Name: Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprende análisis de fluorescencia imparcial en Drosophila para estudiar neurodegeneración mediante cuantificación de agregados proteicos. Este flujo de trabajo semi-automatizado mejora la reproducibilidad en investigación.

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Este trabajo es apoyado por la Sheila y David Fuente neuropático dolor investigación programa de becas de pos-grado (a J.M.B.), los Lois Pope LIFE Fellows del programa (y C.L., Y.Z., J.M.B.), la Beca Predoctoral de la Fundación Robinson Snyder (a C.L.), el Dr. John T . Macdonald Fundación (C.L.), contratos, subvenciones de los institutos nacionales de salud (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 y R56NS095893 (a R.G.Z.) y proyecto de erudito de Taishan (provincia de Shandong, República Popular de China) (a R.G.Z.).

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<li>Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+and+characterization+of+intracellular+protein+aggregates+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast.</a> Prion. 8 (3), 276-284 (2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí puede utilizarse para robusta y reproducible cuantificar procesos biológicos celulares visualizados por la proyección de imagen basada en fluorescencia. Contexto biológico y limitaciones técnicas necesitan ser cuidadosamente considerados para orientar el diseño experimental. Marcadores fluorescentes de estructuras subcelulares de interés, si immunohistochemical, teñir-basada, o genético expresado deben ser distinguibles sobre fondo de morfología e intensidad. El sistema de GAL4/UAS es ...

Las enfermedades neurodegenerativas afectan a millones de personas cada año y la incidencia está aumentando con un envejecimiento población1. Mientras que cada enfermedad neurodegenerativa tiene una etiología única, agregación de proteínas mal plegadas y avería de la red proteostasis son características distintivas patológicas común de muchas de estas enfermedades. Dilucidar cómo la interrupción de estos procesos fundamentales e interrelacionados va mal contribuir a la muerte neuronal de la célula y disfunción es fundamental para entender las enfermedades neurodegenerativas, así como orientar las intervenciones terapéuticas. La proyección de imagen basada en la fluorescencia permite la investigación de estos procesos complejos y dinámicos en las neuronas y ha contribuido enormemente a nuestra comprensión de la biología de la célula neuronal. Análisis de fluorescencia de etiquetado proteínas es un reto, sobre todo cuando los experimentos se llevan a cabo en vivo, altamente compacta los tejidos, tipos de células diversas y heterogeneidad morfológica. Cuantificación manual asistida es asequible y sencillo, pero es a menudo desperdiciadora de tiempo y sujeto a sesgo humano. Por lo tanto, hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes.
Hemos esbozado un flujo de trabajo simple y adaptable con Fiji/ImageJ, un software2,3, de procesamiento de imágenes poderosas y libremente accesibles para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes de fluorescencia en modelos experimentales de neurodegeneración con Drosophila. Siguiendo este protocolo para cuantificar la agregación proteica y autofagia flujo — dos celulares características biológicas que son altamente relevantes para la patología de enfermedades neurodegenerativas, demostró la sensibilidad y la reproducibilidad de este enfoque. Análisis de fluorescencia de etiquetado huntingtina (Htt) de proteínas en el lóbulo óptico de Drosophila revelaron el número, tamaño e intensidad de agregados de proteína. Visualizamos un reportero fluorescente del tándem de autofagia flujo dentro del sistema visual de Drosophila , que muestra señales de emisión diferentes dependiendo de la compartimentación medio ambiente4. Análisis del reportero tándem radiométrica permitió una visión cuantitativa y global del flujo de la autofagia-lisosoma de autophagosome formación, maduración y transporte a la degradación en el lisosoma y además destacó vulnerable compartimientos en enfermedades neurodegenerativas. Lo importante, en ambos análisis hemos implementado pasos umbralización y segmentación semiautomáticos en nuestro protocolo para minimizar el sesgo inconsciente, aumentar el poder de toma de muestras y proporcionar un estándar para facilitar las comparaciones entre estudios similares. El flujo de trabajo sencillo pretende hacer poderosos plugins de Fiji/ImageJ (desarrollado por científicos de la computación basados en algoritmos matemáticos) más accesible a los neurobiólogos y la comunidad de Ciencias de la vida en general.

<table><tbody><tr><td>SYLGARD(R) 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>Plato de disección</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm sin tratamiento TC Estilo de fácil agarre Placa de Petri bacteriológica</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>Plato de disección</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Herramienta de disección</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>Solución</td></tr> <tr><td>PBSFosfato de sodio Dibásico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>Solución PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio Monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Solución PBS</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Solución de lavado e incubación de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Formaldehído al 37%</td><td>VWR</td><td>10790-710</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga desechables de fijación (0,5 ml, azul)</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>Fijación, lavado e incubación de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Micro portaobjetos lisos y esmerilados (25 veces; 75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>Portaobjetos para imagen confocal</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, rectangulares (22 veces; 40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>Portaobjetos para imágenes confocales</td></tr><tr><td>Caucho Cemento</td><td>Slime</td><td>1051-A</td><td>Montaje</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montaje</td> Medio <td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>Montaje</td></tr><tr><td>Scotch Magic 810 Cinta Invisible (19mm&times; 25.4m)</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>Montaje</td></tr> de <tr><td>suero de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>PCN5000 incubadora</td></tr><tr><td>de anticuerpos DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Tinción de ácidos nucleicos. Disolver en agua desionizada para hacer una solución madre de 5 mg/mL y almacenar a -80 °C. Diluir hasta una concentración de trabajo de 10 a 20 °C; g/mL en PBTx.</td></tr><tr><td>Microscopio industrial de inspección con zoom estéreo 3.5X-90X AmScope</td><td></td><td>SM-1BNZ</td><td>Visor de disección. Equipado con 6W LED Dual Gooseneck Illuminator</td></tr><tr><td>ImageJ / Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>Con SCF_MPI_CBG complementos (versión 1.1.2)</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 Microscopio de escaneo láser confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Construct</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

biología celular cuantitativa de neurodegeneración en drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con imagej

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Con la creciente prevalencia de enfermedades neurodegenerativas, es cada vez más importante comprender la fisiopatología subyacente que conduce a la pérdida y disfunción neuronal. Tecnologías y herramientas de imágenes basadas en fluorescencia permiten análisis sin precedentes de los procesos neurobiológicos subcelulares, pero todavía hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes . Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes basados en fluorescencia usando modelos de Drosophila de la neurodegeneración. Específicamente, se describe un enfoque fácil de seguir, semiautomático con Fiji/ImageJ para analizar dos procesos celulares: en primer lugar, cuantificar el contenido total de proteína y perfil en el lóbulo óptico de Drosophila mediante etiquetado fluorescente mutante proteínas huntingtina; y en segundo lugar, evaluar flujo de autofagia-lisosoma en el sistema visual de Drosophila con cuantificación basada en radiométrica de un reportero fluorescente de tándem de la autofagia. Importante, el protocolo descrito aquí incluye un paso de segmentación semiautomática para asegurar que todas las estructuras fluorescentes se analizan para reducir al mínimo el sesgo de selección y para aumentar la resolución de comparaciones sutiles. Este enfoque puede ser extendido para el análisis de otras estructuras biológicas de la célula y procesos implicados en la neurodegeneración, como proteico puncta (gránulos de estrés y complejos sinápticos), compartimentos, así como unida a la membrana (mitocondrias y vesículas tráfico de membrana). Este método proporciona un estándar, pero adaptable punto de referencia para análisis de imagen y cuantificación y podría facilitar la confiabilidad y reproducibilidad a través del campo y en última instancia, mejorar la comprensión mecanicista de la neurodegeneración.

Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de etiquetado agregados Htt mutantes en el lóbulo óptico de Drosophila , número y zona
Para investigar la agregación de proteínas mal plegadas en el sistema nervioso central de un modelo de Drosophila de la enfermedad de Huntington, etiquetado RFP mutante humano Htt con expansión patológica ( o no patológico (UAS-RFP-hHttQ15) UAS-RFP-hHttQ138) y me...

Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios biológicos celulares basado en la proyección de imagen de la fluorescencia de la agregación de la proteína y autofagia flujo en sistema nervioso central de Drosophila modelos de neurodegeneración.

Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Desarrollamos este método para extraer datos cuantitativos de estudios de imagen basados en fluorescencia para extraer procesos biológicos celulares complejos y dinámicos en modelos de neurodegeneración de Drosophila. La principal ventaja de esta técnica es su flujo de trabajo de análisis de imágenes adaptable y semiautomatizado para minimizar el sesgo de selección, maximizar la potencia de muestreo y lograr la reproducibilidad en todo el campo. Este enfoque puede extenderse al análisis de otros puntos proteicos y compartimentos unidos a membranas implicados en la neurodegeneración que, en última instancia, mejorarán nuestra comprensión mecanicista de las enfermedades neurodegenerativas.Para mantener la lámina intacta durante la disección bajo un microscopio estereoscópico, deslice dos pinzas debajo de la retina y desgarre suavemente el centro del ojo para extraer la retina. Manteniendo las pinzas paralelas a la superficie de la lámina, retire cualquier tejido retiniano restante adherido a la lámina. Diseccionar de tres a cinco cerebros para cada grupo y transferir los cerebros a un tubo de microcentrífuga que contenga un fijador apropiado durante 15 minutos a temperatura ambiente

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Investigación

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Neurociencia

Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen

Este video muestra la obtención de imágenes y la cuantificación de agregados de proteínas en cerebros de Drosophila modificados genéticamente. Los cerebros se fijan, se lavan y se tratan con un agente antidecoloración antes de montarlos. Las imágenes se capturan con un microscopio confocal y se cuantifican para observar la transmisión de los agregados de proteínas mutantes.

Imagen y cuantificación de agregados de proteínas en cerebros de Drosophila modificados genéticamente

Drosophila se utiliza ampliamente como un sistema modelo para estudiar la neurodegeneración. Este protocolo describe un método por el cual la degeneración, como se determina por la formación de vacuolas en el cerebro, se puede cuantificar. También minimiza los efectos debido al procedimiento experimental por el procesamiento y control de seccionamiento y moscas experimentales como una muestra.

La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; Drosophila</em

Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Acumulación de evidencia apoya la idea de que agregados de proteína patógena asociada a enfermedades neurodegenerativas entre células con propiedades similares a los priones. Aquí, describimos un método que permite la visualización de la propagación de célula a célula del prion-como los agregados en el organismo modelo Drosophila melanogaster.

Monitoreo de la transmisión de célula a célula de los agregados de la proteína Prion-como en Drosophila Melanogaster

El objetivo de este procedimiento es diseccionar el tejido del músculo longitudinal dorsal (DLM) para evaluar la integridad estructural de las uniones neuromusculares DLM (NMJ) en modelos de enfermedad neurodegenerativa utilizando Drosophila melanogaster.

Visualización de la degeneración sináptica en Drosophila adulta en asociación con neurodegeneración

Aquí, se describen métodos no invasivos para la localización de proteínas de membrana fotorreceptoras y la evaluación de la degeneración retiniana en el ojo compuesto de Drosophila utilizando fluorescencia eGFP.

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP

Este estudio presenta un protocolo simplificado para el procesamiento de tejidos que involucra decapitación, fijación, criosección, tinción de fluorescencia, inmunotinción e imágenes, que puede extenderse a imágenes confocales y multifotónicas. El método mantiene una eficacia comparable a las disecciones complejas, evitando la necesidad de habilidades motoras avanzadas. El análisis cuantitativo de imágenes ofrece un amplio potencial de investigación.

Criosección directa de cabezas de Drosophila para mejorar la tinción de fluorescencia cerebral y la inmunotinción

Hemos desarrollado un programa de computadora para analizar la morfología neuronal. En combinación con dos herramientas existentes de código abierto de análisis, nuestro programa realiza análisis de Sholl y determina el número de neuritas, los puntos de ramificación, y consejos de las neuritas. Los análisis se realizan para que los cambios locales en la morfología de las neuritas se puede observar.

Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas

Aprende análisis de fluorescencia imparcial en Drosophila para estudiar neurodegeneración mediante cuantificación de agregados proteicos. Este flujo de trabajo semi-automatizado mejora la reproducibilidad en investigación.

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