímetros de mercurio. Ajustar los parámetros mecánicos de acuerdo con las necesidades del cultivo vascular de ingeniería de tejidos. Haga clic en el botón Ejecutar para que el sistema de profusión funcione.Proporcione la simulación pulsátil de fijación a los vasos durante tres semanas presurizando iterativamente los tubos biocompatibles después de una semana de cultivo estático. Utilice una fuente de luz para garantizar la resolución axial de diez a veinte micras y la profundidad de imagen de uno a dos milímetros para identificar la estructura de los vasos sanguíneos diseñados por tejidos, o TEBB, en función del dominio de frecuencia OCT intravascular sistema de imágenes. Encienda el interruptor de encendido y abra el software de captura de imágenes Conecte el catéter de imágenes de fibra óptica al motor de accionamiento y al controlador óptico, con la función de retirada automática del catéter.Establezca los parámetros de la velocidad de adquisición de imágenes en diez fotogramas por segundo, con una velocidad de retroceso automática de diez milímetros por segundo. Ahora, conecte el catéter de imagen a la unión y a través de la tapa de la heparina con una aguja del calibre 18. Coloque el catéter en el tubo de silicona e identifique la estanqueidad de la estructura de la malla PGA antes de cargar el andamio PGA en el biorreactor.Ahora, coloque la punta del catéter sobre la región de interés. Ajuste el dispositivo de retroceso y compruebe la calidad de la imagen. Adquiera imágenes en uno, cuatro, siete, diez, 14, 17, 21 y 28 días en cultura para cada TEBV individual.Guarde estas imágenes secuencialmente con una observación en tiempo real de la microestructura TEBV, incluida la morfología de la superficie, la estructura interna y la composición. Repita la medición tres veces para obtener una medición fiable de los recipientes de ingeniería cada vez. Capture una serie de imágenes a lo largo de las pruebas utilizando el software de captura de imágenes.Para utilizar el software de análisis de imágenes para medir el grosor de la pared de los vasos sanguíneos diseñados por tejidos, seleccione primero la imagen que se va a analizar. A continuación, haga clic en la herramienta de seguimiento para identificar automáticamente el lado interno del vaso sanguíneo diseñado por tejido con el software y esbozar manualmente el lado exterior. Aparecerá un diagrama de grosor en la pantalla.Repita la medición cinco veces para obtener una medición fiable de las construcciones. Considere la posibilidad de utilizar dos investigadores independientes obligados a obtener información. Abra la tapa del tapón de silicona colocada sobre el biorreactor cuando el cultivo haya terminado y deseche el medio de cultivo.Aflojar el politetrafluoroetileno de los labios del biorreactor y cortar los tubos de silicona desde el lado exterior del politetrafluoroetileno con tijeras. Cosecha los TEV del biorreactor y córtalos en secciones para un examen de microscopía de electrones de escaneo. Extraiga el tubo de silicona de soporte y fije las secciones con un 4 por ciento de formaldehído de potencia.Realizar tinciones histológicas de rutina con tricromo de masajista y rojo sirious para examinar la morfología del colágeno y PGA. Para evaluar el contenido de PGA y el componente de colágeno, observe muestras histológicas con manchas rojas de sirio a través de un microscopio polarizado. Las imágenes de OCT se comparan con hallazgos histopatológicos de TEV después de cuatro semanas de cultura.La imagen OCT muestra microestructura compacta y componentes específicos en comparación con la evaluación histológica. El medio de cultivo, el tubo de silicona, el TEBV y el fragmento de PGA son visibles. La tinción tricroma de Masson demuestra fibras de colágeno distribuidas en una dirección determinada, junto con restos de PGA en la capa de medios de los recipientes de ingeniería.La tinción roja sirius revela restos de PGA y un componente de colágeno mediante el uso de un microscopio polarizado. Los micrografías de electrones de escaneo de recipientes de ingeniería demuestran una microestructura compacta. Mientras tanto, esta modalidad de imagen intraluminal adopta un monitoreo no destructivo y fácil de los TEV, incluyendo el proceso de remodelación y la morfología visual in situ en el cultivo de larga duración.Como se muestra aquí, la remodelación se produce antes y los cambios morfológicos se manifiestan más obviamente en el grupo dinámico a través de la comparación del espesor teBV. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos vasculares exploren las características de la estructura y el proceso de remodelación a largo plazo de los vasos de ingeniería. La visualización clara de restos poliméricos mediante microscopía polarizada combinada con imágenes oct puede ser útil para evaluar la degradación de los andamios.

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Bioingeniería

Nuestro grupo ha desarrollado un sistema de cultivo bio-reactor que imita el estrés pulsátil fisiológicos del sistema cardiovascular para regenerar implantables de pequeño diámetro injertos vasculares.

La ingeniería biológica basada en los injertos vasculares El uso de un biorreactor pulsátil

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La vascularización es clave para enfoques en la ingeniería de tejidos éxito. Por lo tanto, se requieren tecnologías fiables para evaluar el desarrollo de las redes vasculares en los tejidos-construcciones. Aquí presentamos un método simple y rentable para visualizar y cuantificar la vascularización in vivo.

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La implantación de injertos óseos autólogos y alogénicos constituyen aceptó enfoques para tratar la importante pérdida de masa ósea craneofacial. Sin embargo, el efecto de la composición de injerto en la interacción entre la neovascularización, la diferenciación celular y la formación de hueso no está claro. Se presenta un protocolo de imagen multimodal destinado a dilucidar la interdependencia angiogénesis osteogénesis en la proximidad del injerto.

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Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

Describimos el uso de microscopía de coherencia óptica de campo completo como un método para la evaluación de alta calidad del estroma del donante corneal. Este protocolo se puede utilizar para identificar características indicativas de salud o enfermedad, y tiene como objetivo mejorar la detección y selección de tejidos de donantes y, por lo tanto, los resultados de la queratoplastia.

Microscopía de coherencia óptica de campo completo para el análisis histológico de características estromales en injertos corneales

Tomografía de coherencia óptica (OCT), una tecnología de imagen tridimensional, fue utilizada para monitorear y caracterizar la cinética de crecimiento de esferoides multicelulares tumor. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales usando un voxel contando el enfoque y la detección de tejido libre de etiqueta muerto en esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica, fueron demostrados.

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Las biopelículas microbianas forman arquitecturas complejas en las interfases y se convierten en patrones espaciales altamente dependientes de la escala. Aquí, presentamos un sistema experimental (duro y software) para la adquisición automatizada de conjuntos de datos de tomografía de coherencia óptica 3D (OCT). Este conjunto de herramientas permite la caracterización no invasiva y multiescala de la morfogénesis de biopelículas en el espacio y el tiempo.

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Este artículo describe un método para medir la reactividad de la vasculatura de la retina in vivo con sujetos humanos utilizando una técnica de provocación de respiración de gases para administrar estímulos vasoactivos mientras adquiere imágenes de la retina.

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Monitoreo no destructivos del desarrollo Degradable andamio base ingeniería de tejido vascular mediante tomografía de coherencia óptica (Video) | JoVE Journal

Monitoreo no destructivos del desarrollo Degradable andamio base ingeniería de tejido vascular mediante tomografía de coherencia óptica

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