Name: Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprende análisis de fluorescencia imparcial en Drosophila para estudiar neurodegeneración mediante cuantificación de agregados proteicos. Este flujo de trabajo semi-automatizado mejora la reproducibilidad en investigación.

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Este trabajo es apoyado por la Sheila y David Fuente neuropático dolor investigación programa de becas de pos-grado (a J.M.B.), los Lois Pope LIFE Fellows del programa (y C.L., Y.Z., J.M.B.), la Beca Predoctoral de la Fundación Robinson Snyder (a C.L.), el Dr. John T . Macdonald Fundación (C.L.), contratos, subvenciones de los institutos nacionales de salud (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 y R56NS095893 (a R.G.Z.) y proyecto de erudito de Taishan (provincia de Shandong, República Popular de China) (a R.G.Z.).

<ol><li>Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Neurology+and+Epidemiology+of+the+Major+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671(2012).</li>
<li>Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+to+monitor+autophagy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assays to monitor autophagy in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 134-139 (2014).</li>
<li>Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+aggregation+kinetics+and+their+pathological+role+in+a+Drosophila+Huntington%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model.</a> Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).</li>
<li>DeVorkin, L., Gorski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+autophagy+in+Drosophila+using+fluorescent+reporters+in+the+UAS-GAL4+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).</li>
<li>Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22135655">Dissection of adult Drosophila brains.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3894502">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Fischbach, K. -F., Dittrich, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00218858">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).</li>
<li>Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Nmnat+functions+as+a+switch+to+enhance+neuroprotection+under+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress.</a> Nature Communications. 6, 10057(2015).</li>
<li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD+synthase+NMNAT+acts+as+a+chaperone+to+protect+against+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration.</a> Nature. 452 (7189), 887(2008).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermine+synthase+deficiency+causes+lysosomal+dysfunction+and+oxidative+stress+in+models+of+Snyder-Robinson+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome.</a> Nat Commun. 8 (1), 1257(2017).</li>
<li>Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+structure+of+synaptic+contacts+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and structure of synaptic contacts in Drosophila.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).</li>
<li>Maday, S., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosome+biogenesis+in+primary+neurons+follows+an+ordered+and+spatially+regulated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway.</a> Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).</li>
<li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li>
<li>Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+lysosomal+dysfunction+causes+cargo-specific+deficits+of+axonal+transport+leading+to+Alzheimer-like+neuritic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy.</a> Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).</li>
<li>Vincent, L., Soille, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/a381/9dda9a5f00dbb8cd3413ca7422e37a0d5794.pdf">Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).</li>
<li>Najman, L., Schmitt, M. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/546254/">Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation.</a> IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).</li>
<li>Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+and+characterization+of+intracellular+protein+aggregates+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast.</a> Prion. 8 (3), 276-284 (2014).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(10)00063-2">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí puede utilizarse para robusta y reproducible cuantificar procesos biológicos celulares visualizados por la proyección de imagen basada en fluorescencia. Contexto biológico y limitaciones técnicas necesitan ser cuidadosamente considerados para orientar el diseño experimental. Marcadores fluorescentes de estructuras subcelulares de interés, si immunohistochemical, teñir-basada, o genético expresado deben ser distinguibles sobre fondo de morfología e intensidad. El sistema de GAL4/UAS es ...

Las enfermedades neurodegenerativas afectan a millones de personas cada año y la incidencia está aumentando con un envejecimiento población1. Mientras que cada enfermedad neurodegenerativa tiene una etiología única, agregación de proteínas mal plegadas y avería de la red proteostasis son características distintivas patológicas común de muchas de estas enfermedades. Dilucidar cómo la interrupción de estos procesos fundamentales e interrelacionados va mal contribuir a la muerte neuronal de la célula y disfunción es fundamental para entender las enfermedades neurodegenerativas, así como orientar las intervenciones terapéuticas. La proyección de imagen basada en la fluorescencia permite la investigación de estos procesos complejos y dinámicos en las neuronas y ha contribuido enormemente a nuestra comprensión de la biología de la célula neuronal. Análisis de fluorescencia de etiquetado proteínas es un reto, sobre todo cuando los experimentos se llevan a cabo en vivo, altamente compacta los tejidos, tipos de células diversas y heterogeneidad morfológica. Cuantificación manual asistida es asequible y sencillo, pero es a menudo desperdiciadora de tiempo y sujeto a sesgo humano. Por lo tanto, hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes.
Hemos esbozado un flujo de trabajo simple y adaptable con Fiji/ImageJ, un software2,3, de procesamiento de imágenes poderosas y libremente accesibles para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes de fluorescencia en modelos experimentales de neurodegeneración con Drosophila. Siguiendo este protocolo para cuantificar la agregación proteica y autofagia flujo — dos celulares características biológicas que son altamente relevantes para la patología de enfermedades neurodegenerativas, demostró la sensibilidad y la reproducibilidad de este enfoque. Análisis de fluorescencia de etiquetado huntingtina (Htt) de proteínas en el lóbulo óptico de Drosophila revelaron el número, tamaño e intensidad de agregados de proteína. Visualizamos un reportero fluorescente del tándem de autofagia flujo dentro del sistema visual de Drosophila , que muestra señales de emisión diferentes dependiendo de la compartimentación medio ambiente4. Análisis del reportero tándem radiométrica permitió una visión cuantitativa y global del flujo de la autofagia-lisosoma de autophagosome formación, maduración y transporte a la degradación en el lisosoma y además destacó vulnerable compartimientos en enfermedades neurodegenerativas. Lo importante, en ambos análisis hemos implementado pasos umbralización y segmentación semiautomáticos en nuestro protocolo para minimizar el sesgo inconsciente, aumentar el poder de toma de muestras y proporcionar un estándar para facilitar las comparaciones entre estudios similares. El flujo de trabajo sencillo pretende hacer poderosos plugins de Fiji/ImageJ (desarrollado por científicos de la computación basados en algoritmos matemáticos) más accesible a los neurobiólogos y la comunidad de Ciencias de la vida en general.

<table><tbody><tr><td>SYLGARD(R) 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>Plato de disección</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm sin tratamiento TC Estilo de fácil agarre Placa de Petri bacteriológica</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>Plato de disección</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Herramienta de disección</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>Solución</td></tr> <tr><td>PBSFosfato de sodio Dibásico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>Solución PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio Monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Solución PBS</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Solución de lavado e incubación de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Formaldehído al 37%</td><td>VWR</td><td>10790-710</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga desechables de fijación (0,5 ml, azul)</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>Fijación, lavado e incubación de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Micro portaobjetos lisos y esmerilados (25 veces; 75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>Portaobjetos para imagen confocal</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, rectangulares (22 veces; 40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>Portaobjetos para imágenes confocales</td></tr><tr><td>Caucho Cemento</td><td>Slime</td><td>1051-A</td><td>Montaje</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montaje</td> Medio <td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>Montaje</td></tr><tr><td>Scotch Magic 810 Cinta Invisible (19mm&times; 25.4m)</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>Montaje</td></tr> de <tr><td>suero de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>PCN5000 incubadora</td></tr><tr><td>de anticuerpos DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Tinción de ácidos nucleicos. Disolver en agua desionizada para hacer una solución madre de 5 mg/mL y almacenar a -80 °C. Diluir hasta una concentración de trabajo de 10 a 20 °C; g/mL en PBTx.</td></tr><tr><td>Microscopio industrial de inspección con zoom estéreo 3.5X-90X AmScope</td><td></td><td>SM-1BNZ</td><td>Visor de disección. Equipado con 6W LED Dual Gooseneck Illuminator</td></tr><tr><td>ImageJ / Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>Con SCF_MPI_CBG complementos (versión 1.1.2)</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 Microscopio de escaneo láser confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Construct</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

biología celular cuantitativa de neurodegeneración en drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con imagej

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Con la creciente prevalencia de enfermedades neurodegenerativas, es cada vez más importante comprender la fisiopatología subyacente que conduce a la pérdida y disfunción neuronal. Tecnologías y herramientas de imágenes basadas en fluorescencia permiten análisis sin precedentes de los procesos neurobiológicos subcelulares, pero todavía hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes . Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes basados en fluorescencia usando modelos de Drosophila de la neurodegeneración. Específicamente, se describe un enfoque fácil de seguir, semiautomático con Fiji/ImageJ para analizar dos procesos celulares: en primer lugar, cuantificar el contenido total de proteína y perfil en el lóbulo óptico de Drosophila mediante etiquetado fluorescente mutante proteínas huntingtina; y en segundo lugar, evaluar flujo de autofagia-lisosoma en el sistema visual de Drosophila con cuantificación basada en radiométrica de un reportero fluorescente de tándem de la autofagia. Importante, el protocolo descrito aquí incluye un paso de segmentación semiautomática para asegurar que todas las estructuras fluorescentes se analizan para reducir al mínimo el sesgo de selección y para aumentar la resolución de comparaciones sutiles. Este enfoque puede ser extendido para el análisis de otras estructuras biológicas de la célula y procesos implicados en la neurodegeneración, como proteico puncta (gránulos de estrés y complejos sinápticos), compartimentos, así como unida a la membrana (mitocondrias y vesículas tráfico de membrana). Este método proporciona un estándar, pero adaptable punto de referencia para análisis de imagen y cuantificación y podría facilitar la confiabilidad y reproducibilidad a través del campo y en última instancia, mejorar la comprensión mecanicista de la neurodegeneración.

Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de etiquetado agregados Htt mutantes en el lóbulo óptico de Drosophila , número y zona
Para investigar la agregación de proteínas mal plegadas en el sistema nervioso central de un modelo de Drosophila de la enfermedad de Huntington, etiquetado RFP mutante humano Htt con expansión patológica ( o no patológico (UAS-RFP-hHttQ15) UAS-RFP-hHttQ138) y me...

Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios biológicos celulares basado en la proyección de imagen de la fluorescencia de la agregación de la proteína y autofagia flujo en sistema nervioso central de Drosophila modelos de neurodegeneración.

Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Desarrollamos este método para extraer datos cuantitativos de estudios de imagen basados en fluorescencia para extraer procesos biológicos celulares complejos y dinámicos en modelos de neurodegeneración de Drosophila. La principal ventaja de esta técnica es su flujo de trabajo de análisis de imágenes adaptable y semiautomatizado para minimizar el sesgo de selección, maximizar la potencia de muestreo y lograr la reproducibilidad en todo el campo. Este enfoque puede extenderse al análisis de otros puntos proteicos y compartimentos unidos a membranas implicados en la neurodegeneración que, en última instancia, mejorarán nuestra comprensión mecanicista de las enfermedades neurodegenerativas.Para mantener la lámina intacta durante la disección bajo un microscopio estereoscópico, deslice dos pinzas debajo de la retina y desgarre suavemente el centro del ojo para extraer la retina. Manteniendo las pinzas paralelas a la superficie de la lámina, retire cualquier tejido retiniano restante adherido a la lámina. Diseccionar de tres a cinco cerebros para cada grupo y transferir los cerebros a un tubo de microcentrífuga que contenga un fijador apropiado durante 15 minutos a temperatura ambiente con un balanceo suave.Después de tres lavados de 15 minutos con PBS más Triton X-100, o PBTx, reemplace el último lavado con el anticuerpo primario de interés diluido en PBTx con suero de cabra normal al 5% para una incubación nocturna en un mezclador de alícuotas a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, retire el exceso de anticuerpo con tres lavados de 15 minutos en PBTx e incube los cerebros en un anticuerpo secundario apropiado diluido en PBTx con suero de cabra normal al 5% durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave el cerebro tres veces, como se ha demostrado, y coloque una gota de medio de montaje entre dos piezas de cinta transparente en el centro de un portaobjetos de microscopía por muestra de tejido.Coloque los cerebros en el medio de montaje durante uno o dos minutos. Cuando los tejidos se vuelvan transparentes, utilice una pipeta para retirar con cuidado el medio de montaje de cada lado. Para obtener imágenes de los tejidos manchados, aplique una gota de medio de montaje fresco sobre los cerebros y superponga cuidadosamente las muestras con un cubreobjetos.Selle los bordes del vidrio de la cubierta con cemento de goma y seque al aire los portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, vea la muestra en el microscopio y ajuste los controles del detector de imágenes en el microscopio de fluorescencia para capturar la relación señal-ruido más alta en el rango dinámico más alto de la muestra. Una vez que se hayan optimizado los ajustes, vea una muestra de otro grupo para confirmar que los ajustes serán adecuados en todo el experimento.A continuación, se puede obtener una imagen del primer espécimen teniendo cuidado de guardar la imagen como un tipo de archivo que pueda preservar metadatos como los parámetros de adquisición y la calibración espacial. Para analizar las imágenes, abra una imagen en Fiji, seleccione Ver pila con Hyperstack en el cuadro de diálogo Opciones de importación de bioformatos y establezca el modo de color en Escala de grises. Identifique un área basada en los canales marcadores que se puede utilizar como una región de interés estandarizada en todos los especímenes utilizando la barra de desplazamiento C para ver los canales y la barra de desplazamiento Z para desplazarse por los planos focales.Para simplificar el análisis de la imagen, genere una nueva imagen que contenga los canales y los planos focales y seleccione Imagen y Duplicar. Establezca los canales y segmentos deseados y cambie el nombre del archivo para reflejar la selección. Seleccione manualmente una región de interés estandarizada utilizando una herramienta de selección basada en los criterios de selección previamente determinados.Haga clic en Analizar, Herramientas, Administrador de región de interés y Agregar para agregar la región de interés al Administrador de región de interés. A continuación, haga clic en Más y en Guardar y asigne un nombre al archivo para que refleje la región de interés. Para el preprocesamiento de las imágenes, haga clic en Procesar en filtros y seleccione un filtro adecuado.Aquí, seleccione la configuración del filtro que reduce el ruido y conserva los bordes para ayudar en la detección de las estructuras de interés durante la segmentación. Con la imagen preprocesada activa en Fiyi, haga clic en SCF, Etiquetado e H_Watershed interactivo. Desde el panel de control, ajuste la dinámica de la semilla, el umbral de intensidad y el pico de inundación para optimizar la segmentación.Cuando se hayan optimizado los resultados de la segmentación, seleccione Exportar, Regiones, Máscara y Exportar para generar una imagen binaria de los resultados de la cuenca hidrográfica. Abra la región de interés estandarizada guardada. En el Administrador de región de interés, seleccione el identificador de región de interés para limitar la extracción de características a la región de interés estandarizada de la imagen.Con la región de interés activa en la máscara de cuenca hidrográfica binaria, seleccione Analizar, Analizar partículas y Agregar al administrador para extraer las características y agregar un identificador de partícula para cada estructura delineada durante la segmentación al Administrador de región de interés. A continuación, guarde las partículas añadidas teniendo cuidado de que los identificadores no estén seleccionados y de que todas las partículas se guarden en un archivo zip. Ahora abra la imagen sin procesar preprocesada y desplácese hasta el canal utilizado para capturar las estructuras de interés.Abra las partículas obtenidas de la extracción de características y seleccione Mostrar todo en el Administrador de regiones de interés para superponer un contorno de cada partícula en la imagen. Haga clic en Analizar y establecer mediciones y defina las mediciones experimentales adecuadas. A continuación, en el Administrador de regiones de interés, seleccione Medir y copie y pegue los resultados en un programa de hoja de cálculo adecuado para la compilación y los cálculos posteriores.La cuantificación del número de agregados de huntingtina RFP segmentados semiautomáticamente desde planos focales estandarizados a través del lóbulo óptico de Drosophila revela una expresión difusa de la expansión no patógena de Huntington Q15 en la acumulación de agregados de proteínas por la expansión de Huntington Q138 causante de la enfermedad. Los perfiles de tamaño e intensidad de todos los agregados de un plano focal estandarizado de cinco lóbulos ópticos diferentes que expresan Huntington Q138 ilustran la robustez y reproducibilidad de este flujo de trabajo. Cuando los agregados están sobreexpuestos durante la adquisición de imágenes, la cuantificación del tamaño y el número de agregados es comparable a los agregados capturados con una exposición ideal.Sin embargo, la intensidad de los agregados sobreexpuestos se convierte en una función del tamaño, ya que los píxeles saturados exhiben el valor máximo de intensidad. La visualización de la intensidad de mCherry y GFP en varias estructuras relacionadas con la autofagia o Atg8 positivas revela diferencias en el reportero, donde la alta intensidad de ambos fluoróforos indica autofagosomas. Un alto mCherry y un bajo GFP indican fusión con el lisosoma, ya que el GFP se apaga en este compartimento ácido.Y, por último, un nivel bajo de mCherry refleja la degradación dentro del lisosoma. Un diagrama de dispersión generado a partir de la intensidad media del fluoróforo de cada partícula positiva mCherry Atg8 segmentada semiautomáticamente ilustra el flujo a través de la vía del lisosoma de autofagia que se puede separar en pasos discretos mediante análisis de cuadrantes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los parámetros definidos por el usuario en los pasos de análisis de imágenes dependen en gran medida de la aplicación.Por lo tanto, tenga cuidado de documentar el flujo de trabajo para garantizar la coherencia y la comparabilidad entre las muestras.

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Investigación

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Neurociencia

Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen

Este video muestra la obtención de imágenes y la cuantificación de agregados de proteínas en cerebros de Drosophila modificados genéticamente. Los cerebros se fijan, se lavan y se tratan con un agente antidecoloración antes de montarlos. Las imágenes se capturan con un microscopio confocal y se cuantifican para observar la transmisión de los agregados de proteínas mutantes.

Imagen y cuantificación de agregados de proteínas en cerebros de Drosophila modificados genéticamente

Drosophila se utiliza ampliamente como un sistema modelo para estudiar la neurodegeneración. Este protocolo describe un método por el cual la degeneración, como se determina por la formación de vacuolas en el cerebro, se puede cuantificar. También minimiza los efectos debido al procedimiento experimental por el procesamiento y control de seccionamiento y moscas experimentales como una muestra.

La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; Drosophila</em

Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Acumulación de evidencia apoya la idea de que agregados de proteína patógena asociada a enfermedades neurodegenerativas entre células con propiedades similares a los priones. Aquí, describimos un método que permite la visualización de la propagación de célula a célula del prion-como los agregados en el organismo modelo Drosophila melanogaster.

Monitoreo de la transmisión de célula a célula de los agregados de la proteína Prion-como en Drosophila Melanogaster

Este protocolo se centra en el análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica neuronal (NDAC) en Drosophila, que puede ser utilizado para estudios de morfogénesis dendríticas.

Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila

El objetivo de este procedimiento es diseccionar el tejido del músculo longitudinal dorsal (DLM) para evaluar la integridad estructural de las uniones neuromusculares DLM (NMJ) en modelos de enfermedad neurodegenerativa utilizando Drosophila melanogaster.

Visualización de la degeneración sináptica en Drosophila adulta en asociación con neurodegeneración

Aquí, se describen métodos no invasivos para la localización de proteínas de membrana fotorreceptoras y la evaluación de la degeneración retiniana en el ojo compuesto de Drosophila utilizando fluorescencia eGFP.

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP

Este estudio presenta un protocolo simplificado para el procesamiento de tejidos que involucra decapitación, fijación, criosección, tinción de fluorescencia, inmunotinción e imágenes, que puede extenderse a imágenes confocales y multifotónicas. El método mantiene una eficacia comparable a las disecciones complejas, evitando la necesidad de habilidades motoras avanzadas. El análisis cuantitativo de imágenes ofrece un amplio potencial de investigación.

Criosección directa de cabezas de Drosophila para mejorar la tinción de fluorescencia cerebral y la inmunotinción

Aprende análisis de fluorescencia imparcial en Drosophila para estudiar neurodegeneración mediante cuantificación de agregados proteicos. Este flujo de trabajo semi-automatizado mejora la reproducibilidad en investigación.

Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ (Video) | JoVE Journal

Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ

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